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• 拓扑异构酶(TopoⅡ、TopoⅣ)不但是氟喹诺酮抗菌作用的靶点，同时也是抗肿瘤药物的重要作用靶点之一。因此，转化抗菌氟喹诺酮到抗肿瘤氟喹诺酮，扩展氟喹诺酮研究的新领域，已引起人们广泛关注^[1~3]。物质定量构效关系(QSAR)^[4~11]是研究化合物分子结构与生物活性之间因果关系，揭示其间量变规律，并利用此规律估算与预测活性以及探讨作用机理等。QSAR是计算机辅助药物设计的重要手段，能够克服盲目摸索带来的巨大的人力、物力与金钱的浪费，以最少的成本直接获得高性能的新药，因此，受到广泛关注并被应用到新药研发中。李涛等^[12]基于药效团拼合原理，把氟喹诺酮、噻二唑并均三唑稠杂环及α, β-不饱和酮等3种不同结构特征的药效团相拼合，构建了18个氟喹诺酮C-3噻唑并[2, 3-b]-[1,2,4]三唑-α, β-不饱和酮衍生物，简称“氟喹诺酮三唑酮衍生物”。他们采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法对处于对数生长期的人白血病HL60细胞进行体外抗增殖活性测定，其中有些化合物呈现出良好的抑制作用。

  为了进一步探讨氟喹诺酮三唑酮衍生物影响三种抗增殖活性的结构因素，揭示可能的抗增殖作用机理，本文基于比较分子力场分析法(CoMFA)^[13~16]，建立它们对人白血病HL60细胞体外抗增殖活性pH^[12]的3D-QSAR模型，以揭示氟喹诺酮三唑酮衍生物分子周围立体场、静电场分布对pH的影响及抗增殖作用的分子机理，为设计新颖、高效氟喹诺酮三唑酮类化合物提供理论参考。

  1.   材料与方法

  1.1   氟喹诺酮三唑酮衍生物体外抗增殖活性

  李涛等^[12]基于药效团拼合原理构建的18个氟喹诺酮三唑酮衍生物分子的母体结构见图式 1，其中取代基R的结构见表 1。

  图式 1

  

  图式 1.  氟喹诺酮三唑酮衍生物分子的基本结构

  Scheme 1.  Basic structure of fluoroquinolone triazolone derivatives

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  表 1

  

  表 1  氟喹诺酮三唑酮衍生物分子结构与抗增殖活性(pH)

  Table 1.  The anti-proliferative activities (pH) of fluoroquinolone triazolone derivatives to leukemia HL60 cells

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  Compd.	R	IC50[12]	pHexp[12]	pHcal	pHerr
  1	H	30.7	4.513	4.467	0.010
  2*	4-CH3O	37.2	4.430	4.477	-0.011
  3	2-CH3O	32.5	4.488	4.517	-0.006
  4	3, 4-OCH2O-	35.4	4.451	4.541	-0.020
  5	3, 4, 5-(CH3O)3	43.8	4.359	4.183	0.040
  6	4-CH3	37.0	4.432	4.514	-0.019
  7	4-Cl	27.8	4.556	4.621	-0.014
  8	4-F	18.4	4.735	4.654	0.017
  9*	4-NO2	8.4	5.076	5.085	-0.002
  10	3-NO2	9.7	5.013	5.065	-0.010
  11	4-CO2H	2.3	5.638	5.590	0.009
  12*	4-CO2CH3	4.5	5.347	5.113	0.044
  13	3-CO2H	3.4	5.469	5.388	0.015
  14	3-CO2CH3	4.8	5.319	5.345	-0.005
  15	4-CN	10.2	4.992	5.148	-0.031
  16*	3-CN	14.6	4.836	4.963	-0.026
  17	4-SO2NH2	1.5	5.824	5.721	0.018
  18	3-SO2NH2	2.8	5.553	5.590	-0.007
  19*	2, 4-(SO2NH2)2			5.982

  他们采用MTT法测定上述化合物对HL60细胞的体外抗增殖活性，获得各个化合物对细胞的半数抑制浓度(IC₅₀，单位为μmol·dm^-3)，具体数值见表 1。根据物理化学原理，化学反应自由能变与组分的平衡浓度之间为对数关系^[17]。因此，令：

  $ \mathrm{p} H=-\log \left(\mathrm{IC}_{50} / \mathrm{mol} \cdot \mathrm{dm}^{-3}\right) $

  (1)

  pH的数值见表 1。显然pH值越大，对细胞的抑制作用越强。

  1.2   建模方法

  本文使用Tripos公司Sybylx2.1.1分子模拟软件建立CoMFA模型，同时进行3D-QSAR分析。

  1.2.1   化合物药效活性构象的确定及分子叠合

  以Sketch molecule模块构建18个氟喹诺酮三唑酮衍生物分子^[10]的初始三维结构；采用Minimize模块，对上述分子的初始三维结构进行分子力学构象优化，获取这些分子的最低能量构象。以此最低能量构象代替其药效活性构象，并用以分子叠合。

  按照3∶1原则随机将18个氟喹诺酮三唑酮衍生物分子分为训练集(含14个分子)和测试集，测试集含6个分子(为表 1中带“*”的分子)：2、9、12、16、模板分子17和新设计的分子19。所谓模板分子是指样本中生物活性最强的分子，且在分子叠合中提供公共骨架。Align database模块采用公共骨架的原子契合的叠合方式，以保证全部叠合分子取向一致，分子间相互重叠的均方根偏差最小。以对细胞抗增殖活性最强的化合物17为模板分子，由其提供的公共骨架为图式 1中除“R”以外的全部非氢原子。运用Align database模块分别对训练集、测试集中分子予以叠合，其叠合图见图 1。此图显示良好的叠合效果，所有分子均与公共骨架原子密切契合。

  图 1

  

  图 1.  训练集(a)、测试集(b)的叠合图

  Figure 1.  3 D view of all the aligned molecules in training set (a) and test set (b)

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  1.2.2   CoMFA模型的建立

  以Tripos标准力场对训练集叠合分子周围每个网格点上的立体场(Steric，St)及静电场(Electrostatic，El)予以计算场能值，用于建模。在偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)模块中，第一步用逐一剔除法(Leave-One-Out，LOO)予以交叉验证，即以pH为因变量，场能值为自变量建模，得交叉验证系数R_cv²和最佳主成分数N。要求R_cv²＞0.3的模型才具有95%的可信度以及良好的稳健性与预测能力^[18]。第二步非交叉验证的回归分析，得到非交叉验证判定系数R²、估计标准误差S_D及统计方差比F。最后采用View CoMFA模块，以三维等势图直观反映立体场和静电场对化合物pH的贡献。

  2.   结果与讨论

  2.1   pH的CoMFA模型

  基于CoMFA方法，建立氟喹诺酮三唑酮衍生物对细胞抗增殖活性pH的3D-QSAR模型见表 2，其中：n代表样本容量，n=14为训练集，n=18为总体；St.(%)、Ele.(%)分别代表立体场及静电场对pH的贡献率。

  表 2

  

  表 2  训练集与总体的CoMFA模型比较

  Table 2.  Comparison of CoMFA models between training set and population for pH

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  n	N	Rcv2	R2	F	SD	St.(%))	Ele.(%)
  14	3	0.473	0.969	104.047	0.104	58.5	41.5
  18	3	0.485	0.967	135.397	0.097	66.4	33.6

  模型质量检验如下：

  (1) 交叉验证部分：N=3，R_cv²=0.473＞0.3，表明此模型都具有很好的预测能力与稳健性，统计意义非常显著。

  (2) 非交叉验证部分：①判定系数检验：根据一般的统计标准, 若要建立一个具有良好拟合性的QSAR模型，其R²≥0.8^[19]。此模型的R²=0.969，明显优于0.8，表现出良好的相关性。判定系数R²又称为削减误差比例，说明所建模型包含了影响pH的96.9%以上因素，仅有不足3.1%属于随机因素未被揭示。因此，该模型可用于pH的估算与预测。②显著性检验：在95%显著水平下，训练集CoMFA模型的F临界值为：F_0.05(3, 10)=3.71。所建模型的F值28倍于临界值，表明此模型的统计关系显著，有95%以上的可信度。

  (3) 内部预测能力：利用训练集的3D-QSAR模型对训练集中分子的pH进行预测，以检验其内部预测能力。其pH预测值见表 1，对pH预测的平均相对误差为1.58%，与相应实验值非常吻合，表明模型呈现很好的内部预测能力。

  (4) 外部预测能力：利用训练集的3D-QSAR模型对测试集中分子的pH进行预测，以检验其外部预测能力。测试集的pH预测值见表 1，对pH预测的平均相对误差为2.08%，与相应实验值非常接近，表明模型呈现很好的外部预测能力。

  (5) 模型偶然性：表 2呈现训练集模型的R_cv²、R²与总体的R_cv²、R²，它们非常接近，再次说明训练集模型具有良好的稳健性，或然性较低。

  2.2   CoMFA等势图

  CoMFA模型的立体作用分布图中绿色区域表示该区域引入体积较大的取代基有助于提高化合物的生物活性，黄色区域表示该区域引入体积小的基团会使化合物的生物活性增强。以化合物17为模板分子的pH的三维立体场等势图见图 2(a)。在左侧苯环的4-位上方有2个较大绿色区域，其间有个黄色区域，远离2、3-位之间有个绿色区域。4-位为-SO₂NH₂、-CO₂H、-NO₂、-Cl的体积逐渐减小，pH依次为5.824、5.469、5.076、4.556，它们的抗增殖活性依次降低。

  图 2

  

  图 2.  CoMFA模型的立体场(a)与静电场(b)等势图

  Figure 2.  CoMFA contour maps (a) steric field; (b) electrostatic field

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  CoMFA模型的静电作用分布图中蓝色区域表示该区域引入正电性基团，红色区域处引入负电性取代基有助于增强化合物的生物活性。以化合物17为模板分子的pH的三维静电场等势图见图 2(b)，在左侧苯环的4-位附近及远离2-、3-、5-位有红色区域，靠近3-、4-位碳原子及指向氨基中氢原子的2个蓝色区域。4-位上有-SO₂NH₂、-CO₂H、-NO₂等基团的pH都较大，是因为其中负电性氧原子处于红色区域，电正性的S、C、N、H等原子靠近蓝色区域。例如17、11、9的pH均较大，但均依次减小。是因在红色区域的氧原子数减少，指向蓝色区域的氢原子亦减少所致。对于-CO₂H的pH强于-CO₂CH₃，是因-CO₂CH₃中电正性氢原子处于红色区域，近于电中性的甲基中碳原子位于蓝色区域，均不利于抗增殖活性。还需指出，虽然4-位为-CN、-Cl时，-CN的N原子进入黄色区域，其pH似应小于后者，而实验值为4.992、4.556。这是因为负电性的N原子进入红色区域，电正性C原子恰好靠近蓝色区域，而负电性原子也靠近蓝色区域，所以-CN的pH大于-Cl。

  一般认为立体场包含空间位阻及疏水作用。为解释酶催化反应的专一性，1894年，Fischer等提出了“锁钥”模型，即酶与底物在相互作用之前其结构就具有了互补性。可以认为酶提供的空穴形状，与底物分子空间形状能够契合，才能发生反应；否则，不能形成产物。绿色区域的大体积基团之所以抗增殖活性高，是因为此大体积基团能够与拓扑异构酶生物大分子提供的空穴在体积和形状上契合，距离较近，其间作用力强之故；小体积基团虽无空间位阻易进入，但不契合，与空穴表面基团距离较大，作用力小而易离去，致使抗增殖活性降低。而在黄色区域存在大基团之所以抗增殖活性降低，是因拓扑异构酶提供的空穴不能容纳，而产生空间位阻所致；小体积基团能够顺利进入无位阻，且与空穴契合。静电场主要为负电性O、F、N、Cl等原子上部分负电荷(δ^-)与拓扑异构酶蛋白质大分子中部分正电荷(δ⁺)间的库伦力，其次是其孤对电子与蛋白质中正电性氢形成氢键。表 2给出3D-QSAR模型的立体场贡献高于静电场。可见，影响氟喹诺酮三唑酮衍生物抗增殖活性pH的主要因素是疏水作用、空穴契合、空间位阻、库仑力及氢键。

  根据三维等势图设计分子19，3D-QSAR模型给出pH的预测值为5.982，优于化合物17的抗增殖活性。此有待生物医学实验予以验证。

  3.   结论

  (1) 基于CoMFA方法建立的氟喹诺酮三唑酮衍生物对人白血病HL60细胞抗增殖活性pH的3D-QSAR模型：R_cv²=0.473，R²=0.969，F=104.047，显示良好的相关性、稳定性和预测能力。

  (2) 所建CoMFA模型的三维等势图较好地解释了影响氟喹诺酮三唑酮衍生物抗增殖活性的主要影响因素是疏水作用、空穴契合、空间位阻、库仑力及氢键。另外，大体积基团在黄色区域有空间位阻，难进入拓扑异构酶空穴；小体积基团在绿色区域虽无位阻能进入，但不与拓扑异构酶空穴契合。因此，均不利增强氟喹诺酮三唑酮衍生物抗增殖活性。据此设计的一个新化合物显示很好的抗增殖活性，有待生物医学实验确认。

  
  
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  图式 1  氟喹诺酮三唑酮衍生物分子的基本结构

  Scheme 1  Basic structure of fluoroquinolone triazolone derivatives

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  图 1  训练集(a)、测试集(b)的叠合图

  Figure 1  3 D view of all the aligned molecules in training set (a) and test set (b)

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  图 2  CoMFA模型的立体场(a)与静电场(b)等势图

  Figure 2  CoMFA contour maps (a) steric field; (b) electrostatic field

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  表 1  氟喹诺酮三唑酮衍生物分子结构与抗增殖活性(pH)

  Table 1.  The anti-proliferative activities (pH) of fluoroquinolone triazolone derivatives to leukemia HL60 cells

  Compd.	R	IC50[12]	pHexp[12]	pHcal	pHerr
  1	H	30.7	4.513	4.467	0.010
  2*	4-CH3O	37.2	4.430	4.477	-0.011
  3	2-CH3O	32.5	4.488	4.517	-0.006
  4	3, 4-OCH2O-	35.4	4.451	4.541	-0.020
  5	3, 4, 5-(CH3O)3	43.8	4.359	4.183	0.040
  6	4-CH3	37.0	4.432	4.514	-0.019
  7	4-Cl	27.8	4.556	4.621	-0.014
  8	4-F	18.4	4.735	4.654	0.017
  9*	4-NO2	8.4	5.076	5.085	-0.002
  10	3-NO2	9.7	5.013	5.065	-0.010
  11	4-CO2H	2.3	5.638	5.590	0.009
  12*	4-CO2CH3	4.5	5.347	5.113	0.044
  13	3-CO2H	3.4	5.469	5.388	0.015
  14	3-CO2CH3	4.8	5.319	5.345	-0.005
  15	4-CN	10.2	4.992	5.148	-0.031
  16*	3-CN	14.6	4.836	4.963	-0.026
  17	4-SO2NH2	1.5	5.824	5.721	0.018
  18	3-SO2NH2	2.8	5.553	5.590	-0.007
  19*	2, 4-(SO2NH2)2			5.982

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  表 2  训练集与总体的CoMFA模型比较

  Table 2.  Comparison of CoMFA models between training set and population for pH

  n	N	Rcv2	R2	F	SD	St.(%))	Ele.(%)
  14	3	0.473	0.969	104.047	0.104	58.5	41.5
  18	3	0.485	0.967	135.397	0.097	66.4	33.6

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