English

• 0.   引言

  恶性肿瘤是世界范围内主要的公共卫生问题之一^[1]。全球每年有超过1 000万人被诊断出患有癌症，死亡率很高。现有的治疗方法如手术切除、放射疗法和化学疗法对癌症的治愈率增长具有积极的促进作用^[2]。其中，化学疗法是晚期癌症最有效的治疗方法之一。由于化学疗法是一种全身疗法，因而需要通过口服、静脉内或体腔的给药途径来实施。但随着血液循环，药物将扩散到人体绝大多数器官和组织中。这些化学治疗药物通常具有高度的细胞毒性，它们杀死肿瘤细胞的同时也会杀死正常组织的细胞，从而对患者造成不可逆转的损害和严重的副作用^[3]。尽管研究人员和临床医生已成功在癌症治疗方面取得了极大地进步，但常规癌症治疗后的多药耐药性、严重的副作用和肿瘤转移仍然是需要克服的主要障碍^[4]。因此，迫切需要研发出更有效的、侵入性更小和准确性更高的新型治疗方法。

  在癌症治疗的众多方法中，光热疗法(PTT)依靠特定波长的光照射引起热应力来选择性地实现癌细胞消融^[5-7]，其高效、微创、副作用低等优势吸引了广大研究者的关注^[8]。山东中医药大学Chen等详细讨论了光热治疗的作用机理^[9]。无机纳米材料的光热转换机理为材料吸收光辐射后产生电子振荡或晶格振动，从而将光能转化为热能。由于光热治疗的效果主要受试剂的光热转换效率的影响，因此开发具有高光热转换效率(η)的光热试剂意义重大^[10]。目前η已从初始金纳米材料的约20%改善到硫化铜纳米材料的约60%^[11-12]。金纳米棒(AuNR)是一种有效的光敏纳米材料，它具有出色的光热转换性能、表面易修饰等特点^[13]。其在近红外范围内具有很强的吸收带，已被广泛应用于光热疗法中^[14-16]。金纳米粒子尺寸和形貌可控，通过调控纳米粒子的尺寸和形状，可调控近红外(NIR)光区的吸收^[17]。然而，合成AuNR常用的表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)具有较大的细胞毒性且难以完全清除，同时表面覆盖CTAB的AuNR缺乏靶向肿瘤和载药能力，限制了其在光热治疗中的效果^[18]，因此，AuNR的表面改性至关重要。

  纳米氧化锌材料是一种广泛使用的半导体，纳米ZnO能诱导活细胞产生活性氧物种(ROS)，可触发促凋亡酶的活化，从而导致癌细胞凋亡^[19-21]。AuNR与ZnO结合形成纳米复合结构，能实现光热和光动力学联合治疗提高肿瘤抑制的效果。然而，纳米氧化锌本身生物相容性较差，需对其进行表面改性以促进其生物医学应用。介孔二氧化硅(mSiO₂)具有大的比表面积和孔体积、可调节的孔径和良好的生物相容性等特点，且具备良好的修饰改性潜力。同时，mSiO₂纳米粒子在体内和体外以较低质量浓度(小于100 μg·mL^-1)存在时无毒，且易于通过共价键和静电相互作用进行生物功能化，是优良的药物递送的纳米载体^[22-23]。mSiO₂作为药物传递系统最合适的材料之一，可以解决治疗癌症中的不足，例如耐药性癌症、癌症转移，以及药物的不良副作用^[24]。

  基于此，本研究设计了具有3层复合结构的纳米材料以构建集光热疗法、ROS治疗和药物治疗于一体的多功能癌症治疗平台。如图 1a所示，首先合成表面覆有CTAB的AuNR为光热纳米核，采用CTAB为模板，在AuNR上修饰纳米氧化锌层使材料获得具备诱导活细胞产生ROS的能力。然后以四乙氧基硅烷为硅源，逐步水解，在AuNR@ZnO纳米粒子表面生成mSiO₂壳层以改善材料的细胞毒性和生物相容性。通过异丙基甲基苯酚去除模板CTAB后负载抗癌药物阿霉素(DOX)^[25]，最终得到负载药物的DOX-AuNR@ZnO@SiO₂纳米复合材料。当用808 nm NIR激光器在1 W·cm^-2的功率下照射材料后，AuNR产生的热量可用于光热治疗，同时光热能快速促进mSiO₂中药物DOX的释放，实现化学药物治疗的目的，并且氧化锌诱导活细胞产生ROS可杀伤细胞，达到光动力学治疗的效果，从而实现这一纳米平台的三模态协同治疗。

  图 1

  

  图 1.  DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的制备示意图; 不同纳米材料的透射电子显微镜(TEM)图: (b) AuNR、(c) AuNR@ZnO、(d) AuNR@ZnO@SiO₂、(e) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; (f) AuNR@ZnO@SiO₂的TEM元素映射图; (g) AuNR@ZnO@SiO₂去模板前后的傅里叶红外谱图; (h) 不同纳米材料的紫外可见吸收光谱

  Figure 1.  Schematic diagram for preparation of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; Transmission electron microscopy (TEM) images of different nanomaterials: (b) AuNR, (c) AuNR@ZnO, (d) AuNR@ZnO@SiO₂, (e) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; (f) TEM element mapping of AuNR@ZnO@SiO₂; (g) Fourier transform infrared spectra of AuNR@ZnO@SiO₂ before and after CTAB removal; (h) UV-Vis absorption spectra of different nanomaterials

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  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  CTAB、氯金酸(HAuCl₄)、硼氢化钠、浓盐酸、抗坏血酸(AA)、六水合硝酸锌、氢氧化钠、六亚甲基四胺(HMTA)、四乙氧基硅烷(TEOS)、3-甲基-4-异丙基苯酚、乙醇、DOX、甲醇均为市售分析纯试剂，直接使用。

  材料的紫外可见吸收光谱通过Shimadzu UV-3600岛津紫外-可见分光光度计测得。采用HT-7700型透射电子显微镜及FEI Talos X2000型高分辨透射电子显微镜(HRTEM)观察纳米材料结构形貌。纳米样品分散液滴在TEM碳支持膜上干燥后观察，加速电压为120 kV，高倍电镜采用200 kV电压，电子束流密度为50 pA·cm^-2，高角度环形暗场(HAADF)成像时束斑直径为1 nm。纳米材料的水合粒径和ζ电位由ZetaPALS激光动态光散射仪测得。通过MW-GX-808激光器进行近红外激发。光热温度变化由FLIR E40热红外成像仪监测。材料的细胞毒性由酶联免疫分析测试仪联合Schärfe System系统及凯西细胞计数器测试分析。使用OLYMPUS-IX81激光扫描共聚焦显微镜进行荧光成像。流式细胞实验使用BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪测试分析^[26]。

  1.2   纳米复合材料的合成

  1.2.1   AuNR的制备

  1.2.1.1   晶种液的制备

  将0.364 g CTAB和9.75 mL超纯水加入带搅拌子的100 mL圆底烧瓶中，并将其置于恒温磁力搅拌器上，50 ℃下搅拌至澄清，后转移到恒温水浴锅于30 ℃下继续搅拌15 min。剧烈搅拌下向溶液中依次加入250 μL 0.01 mol·L^-1的氯金酸水溶液、600 μL 0.01 mol·L^-1的硼氢化钠水溶液，继续搅拌至溶液棕褐色后静置3 h。

  1.2.1.2   生长液的制备

  将3.643 6 g CTAB和95 mL超纯水加入带搅拌子的250 mL烧杯中，并将其置于恒温磁力搅拌器上，在50 ℃下搅拌至全部溶解，之后转移到30 ℃的恒温水浴锅中静置10~15 min，滴加83 μL浓盐酸，振荡10 min至混合均匀。缓慢滴加455 μL氯金酸溶液(0.11 mol·L^-1)，然后立即剧烈振荡至黄色不溶物全部溶解，再依次加入100 μL的AgNO₃溶液(0.1 mol·L^-1)和522 μL的AA溶液(0.1 mol·L^-1)，混合均匀。

  1.2.1.3   AuNR的合成

  取240 μL晶种液加入待用的生长液中，剧烈振荡1 min后将其于30 ℃的恒温水浴中避光静置12 h。之后，将含AuNR的溶液在28 ℃以10 000 r·min^-1的转速离心2次，去除上清液后将其分散到5 mL的超纯水中避光保存。

  1.2.2   AuNR@ZnO的制备

  将0.9 g CTAB和75 mL超纯水加入带搅拌子的250 mL烧杯中，并将其置于恒温磁力搅拌器上，30 ℃下搅拌至CTAB全部溶解，之后在剧烈搅拌下依次加入4.32 mL现配的AA溶液(0.10 mol·L^-1)、12.96 mL六水合硝酸锌溶液(0.08 mol·L^-1)和21.60 mL HMTA溶液(0.08 mol·L^-1)。待溶液混合均匀，向其中滴加4.5 mL前述反应得到的AuNR，剧烈搅拌10 min后取出搅拌子。转移混合液至反应釜中，置于90 ℃烘箱内反应12 h。待反应结束降至室温，将上述溶液用超纯水洗涤3次，每次以10 000 r·min^-1离心15 min，去除上清液后将其分散到5 mL的超纯水中避光保存。

  1.2.3   AuNR@ZnO@SiO₂的制备

  将0.015 g CTAB和15 mL超纯水加入带搅拌子的50 mL圆底烧瓶中，并将其置于恒温磁力搅拌器上，在26 ℃下搅拌至CTAB全部溶解，向其中滴加4.5 mL AuNR@ZnO。20 min后继续加入100 μL现配的NaOH溶液(0.2 mol·L^-1)，调pH至7~8，记为溶液A。配制体积分数20%的TEOS甲醇溶液，分3次，每次间隔30 min，共取240 μL缓慢滴加至溶液A中，继续搅拌反应1 d。待反应结束后，将上述溶液用分析乙醇离心洗涤3次，每次10 000 r·min^-1，离心15 min，去除上清液后将其分散到5 mL的分析乙醇中并避光保存。

  1.2.4   CTAB的去除

  称取0.18 g 3-甲基-4-异丙基苯酚于50 mL圆底烧瓶中，加入15 mL乙醇，搅拌30 min形成HMTA的乙醇溶液，然后取5 mL制备的AuNR@ZnO@SiO₂滴加至上述溶液中，85 ℃回流6 h。用乙醇以10 000 r·min^-1的转速离心洗涤3次后，分散于2 mL水中并避光保存。

  1.2.5   DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的制备

  取8 mg AuNR@ZnO@SiO₂纳米粒子溶解于8 mL超纯水中，在室温下将1.86 mg·mL^-1的DOX·HCl溶液缓慢滴加至上述溶液中并持续搅拌4 d，10 000 r·min^-1离心10 min后溶于4 mL超纯水并避光保存。

  2.   结果与讨论

  2.1   DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的结构

  采用TEM考察了AuNR结构和形貌，结果如图 1b所示。纳米棒长约63.2 nm、宽约15.4 nm，长径比约为4.1。生长ZnO和mSiO₂壳层后，纳米粒子粒径分布均一，粒子边界清晰，ZnO层与mSiO₂层厚度约为16.8与15.9 nm，其粒径分布统计见表 1，粒径的显著增长和清晰可见的壳层表明AuNR@ZnO@SiO₂三层结构的成功制备。图 1f的能谱(EDS)显示了纳米粒子中Au、Zn、Si、O四种元素在相应核壳中的均匀分布，也进一步证实了纳米粒子的三层结构。从ζ电位测试结果可以看出，纳米粒子的电位由AuNR@ZnO的2.82 mV变为AuNR@ZnO@SiO₂的-18.82 mV，表明mSiO₂层的成功制备。除去介孔中的CTAB后，ζ电位略微增加，变成-11.25 mV，说明CTAB的成功除去。这一点在AuNR@ZnO@SiO₂去模板前后的红外光谱(图 1g)中也得到了验证，2 976和2 871 cm^-1处的CTAB的C—H振动特征峰在AuNR@ZnO@SiO₂纳米粒子脱模板处理后基本消失，同时位于1 000~1 100 cm^-1的宽峰是季铵盐基团的C—N伸缩振动典型特征峰，其在去除模板后也基本消失，这进一步证明AuNR@ZnO@SiO₂中CTAB的除去。CTAB的除去将使得该材料的生物细胞毒性大大降低，从而更适合生物应用。mSiO₂装载DOX后，其电位值又上升至-4.74 mV，电位稍稍升高，初步表明DOX负载成功。这些纳米材料的紫外可见吸收光谱如图 1h所示，在500~600 nm处呈现一个弱的吸收峰，在800~900 nm处呈现一个强的吸收峰，分别对应AuNR的横向局部表面等离子共振吸收带和纵向局部表面等离子共振吸收带，强吸收带有利于NIR光照下实现光热转换；在包覆氧化锌后此处吸收发生蓝移，这归因于ZnO在300~500 nm处存在吸收；而包覆介孔硅后又发生红移，这是由硅壳的散射导致。同时在负载DOX后能观察到在400~500 nm处出现明显的DOX吸收峰，进一步证明DOX负载成功。

  表 1

  

  表 1  不同材料的粒径、多分散指数(PDI)和ζ电位

  Table 1.  Particle sizes, polydispersity indices (PDI), and ζ potentials of different materials

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  Material	Size / nm	PDI	ζ potential / mV
  AuNR	63.2±2.3	0.258	13.99
  AuNR@ZnO	96.8±1.7	0.867	2.82
  AuNR@ZnO@SiO2	138.5±2.5	0.118	-18.82
  AuNR@ZnO@SiO2-removing CTAB	137.1±4.0	0.245	-11.25
  DOX-AuNR@ZnO@SiO2	144.8±5.2	0.171	-4.74

  2.2   DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的光热性能

  DOX-AuNR@ZnO@SiO₂光热性能测试采用红外光热成像仪记录样品在近红外辐照下的温度变化进行研究。在室温下(25 ℃)，通过考察808 nm NIR激光器在1 W·cm^-2的功率下照射不同质量浓度(50、100、150、200和250 μg·mL^-1)DOX-AuNR@ZnO@SiO₂溶液9 min内的温度变化来研究材料的光热转换效果。如图 2a所示，当250 μg·mL^-1 DOX-AuNR@ZnO@ SiO₂的溶液连续用NIR光照射9 min后，其温度升高21.5 ℃，而pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)只升高了2.5 ℃，表明DOX-AuNR@ZnO@SiO₂具有良好的光热转换效应。

  图 2

  

  图 2.  室温下不同浓度的DOX-AuNR@ZnO@SiO₂溶液用808 nm NIR激光(1 W·cm^-2)光照的温度变化曲线; (b) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂(200 μg·mL^-1)在激光照射下的温度循环曲线; (c) 200 μg·mL^-1的DOX-AuNR@ZnO@SiO₂溶液在光照9 min后的温度冷却曲线; (d) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的光热转换的时间常数; (e) 在pH=7.4溶液中DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的光热控制药物释放曲线(808 nm, 1 W·cm^-2); (f) 材料在不同pH下有、无808 nm NIR光照射时的药物释放曲线

  Figure 2.  Temperature change curve of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ solution with different concentrations illuminated by 808 nm NIR laser (1 W·cm^-2, room temperature); (b) Temperature cycling curve of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ (200 μg·mL^-1) under laser irradiation; (c) Temperature cooling curve of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ solution (200 μg·mL^-1) after 9 min of light irradiation; (d) Time constant of photothermal conversion of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; (e) Drug controlled release curve of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ at pH 7.4 under 808 nm laser irradiation (1 W·cm^-2); (f) Drug release curves of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ with or without 808 nm light irradiation at different pH values

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  为进一步研究DOX-AuNR@ZnO@SiO₂材料的光稳定性，选择200 μg·mL^-1的DOX-AuNR@ZnO@ SiO₂，在室温下(25 ℃)用808 nm NIR激光器在1 W·cm^-2的功率下照射至上升温度稳定，关闭激光器使溶液自然冷却至室温，按此步骤重复5次。如图 2b所示，经过5次同等强度的光照后，每次材料的温度增加值几乎相等，证明材料DOX-AuNR@ZnO@SiO₂具有良好的光热循环稳定性，适合一次给药多次进行NIR光照的光热治疗。根据金纳米颗粒热传导计算方法^[27]，引入了一种无因次驱动温度θ(使用最高系统温度T_max进行缩放)和一个样本系统时间常数τ_s，使用图 2c中冷却期间记录的温度与时间数据，绘制t vs -ln θ关系图并拟合直线(图 2d)，斜率显示了传热的时间常数τ_s=175.17 s。根据公式1~5计算^[28]纳米材料DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的光热转换效率(η)为20.85%。这些实验结果证明，所制备的DOX-AuNR@ZnO@SiO₂纳米颗粒本身具有良好的光热转换效率和光稳定性，可应用到肿瘤的光热治疗中。

  $ \begin{equation} \eta=\frac{h S\left(T_{\mathrm{Max}}-T_{\mathrm{Surr}}\right)-Q_{\mathrm{S}}}{I\left(1-10^{-A_{\mathrm{808}}}\right)} \times 100 \% \end{equation} $

  (1)

  $ \begin{equation} h S=\frac{m_{\mathrm{D}} C_{\mathrm{D}}}{\tau_{\mathrm{s}}} \end{equation} $

  (2)

  $ \begin{equation} t=-\tau_{\mathrm{s}} \ln \theta \end{equation} $

  (3)

  $ \begin{equation} \theta=\frac{T-T_{\text {Surr }}}{T_{\text {Max }}-T_{\text {Surr }}} \end{equation} $

  (4)

  $ Q_{\mathrm{S}}=\frac{m_{\mathrm{D}} C_{\mathrm{D}}\left(T_{\mathrm{Max}, \mathrm{H}_2 \mathrm{O}}-T_{\mathrm{Surr}}\right)}{\tau_{\mathrm{H}_2 \mathrm{O}}} $

  (5)

  其中，h代表传热系数，S代表容器的表面积，T_Surr为周围环境温度，T_Max为样品在连续辐照下达到稳态的温度，I为激光的功率密度(1.0 W·cm^-2)，A₈₀₈为纳米样品在808 nm处的吸光度。Q_S表示溶剂(本实验中为水)在吸收808 nm激光后散发的热量。本实验中材料样品测得的平衡温度T_Max是45.8 ℃，周围环境温度T_Surr为28.6 ℃。hS值可由公式2计算所得，m_D和C_D为去离子水作为溶剂的质量和热容量(4.2 J·g^-1)，τ_s为样本系统时间常数，由公式3计算得到，其中t为从最高温度开始冷却过程中各点对应的时间值，θ值由公式4计算得到，T表示冷却过程中各时间点对应的温度。

  2.3   DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的药物负载和光热控制释放

  通过测定DOX在490 nm处的吸光度来确定药物的负载和释放率。设m₀为初始药物投入质量，m_S为上清液中药物质量，m_L为负载药物后材料的质量，则载药率(Ω)计算公式：Ω=(m₀-m_S)/m_L×100%，计算得出材料DOX-AuNR@ZnO@SiO₂中的DOX载药率为12.1%。

  为了研究光热条件下药物的释放行为，在pH=7.4的PBS中以NIR激光照射DOX-AuNR@ZnO@SiO₂后，考察溶液中的DOX浓度，绘制出释放曲线(图 2e)。材料DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在较低功率密度下经过6次光照后，DOX的释放百分比增至58%。材料于无激光照射的1 h内DOX的释放量平均约为2%，而在激光照射后DOX的释放量增加明显，这归因于AuNR吸收了来自808 nm的NIR辐射，其产生的热量促使DOX释放，表明NIR可以控制DOX的释放。

  为进一步研究DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在不同pH介质中的药物释放行为，将材料溶于pH=5.6、7.4的PBS中，测得药物释放结果如图 2f所示。无论有无NIR激光照射，在同一时间点，材料DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在pH=5.6的溶液中的DOX释放量都高于pH=7.4的溶液，这说明DOX在酸环境中更易于释放。值得注意的是，当选择在酸性PBS中进行对照实验时，在有、无NIR光照射的条件下，6 h后材料的DOX的释放量分别为74%和28%，这归因于808 nm的NIR辐射产生的热量促进DOX快速释放，说明在细胞中也可以通过NIR光控制DOX的释放。由于DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在酸性条件下的药物释放实验结果良好，预期材料在癌细胞(通常为酸性微环境)中释放药物也有良好的效果。

  2.4   DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在细胞内的释药效果

  选用HeLa细胞株研究细胞对DOX-AuNR@ ZnO@SiO₂的摄取途径。将DOX-AuNR@ZnO@SiO₂与HeLa细胞共培养2 h后，用808 nm NIR激光器在1 W·cm^-2的功率下光照10 min，随后进行激光共聚焦显微成像，结果如图 3a所示。HeLa细胞中有明显的红色荧光，这归属于DOX-AuNR@ZnO@SiO₂材料培养的HeLa细胞中DOX的发光，因此可表明在培养过后DOX-AuNR@ZnO@SiO₂进入细胞，且主要在细胞质中。

  图 3

  

  图 3.  (a) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂与HeLa细胞共培养后再光照后, 细胞的激光共聚焦显微镜图像(λ_em=550~600 nm); DOX-AuNR@ZnO@SiO₂(25 μg·mL^-1)与HeLa细胞共培养2 h后(b) 无光照、(c) 有光照, 以及光照后继续培养(d) 5 min和(e) 10 min后的细胞成像图(λ_em=550~600 nm); DOX-AuNR@ZnO@SiO₂与HeLa细胞共培养后, 再经Lysogreen染色后的细胞共聚焦成像图: (f) Lysogreen绿色通道(λ_em=520~550 nm)、(g) DOX红色发光通道(λ_em=550~600 nm)的细胞共聚焦成像图、(h) 红绿通道的叠加图; (i) Pearson共染系数图

  Figure 3.  (a) Laser confocal microscopy images of HeLa cells cultured with DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ after illumination (λ_em=550-600 nm); Confocal images of HeLa cells (λ_em=550-600 nm) cultured with DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ (25 μg·mL^-1) (b) without illumination, (c) with illumination, and after additional post-illumination culture for (d) 5 min or (e) 10 min; Confocal images of HeLa cells cultured with DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ and subsequently stained with Lysogreen: (f) green channel (λ_em=520-550 nm) for Lysogreen, (g) red channel (λ_em=550-600 nm) for DOX, (h) overlay of green and red channel; (i) Pearson′s co-staining coefficient profile

  Illumination conditions: NIR laser, 808 nm, 1 W·cm^-2, 10 min; λ_ex=488 nm for confocal microscopy images.

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  为了证明NIR光照射能够有效触发光热材料DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在癌细胞中的药物释放，选用25 μg·mL^-1的材料与HeLa细胞共培养2 h后，用808 nm NIR激光器在1 W·cm^-2的功率下照射细胞10 min，再监测接下来的0、5和10 min后细胞内的药物释放情况，通过收集细胞在488 nm激发波长下的DOX发光(通道λ_em=550~600 nm)，考察药物在细胞内释放情况。相比于未经NIR辐照的细胞(图 3b)，经10 min NIR辐照的细胞内红色发光明显增强，而进一步放置5 min(图 3d)与10 min(图 3e)后细胞内的发光强度没有进一步增加，这证明在细胞内DOX的自身释放比较缓慢，而NIR光触发可快速促进细胞内DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的药物释放，这种药物快速释放是由光热导致的纳米材料膨胀引起的，这一现象与材料在细胞外的光热控制释放一致。进一步使用溶酶体绿色染料Lysogreen进行细胞共定位实验。将2 mL DOX-AuNR@ZnO@SiO₂(25 μg·mL^-1)与培养基(2 mL)的混合液共处理HeLa细胞并在37 ℃培养2 h，之后用808 nm NIR激光器在1 W·cm^-2功率下照射10 min，用移液枪加适量PBS对育有细胞的培养皿仔细清洗后，加入LysoGreen(250 nmol·L^-1)，在37 ℃下对细胞进行染色10 min。再次对育有细胞的培养皿仔细清洗，随后进行共聚焦显微镜成像，在绿光通道观察Lysogreen的发光(λ_ex=488 nm，λ_em=520~550 nm)，在红光通道观察DOX的发光(λ_ex=488 nm，λ_em=550~600 nm)。结果如图 3f~3i所示，Lysogreen和DOX的绿色和红色发光能很好的重叠，其Pearson共染系数高达95.66%，证明了释放出的DOX主要被溶酶体摄取。

  2.5   DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在细胞内的ROS生成能力

  为考察氧化锌诱导活细胞产生ROS的能力，将HeLa细胞置于培养皿中，在含CO₂(体积分数5%)和空气的培养箱中培养24 h，再分别与同浓度的AuNR@SiO₂、AuNR@ZnO@SiO₂与DOX‑AuNR@ ZnO@SiO₂(25 μg·mL^-1)在37 ℃共培养2 h，使用DCFH-DA作为细胞内ROS指示剂，用激光共聚焦成像显微镜监测并观察在488 nm激发波长下的材料的DCFH的发光(收集通道λ_em=500~550 nm)。如图 4b所示，AuNR@ZnO@SiO₂在共聚焦显微镜下呈现出亮绿色的荧光，表明细胞内产生ROS，而AuNR@SiO₂无荧光产生(图 4a)，证明活细胞中的ROS是ZnO诱导产生的。同时，DOX-AuNR@ZnO@ SiO₂与HeLa细胞培养2 h后也观察到亮绿色的荧光，表明AuNR@ZnO@SiO₂在负载DOX后依旧可以诱导活细胞内产生ROS，可用于癌细胞的光动力学治疗。

  图 4

  

  图 4.  材料(25 μg·mL^-1)与HeLa细胞共培养2 h后用808 nm NIR激光(1 W·cm^-2)照射后, 以DCFH-DA作为细胞内ROS指示剂(绿色通道)的细胞成像: (a) AuNR@SiO₂、(b) AuNR@ZnO@SiO₂、(c) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; (d) 不同质量浓度的AuNR@SiO₂、AuNR@ZnO@SiO₂和DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在一定条件下处理HeLa细胞的细胞存活率; (e) 不同条件下处理的HeLa细胞的细胞存活率(各材料均为100 μg·mL^-1)

  Figure 4.  Cell Imaging with DCFH-DA as an intracellular ROS indicator (green channel) after 2 h co-culture of the materials (25 μg·mL^-1) with HeLa cells followed by 808 nm NIR laser irradiation (1 W·cm^-2): (a) AuNR@SiO₂, (b) AuNR@ZnO@SiO₂, (c) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; (d) Cell viability of HeLa cells treated with AuNR@SiO₂, AuNR@ZnO@SiO₂, and DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ with different mass concentrations under the specified conditions; (e) Cell viability of HeLa cells treated under different experimental conditions (all materials used at 100 μg·mL^-1)

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  2.6   DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的细胞毒性和光毒性

  通过MTT实验考察了不同浓度的AuNR@SiO₂、AuNR@ZnO@SiO₂和DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在一定条件下处理的HeLa细胞的存活率。图 4d的结果表明，75 μg·mL^-1的未负载DOX的AuNR@ZnO@SiO₂材料与HeLa细胞共培养后，细胞在避光的情况下仍有88%的存活率，这表明AuNR@ZnO@SiO₂材料的自身细胞暗毒性比较低。对比AuNR@SiO₂与AuNR@ZnO@SiO₂在无光照条件下不同质量浓度的细胞毒性可知，随着AuNR@ZnO@SiO₂质量浓度增大，细胞的存活率逐渐下降，这是由于ZnO能诱导细胞产生ROS进而杀伤活细胞。而对比AuNR@ ZnO@SiO₂有、无NIR光照条件下的细胞存活率可知，AuNR的光热转换效应对癌细胞具有较强的杀伤作用。在材料负载DOX后，其对HeLa细胞的杀伤效果达到最佳。

  进一步，我们研究了单独热疗和ZnO诱导的ROS治疗对细胞的毒性以及808 nm激光照射不同时间的DOX-AuNR@ZnO@SiO₂材料对HeLa细胞的毒性。如图 4e所示，以空白细胞组(Blank+NIR 10 min)作为对照，用AuNR@SiO₂在808 nm激光照射10 min(只有PTT)和AuNR@ZnO@SiO₂+无光照条件(只有ROS)下分别处理的细胞存活率都相对较高，分别为82%和78%。而DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在808 nm激光照射10 min后(PTT+ROS+药物)，细胞存活率急剧下降到35%，证明DOX-AuNR@ZnO@SiO₂具有优异的联合治疗效应。以上测试结果均预示着这种材料是一种集合了NIR光热、光触发的药物治疗和诱导活细胞产生ROS的光动力学治疗于一体的三模态纳米诊疗平台。

  2.7   DOX-AuNR@ZnO@SiO₂光诱导协同杀伤肿瘤细胞

  采用钙黄绿素(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)对细胞染色，然后可通过细胞共聚焦图像的绿色荧光来判断活细胞数量，其原理是利用Calcein-AM与活细胞中的酯酶的特异性的反应，使Calcein-AM脱去AM基团，从而在激光共聚焦显微镜中显示出强绿色荧光。使用Calcein-AM和PI作为指示剂，分别对不同实验组在HeLa细胞中的治疗效果进行了考察，包括空白对照组PBS+NIR 10 min、AuNR@SiO₂(材料组)、AuNR@ZnO@SiO₂(ROS组)、DOX-AuNR@ZnO@ SiO₂(药物+ROS组)、AuNR@SiO₂+NIR 10 min(PTT组)、AuNR@ZnO@SiO₂+NIR 10 min(PTT+ROS组)、DOX-AuNR@ZnO@SiO₂+NIR 4 min(三模态联合治疗组)和DOX-AuNR@ZnO@SiO₂+NIR 10 min(三模态联合治疗组)。重点考察了DOX-AuNR@ZnO@SiO₂材料在NIR激光照射不同时间下的细胞水平的光疗效果，结果如图 5所示。正如预期的那样，DOX-AuNR@ZnO@SiO₂培养和NIR光照10 min实现了光触发的光热治疗-药物治疗和ROS治疗的协同效应，导致强绿色荧光消失。如果用NIR光照4 min代替NIR光照10 min，仍有少量绿色荧光存在，这表明AuNR的光热转换效应产生的热量在未达到PTT治疗效果的情况下可促进DOX在细胞中的释放，从而显著提高化疗的治疗效果。比较没有NIR光照射的DOX-AuNR@ZnO@SiO₂和有NIR光照射的AuNR@ ZnO@SiO₂组，活细胞的绿色荧光都较强。这些结果表明，NIR光有效触发了DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的药物释放，实现了三模态光热治疗-药物治疗和ROS治疗的协同效应，能达到更好的治疗效果。

  图 5

  

  图 5.  HeLa细胞经过不同方式处理后的活细胞(绿色荧光)/死细胞(红色荧光)共染色细胞成像

  Figure 5.  Fluorescence imaging of co-stained live (green)/dead (red) HeLa cells after different treatments

  Scale bar: 20 μm; Illumination conditions: NIR laser, 808 nm, 1 W·cm^-2.

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  进一步，采用流式细胞术实验评估DOX-AuNR@ZnO@SiO₂对HeLa细胞的光触发三模态协同治疗效果，主要使用Annexin V-FITC(FITC)和PI两者染色然后通过流式细胞术计数的细胞来分析死细胞的百分比。如图 6所示，由于AuNR的光热效果，10 min NIR光照使AuNR@SiO₂对照组活细胞比例从91.8%下降到51.6%。由于ZnO可以诱导细胞产生ROS，使得AuNR@ZnO@SiO₂在无NIR光照条件下依然能导致19.3%的癌细胞凋亡；同时，AuNR@ZnO@SiO₂组于NIR光照射10 min后活细胞比例仅为12.6%，说明了光热治疗的良好效果。此外，光照4 min使DOX-AuNR@ZnO@SiO₂对照组活细胞比例从37%下降到7.67%，表明AuNR在NIR光照射4 min吸收光能转化的热量仅能快速促进DOX的释放而未达到引发PTT的效果。NIR光照10 min导致DOX-AuNR@ZnO@SiO₂处理的细胞99%以上凋亡，说明最终的DOX-AuNR@ZnO@SiO₂多功能材料有着优异的联合治疗效果。与单一疗法相比，以AuNR为核心实现光热治疗、药物治疗和ROS治疗于一体的多功能纳米治疗剂在深层肿瘤治疗方面有着更好的应用前景。

  图 6

  

  图 6.  用FITC和PI标记的不同方式处理后的HeLa细胞存活率统计图

  Figure 6.  Statistical analysis of HeLa cell viability via FITC and PI staining following different treatments

  ρ_nanomaterial=25 μg·mL^-1; Illumination conditions: NIR laser, 808 nm, 1 W·cm^-2.

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  3.   结论

  本研究将DOX负载到具有3层复合结构的新型AuNR@ZnO@SiO₂纳米粒子中，成功构建了以AuNR为核心实现PTT、ROS治疗和药物治疗于一体的多功能纳米治疗平台DOX-AuNR@ZnO@SiO₂。该纳米粒子具有3层核壳结构，粒径分布均一，分散性良好。该纳米体系中，AuNR具有良好的光热转换效应，其在808 nm NIR光辐照的光热转换效率达到20.85%，可用于光热治疗；ZnO可诱导活细胞产生ROS用于光动力学治疗；利用mSiO₂的吸附作用，DOX载药率达到12.1%，同时该体系在体外和细胞内均具备良好的NIR光热控制药物DOX释放效果，肿瘤的酸性微环境更有利于DOX的释放。细胞毒性与光毒性、激光共聚焦成像及流式细胞术实验证实DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在NIR光触发下可实现NIR光热、光控药物释放和诱导活细胞产生ROS的光动力学三模态协同治疗，可导致99%以上的细胞凋亡，为多功能纳米治疗剂的设计开发及多模态协同诊疗提供了重要的参考。

  
  
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  图 1  DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的制备示意图; 不同纳米材料的透射电子显微镜(TEM)图: (b) AuNR、(c) AuNR@ZnO、(d) AuNR@ZnO@SiO₂、(e) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; (f) AuNR@ZnO@SiO₂的TEM元素映射图; (g) AuNR@ZnO@SiO₂去模板前后的傅里叶红外谱图; (h) 不同纳米材料的紫外可见吸收光谱

  Figure 1  Schematic diagram for preparation of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; Transmission electron microscopy (TEM) images of different nanomaterials: (b) AuNR, (c) AuNR@ZnO, (d) AuNR@ZnO@SiO₂, (e) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; (f) TEM element mapping of AuNR@ZnO@SiO₂; (g) Fourier transform infrared spectra of AuNR@ZnO@SiO₂ before and after CTAB removal; (h) UV-Vis absorption spectra of different nanomaterials

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  图 2  室温下不同浓度的DOX-AuNR@ZnO@SiO₂溶液用808 nm NIR激光(1 W·cm^-2)光照的温度变化曲线; (b) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂(200 μg·mL^-1)在激光照射下的温度循环曲线; (c) 200 μg·mL^-1的DOX-AuNR@ZnO@SiO₂溶液在光照9 min后的温度冷却曲线; (d) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的光热转换的时间常数; (e) 在pH=7.4溶液中DOX-AuNR@ZnO@SiO₂的光热控制药物释放曲线(808 nm, 1 W·cm^-2); (f) 材料在不同pH下有、无808 nm NIR光照射时的药物释放曲线

  Figure 2  Temperature change curve of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ solution with different concentrations illuminated by 808 nm NIR laser (1 W·cm^-2, room temperature); (b) Temperature cycling curve of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ (200 μg·mL^-1) under laser irradiation; (c) Temperature cooling curve of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ solution (200 μg·mL^-1) after 9 min of light irradiation; (d) Time constant of photothermal conversion of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; (e) Drug controlled release curve of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ at pH 7.4 under 808 nm laser irradiation (1 W·cm^-2); (f) Drug release curves of DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ with or without 808 nm light irradiation at different pH values

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  图 3  (a) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂与HeLa细胞共培养后再光照后, 细胞的激光共聚焦显微镜图像(λ_em=550~600 nm); DOX-AuNR@ZnO@SiO₂(25 μg·mL^-1)与HeLa细胞共培养2 h后(b) 无光照、(c) 有光照, 以及光照后继续培养(d) 5 min和(e) 10 min后的细胞成像图(λ_em=550~600 nm); DOX-AuNR@ZnO@SiO₂与HeLa细胞共培养后, 再经Lysogreen染色后的细胞共聚焦成像图: (f) Lysogreen绿色通道(λ_em=520~550 nm)、(g) DOX红色发光通道(λ_em=550~600 nm)的细胞共聚焦成像图、(h) 红绿通道的叠加图; (i) Pearson共染系数图

  Figure 3  (a) Laser confocal microscopy images of HeLa cells cultured with DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ after illumination (λ_em=550-600 nm); Confocal images of HeLa cells (λ_em=550-600 nm) cultured with DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ (25 μg·mL^-1) (b) without illumination, (c) with illumination, and after additional post-illumination culture for (d) 5 min or (e) 10 min; Confocal images of HeLa cells cultured with DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ and subsequently stained with Lysogreen: (f) green channel (λ_em=520-550 nm) for Lysogreen, (g) red channel (λ_em=550-600 nm) for DOX, (h) overlay of green and red channel; (i) Pearson′s co-staining coefficient profile

  Illumination conditions: NIR laser, 808 nm, 1 W·cm^-2, 10 min; λ_ex=488 nm for confocal microscopy images.

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  图 4  材料(25 μg·mL^-1)与HeLa细胞共培养2 h后用808 nm NIR激光(1 W·cm^-2)照射后, 以DCFH-DA作为细胞内ROS指示剂(绿色通道)的细胞成像: (a) AuNR@SiO₂、(b) AuNR@ZnO@SiO₂、(c) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; (d) 不同质量浓度的AuNR@SiO₂、AuNR@ZnO@SiO₂和DOX-AuNR@ZnO@SiO₂在一定条件下处理HeLa细胞的细胞存活率; (e) 不同条件下处理的HeLa细胞的细胞存活率(各材料均为100 μg·mL^-1)

  Figure 4  Cell Imaging with DCFH-DA as an intracellular ROS indicator (green channel) after 2 h co-culture of the materials (25 μg·mL^-1) with HeLa cells followed by 808 nm NIR laser irradiation (1 W·cm^-2): (a) AuNR@SiO₂, (b) AuNR@ZnO@SiO₂, (c) DOX-AuNR@ZnO@SiO₂; (d) Cell viability of HeLa cells treated with AuNR@SiO₂, AuNR@ZnO@SiO₂, and DOX-AuNR@ZnO@SiO₂ with different mass concentrations under the specified conditions; (e) Cell viability of HeLa cells treated under different experimental conditions (all materials used at 100 μg·mL^-1)

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  图 5  HeLa细胞经过不同方式处理后的活细胞(绿色荧光)/死细胞(红色荧光)共染色细胞成像

  Figure 5  Fluorescence imaging of co-stained live (green)/dead (red) HeLa cells after different treatments

  Scale bar: 20 μm; Illumination conditions: NIR laser, 808 nm, 1 W·cm^-2.

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  图 6  用FITC和PI标记的不同方式处理后的HeLa细胞存活率统计图

  Figure 6  Statistical analysis of HeLa cell viability via FITC and PI staining following different treatments

  ρ_nanomaterial=25 μg·mL^-1; Illumination conditions: NIR laser, 808 nm, 1 W·cm^-2.

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  表 1  不同材料的粒径、多分散指数(PDI)和ζ电位

  Table 1.  Particle sizes, polydispersity indices (PDI), and ζ potentials of different materials

  Material	Size / nm	PDI	ζ potential / mV
  AuNR	63.2±2.3	0.258	13.99
  AuNR@ZnO	96.8±1.7	0.867	2.82
  AuNR@ZnO@SiO2	138.5±2.5	0.118	-18.82
  AuNR@ZnO@SiO2-removing CTAB	137.1±4.0	0.245	-11.25
  DOX-AuNR@ZnO@SiO2	144.8±5.2	0.171	-4.74

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