血栓严重威胁到人类健康，血栓病变率和由其导致的死亡率均较高[1-3]，如急性心肌梗死、急性肺栓塞、急性缺血性卒中、周围动脉闭塞、下肢深静脉血栓等疾病均与血栓相关。外科手术后，血管壁损伤、红细胞可塑性降低、血流速变缓慢、血液处于高凝状态，使得血栓发生概率大幅度增加；术后需要长时间卧床休息，容易导致血栓的发生。麻醉，特别是全麻导致术后患者更易产生血栓[4]。因此，抑制血栓形成和进行有效的溶栓治疗显得尤为迫切。
载药纳米胶束作为一种新型的药物制剂在抑制血栓方面具有明显的优势。首先，纳米粒子内部可以装载治疗药物；其次，纳米胶束比表面积大，表面的活性基团可用于连接生物活性靶向分子，从而提高对病灶的靶向性[5]。虽然载药纳米胶束成功地用于多种疾病治疗，但载体高分子和药物的协同抗凝血性能还需要做进一步的研究。
肝素(hep)是常用的抗凝药物，肝素和抗凝血酶Ⅲ特异性结合，使抗凝血酶Ⅲ的构型发生改变，暴露出活性中心，使血浆中的凝血因子Ⅱa(凝血酶)、Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa和Ⅻa等丝氨酸蛋白酶类失活，同时抑制凝血酶的产生和活性[6]。另外，肝素还可通过中和内皮细胞的表面电荷，促进血管释放组织因子途径抑制物、组织型纤溶酶原激活剂等起抗凝作用。但由于肝素相对分子质量大、电负性较高，不容易被组织细胞吸收。肝素的亲水特性使得肝素分子难以穿透上皮细胞，导致渗透性低[7]。同时，肝素分子抑制凝血过程，造成病人的失血风险[6, 8]。去氧胆酸(DOCA)作为一种常用的口服药，是一种疏水性小分子，共价连接在亲水性的肝素侧链上有利于肝素的吸收，也可以增加纳米胶束的体内循环时间，同时由于接入去氧胆酸后的空间位阻效应，使肝素的反应活性降低，减小了肝素的副作用。我们在肝素侧链接枝上去氧胆酸支链，修饰后的肝素仍然保留了抗凝血活性，且降低了病人的失血风险，减小了肝素的副作用[9]。吲哚美辛(IDM)常作为一种非类固醇类抗炎药，具有解热、镇痛及抗炎等作用，同时IDM还具有抗凝作用，通过抑制血栓素A2产生、抑制血小板聚集，进而防止血栓形成[10]。
本文合成了一种两亲性的肝素类自组装纳米胶束，随后在水相中超声进行自组装，将疏水的具有抗血栓活性的IDM包载在纳米胶束中，研究IDM与肝素联合使用的抗血栓协同作用。
AV400NMR型核磁共振波普仪(NMR，德国布鲁克仪器有限公司)、Synergy H1/HIM型酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；TecnaiG2F20S-TWIN型透射电子显微镜(TEM, 美国FEI公司)；MPT-1型动态光散射仪(DLS，英国马尔文仪器有限公司)。
肝素钠(Mw=33000，185 USP units/mg)、去氧胆酸、吲哚美辛、乙二胺、二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)购自阿拉丁试剂公司；甲酰胺、丙酮、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)购自吉林省昊迪化学试剂经销有限责任公司，以上均为分析纯试剂；CellTiter-Blue TM试剂盒购自吉林省长春市百金生物技术有限公司。
通过乙二胺法利用去氧胆酸的羧基与肝素的羧基来合成肝素-去氧胆酸(hep-DOCA, HD)。分别将DOCA(3.92 g)与DCC(3.30 g)和NHS(1.84 g)在300 mL DMF中混合。溶液在室温N2气环境下搅拌，反应5 h。反应结束后，将20 mL去离子水逐滴加入到溶液中，析出沉淀，然后抽滤，除去未反应的DCC。因为NHS溶于水，而活化的DOCA不溶于水，所以将滤液滴入到300 mL去离子水中，析出沉淀并过滤，重复洗涤3次，得到活化DOCA。将活化DOCA(4 g)溶于DMF(20 mL)中，将该溶液缓慢滴加到乙二胺(53.6 mL)中。室温反应6 h后，混合物逐滴滴加到蒸馏水中析出沉淀，重复洗涤3次以除去杂质。真空干燥后得到的白色粉末即为DOCA-NH2。在温水浴中将肝素(1.0 g)溶于甲酰胺(50 mL)中, 将DOCA-NH2(1.5 g)溶于DMF(50 mL)中。在室温下，将EDC(0.114 g)与肝素溶液混合，随后加入DOCA-NH2溶液中。所得的溶液在室温N2气环境下搅拌，反应24 h。反应结束后的混合物滴加到过量的冷丙酮中，析出沉淀，用过冷丙酮重复洗涤3次。用丙酮仔细洗涤沉淀物3次以除去过量的DOCA-NH2，然后真空干燥，得到的hep-DOCA为白色固体[11], 反应如图 1所示。核磁共振波谱仪测聚合物的分子结构：在化学位移8.0处有一个肝素羧基和胺基化的去氧胆酸共轭产生的共轭峰，证明hep-DOCA已经合成，测得它的质均相对分子质量(Mw)为35600，接枝率为20.7%。
用超声波方法制备hep-DOCA胶束。将12 mg hep-DOCA溶于30 mL去离子水中，随后超声30 min，将胶束溶液在室温下用0.45 μm孔径的注射器式过滤器过滤以除去未溶解的hep-DOCA，随后在PBS缓冲溶液中透析24 h，并在4 ℃下储存。用移液枪取20 μL滴在铜网上，室温下晾干后测TEM，载药胶束也用相同的方法制样。
通过透析方法制备载IDM的纳米胶束。分别将0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5和6 mg IDM溶在200 μL N, N-二甲基甲酰胺里，然后在室温下缓慢滴加到10 mL 0.4 g/L空白胶束里。将溶液在100 W下超声30 min，并通过0.45 μm孔尺寸的膜过滤除去未溶解的IDM，在PBS中透析24 h，并在4 ℃下储存。酶标仪测得IDM在320 nm下有1个特征吸收峰，之后将IDM溶在0.5%的吐温80溶液中测得IDM在水相中浓度与吸光度的关系。分别测不同IDM加入量时纳米胶束的包载量和负载效率。
研究IDM加入量为0.1和0.4 g/L hep-DOCA的胶束药物释放曲线。将装有10 mL载药hep-DOCA胶束的透析袋放于160 mL含有0.5%吐温80 PBS缓冲溶液中。分别在1、3、5、7、11、12、24、36、48 h时在烧杯中取出0.5 mL溶液用测酶标仪测试，同时再向烧杯中补充0.5 mL 0.5%的吐温80 PBS缓冲溶液，得到hep-DOCA载药胶束的释药曲线。
通过CellTiter-Blue TM测定评估空白胶束和载药胶束的体外细胞毒性。通过培养成纤维细胞来对其进行测试表征。将孵化下来的成纤维细胞移植在96孔板内，加入培养基，孵化24 h，随后将配置好的空白胶束和载药胶束加入到上述96孔板中。将PBS做控制组，其它组分别加入50、100、150、200 μL 0.4 g/L的空白胶束或载药胶束(载药胶束载药量为0.0913 g/L)，并加入PBS缓冲溶液保持孔板中细胞浓度一致。24 h后，向每个孔中加入20 μL CellTiter-BlueTM，并用铝箔避光孵育在37 ℃再培养2 h。然后，通过酶标仪检测560~590 nm处的OD值。细胞活性可以按照下式(1)计算。
|
$ 细胞活性/\%=\frac{\mathrm{OD}_{\text { sample }}}{\mathrm{OD}_{\text { control }}} \times 100 $ |
(1) |
式中，ODsample代表样品组的光密度值，ODcontrol代表控制组的光密度值。
为了评估血液运输过程中药物的安全性，采用新鲜兔血做了溶血试验。为了分离红细胞，首先以1000 r/min离心15 min，将上面的血浆等移除。然后，将2 mL PBS加入到下层清液中，并进一步以1500 r/min离心5 min，重复3次上述操作，获得的红细胞用于溶血实验。接着，将红细胞重悬于PBS中，稀释成体积比为50%的红细胞悬液。将0.2 mL红血细胞加入到1.0 mL不同浓度的载药胶束的PBS溶液中(0.4 g/L)。同时，分别使用1.0 mL去离子水和1.0 mL PBS代替纳米颗粒溶液作为阳性和阴性对照组。所有样品在4 ℃孵育24 h，随后以3000 r/min离心5 min以获得除去沉淀中的完整红细胞的上清液测量血红蛋白OD值。取100 μL上清液于96孔板中测OD值。
在实验中，采用凝血指数(BCI)[12]和全血凝血时间来评价载药胶束的抗凝性能。先将混有柠檬酸钠的血液中加入钙离子，用不锈钢钩浸入全血中，记录首次出现纤维的时间，即为全血凝血时间。采用兔血2 mL，配置0.2 mol/L的CaCl2溶液。准备样品，分别是PBS(不加CaCl2)、0.4 g/L肝素钠、0.4 g/L hep-DOCA和0.4 g/L的载药胶束(HD-IDM)，分别探讨它们对凝血功能的影响。将40 μL样品置于烧杯中并在37 ℃预热5 min。然后将300 μL柠檬酸全血缓慢加入药物表面，再加入50 μL 0.2 mol/L CaCl2溶液。完成后将上述样品在37 ℃孵育10 min，接下来，将25 mL蒸馏水小心地加入到烧杯中，并且在37 ℃下用台式恒温振荡器在30 r/min下振荡孵化10 min。由于未凝的红细胞不能被固定在血块中，所以用蒸馏水溶解，然后用酶标仪在541 nm处测量血红蛋白OD值(样品OD值)。将25 mL去离子水加入到200 μL柠檬酸盐全血的OD值作为空白(空白OD值)。最后，样品的BCI由以下等式(2)计算：
|
$ \mathrm{BCI} / \%=\frac{\mathrm{OD}_{\mathrm{sample}}}{\mathrm{OD}_{\mathrm{control}}} \times 100 $ |
(2) |
凝血时间由不锈钢钩测量，以兔全血做实验。记录的时刻是全血与药品接触时产生纤维的时长。制备PBS、0.4 g/L肝素钠、0.4 g/L hep-DOCA和0.4 g/L的载药胶束(HD-IDM)样品。将10 μL配置好的样品置于载玻片上，滴上180 μL全血，最后加入50 μL CaCl2溶液(0.2 mol/L)，用移液枪混合均匀，用秒表计时。手持不锈钢的钩子浸入混合物，记录首次出现丝状物的时长，作为凝血的时间。
通过血液再钙化后产生血栓的质量评估HD-IDM的抗血栓形成能力[13-14]。首先，将40 μL样品(PBS，肝素钠，hep-DOCA，HD-IDM)分别置于玻璃皿中，并在37 ℃下预热5 min。然后，将300 μL柠檬酸钠全血滴加到样品表面，然后加入50 μL 0.2 mol/L CaCl2溶液。之后将样品在37 ℃下孵育12 h后，用水洗涤，用移液管除去未形成血栓的红细胞，形成凝块血栓的重量是总重量减去培养皿的重量。
图 2A和2B是载药纳米胶束HD-IDM和空白胶束hep-DOCA的TEM照片。可以看出纳米胶束呈现圆形，且中间颜色深周边颜色浅，空白纳米胶束中没有黑点，而载药纳米胶束中有一些黑点，可能是疏水性的吲哚美辛分子颗粒。图 2C和2D为胶束放置7 d前后DLS粒径分布对比，对比图 2C和2D中红线，发现空白胶束hep-DOCA的强度由14%降到12%，DLS曲线“峰型”也由“高瘦型”变为“矮胖型”，说明7 d后空白胶束的稳定性降低；而黑线代表的载药纳米胶束HD-IDM变化不大，说明HD-IDM的稳定性比较好。如表 1所示，7 d后，载药胶束HD-IDM的粒径由143.1变为137.6 nm，PDI指数由0.122变为0.156，Zeta电势由-3.32 mV变为-3.41 mV，各参数变化不大，进一步说明载药胶束稳定性较好，而空白胶束HD粒径变化较大，且PDI值也变大，说明空白胶束的稳定性相对较差[5-6]。
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| Micelles | Z-average size/nm | PDI | Zeta potential/mV |
| On day 0:HD | 126.8±9.1 | 0.163±0.016 | -3.81±0.16 |
| On day 7:HD | 154.4±13.7 | 0.212±0.021 | -4.03±0.08 |
| On day 0:HD-IDM | 143.1±5.1 | 0.122±0.021 | -3.32±0.33 |
| On day 7:HD-IDM | 137.6±7.5 | 0.156±0.022 | -3.41±0.20 |
由图 3A可以看出，随着胶束中加入吲哚美辛的量逐渐增多，它的包载量也逐渐增加，并且在0.095 g/L左右时达到最大值并逐渐趋于平稳。负载效率是在0.02~0.1 g/L时呈现出上升的趋势，可能是由于吲哚美辛和胶束之间存在疏水相互作用，使得随着吲哚美辛含量的增加，二者之间的作用力也在逐渐增加，当吲哚美辛的浓度达到0.1 g/L时，二者之间的相互作用力达到平衡状态；在0.1 g/L之后呈现出降低的趋势，可能由于胶束和吲哚美辛二者之间作用力达到平衡，胶束对吲哚美辛的负载量趋于一个稳定的数值，所以负载效率不断的降低。在吲哚美辛加入量为0.1 g/L时负载效率达到最大值81.64%，而载药量为0.0816 g/L，趋近能够负载的最大载药量，当吲哚美辛加入量为0.4 g/L时，载药量为0.0913 g/L。图 3B表明，随着时间的增加，载药胶束释放出吲哚美辛的量逐渐增加，在前12 h，吲哚美辛释放量增加比较迅速，大约释放72%，之后逐渐趋于平稳，并最终稳定在75%左右。
图 4分别是纳米胶束细胞活性和溶血率的检测。图 4A可以看出，随着空白纳米胶束浓度的增加，细胞活性逐渐降低，当胶束浓度达到0.4 g/L时细胞存活率为95.16%，说明空白胶束对细胞影响较小，而载药纳米胶束的细胞毒性略大于空白纳米胶束，当载药胶束浓度为0.4 g/L，载药量为0.0913 g/L时，细胞存活率为92.81%，hep-DOCA和HD-IDM纳米胶束在0.4 g/L时，它们的细胞活性均大于90%，说明对细胞毒性较小。由图 4B可以看出，载药纳米胶束使红细胞产生轻微溶血，溶血率为0.83%，远低于安全值5%，所以在安全范围之内，以上结果证明材料是安全的[13-14]。
BCI是指测试样品表面在与全血接触一定时间后其水溶液在541 nm处的OD值(血红蛋白的特征吸收峰位置的吸光度值)与全血加去离子水完全溶解的水溶液在541 nm处的OD值之比。BCI值越大意味着溶解的血红蛋白越多，凝血功能越弱，药物的抗凝能力越强。如果机体发生了凝血过程，就会导致纤维蛋白原变成凝血不溶性的纤维蛋白。图 5A显示，肝素钠、hep-DOCA和HD-IDM的BCI指数分别为86.48%、77.47%和89.53%，说明载药胶束HD-IDM具有更好的抗凝效果。由于肝素接上的疏水性小分子，使得hep-DOCA的抗凝效果降低。从图 5B中可以看出，加入药物和CaCl2后凝血时间分别为585、927、837和965 s，观察到只加PBS的全血在585 s时就已经发生凝血现象，只加肝素的则在927 s时发生凝血，制备成空白纳米胶束后，凝血时间显著降低，降低了肝素的出血风险[8]；空白胶束包载吲哚美辛后，分别从两种途径实现抗凝效果，一是肝素能够同时抑制凝血酶的产生和活性；二是吲哚美辛能抑制血栓素A2产生、抑制血小板聚集，从而发挥抗凝作用，所以载药纳米胶束HD-IDM具有最好的抗凝效果。它们三者抗凝效果为HD-IDM最好，heparin sodium次之，hep-DOCA最差。
将样品在37 ℃下孵育12 h后，PBS，肝素钠，hep-DOCA和HD-IDM形成的血栓重量分别为0.02、0.11、0.20和0.07 g，如图 6所示，表明了载药纳米胶束HD-IDM具有更好的抗凝作用，且抗凝效果HD-IDM最好，heparin sodium次之，hep-DOCA最差。
通过两亲性的肝素类聚合物，在水相中包载具有抗凝作用的吲哚美辛，制备一种具有更好抗凝血效果的纳米胶束。该纳米胶束具有较低的细胞毒性和溶血率。通过抗凝实验发现肝素类载药大分子和吲哚美辛的联合使用具有协同抗凝作用。这可能是由于二者分别阻断了凝血过程的两个途径：肝素作为一种抗凝药物，能够同时抑制凝血酶的产生和活性；吲哚美辛抑制血栓素A2产生、减少血小板聚集，防止抑制血栓形成。包载吲哚美辛的肝素类纳米胶束有望在临床中得到进一步应用。
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图 1 两步法制备hep-DOCA的示意图(A)；hep-DOCA的核磁谱图(B)
Figure 1 Schematic illustration of hep-DOCA preparation through two-step reactions(A); 1H NMR spectrum of hep-DOCA in D2O(B)
图 2 载药纳米胶束HD-IDM(A)和空白胶束hep-DOCA(B)透射电子显微镜照片及其开始时(C)和第7 d(D)25 ℃下纳米胶束动态光散射粒径分布曲线
Figure 2 TEM images of HD-IDM micelles(A) and blank micelles(B) and their size distribution measured by dynamic light scattering at 25 ℃ on day 0(C) and on day 7(D)
图 3 载药胶束载药量和负载效率关系图(A)和吲哚美辛的累积释放曲线(B)
Figure 3 Relationship between drug loading capacity and drug content of drug-loaded micelles(A) and accumulative release curve of indomethacin(B)
图 4 不同浓度下空白胶束和载药纳米胶束的细胞活性实验(A)；不同浓度下载药胶束的溶血实验(B)；PBS和水分别作为正负对照组
Figure 4 Cytotoxicity and hemocompatibility of the HD-IDM micelles at various concentrations. (A)The cytotoxicity of the samples on L929 cells detected by CellTiter-BlueTM assay after incubation for 24 and no significant difference was observed. (B)The hemocompatibility of the samples tested on mouse red blood cells. PBS and water was set as negative and positive control respectively. All data were represented as mean±standard deviation(SD)(n=3)
图 5 相同条件下，不同药物的抗凝血指数(BCI)(A)和全血凝血时间(B)
Figure 5 The blood clotting index(BCI)(A) and total blood-clotting time(B) of different drugs under the same conditions
图 6 全血与样品作用12 h后在培养皿中血栓形成的重量图。1-4分别加入了PBS缓冲液、肝素钠、hep-DOCA和HD-IDM。底部是全血与样品作用12 h后形成血栓的重量
Figure 6 The weight of thrombus formed in the culture dish after 12 hours. (1)PBS, (2)heparin sodium, (3)hep-DOCA, (4)HD-IDM. The weight of thrombus is marked at the bottom of each Figure
表 1 开始时和第7 d时载药纳米胶束HD-IDM和空白胶束HD粒径、多分散系数和Zeta电势
Table 1. The hydrodynamic size, PDI and zeta potential of HD-IDM and HD micelles on day 0 and day 7 after preparation
| Micelles | Z-average size/nm | PDI | Zeta potential/mV |
| On day 0:HD | 126.8±9.1 | 0.163±0.016 | -3.81±0.16 |
| On day 7:HD | 154.4±13.7 | 0.212±0.021 | -4.03±0.08 |
| On day 0:HD-IDM | 143.1±5.1 | 0.122±0.021 | -3.32±0.33 |
| On day 7:HD-IDM | 137.6±7.5 | 0.156±0.022 | -3.41±0.20 |
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