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• 基质金属蛋白酶(MMPs)是一类可降解细胞外基质的蛋白水解酶，在恶性肿瘤的生长、侵袭、转移和血管生成过程中起着非常重要的作用^[1]。MMPs目前已经成为一类可靠的、有价值的肿瘤生物标志物，广泛用于肿瘤的早期诊断与鉴定研究^[2~7]。金纳米棒(GNRs)作为一种贵金属纳米粒子，由于其独特的表面等离子共振(SPR)特性及光热效应，被广泛应用于生物传感、医学诊疗以及生物医学成像等研究领域^[8~12]。然而，由于GNRs表面官能团单一、生物毒性强、比表面积小等缺陷，限制了其在生物医学的应用范围^{[13, 14]}。聚乙二醇(PEG)因可在纳米粒子表面形成空间位阻而阻碍蛋白质等生物分子的非特异性吸附，已成为GNRs应用研究中最理想的表面修饰剂^{[15, 16]}。同时，有文献报道当荧光分子被吸附或偶联于金属纳米粒子表面后，会引起染料显著的荧光猝灭效应^{[17, 18]}。基于该特性近年来已有大量荧光“点亮型”探针被构建应用于生物传感、检测和生物成像研究。本文以生物相容性GNRs为载体，通过将异硫氰酸荧光素(FITC)标记的基质金属蛋白酶-2特异性识别的多肽底物经表面修饰PEG分子偶联于GNRs，成功制备得到一种新的MMP-2特异性响应的纳米分子探针GNR@FITC(如图 1所示)，系统考察了其体外对MMP-2蛋白酶的特异性和检测灵敏度，并成功开展了MMP-2过表达肿瘤细胞的成像研究。该探针在MMP-2过表达肿瘤细胞的体外快速、准确诊断方面表现出极大的应用潜力。

  图 1

  

  图 1.  GNR@FITC对MMP-2酶的特异性检测

  Figure 1.  Specific detection of MMP-2 using probe GNR@FITC

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  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  叠氮丙胺(梯希爱化成工业发展有限公司)；三乙胺(TEA，上海泰坦科技股份有限公司)；GPLGVRGY-Pra多肽(上海吉尔生有限公司)；无水硫酸铜(上海凌峰化学试剂有限公司)；硼氢化钠、氯金酸、硝酸银(上海国药集团化学试剂有限公司)；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，购于美国西格玛奥德里奇公司)；抗坏血酸(上海阿法埃莎化学有限公司)；聚乙二醇(mPEG-SH和HOOC-PEG-SH，MW=5kDa，北京键凯科技股份有限公司)；异硫氰酸荧光素(FITC-NCS)、抗坏血酸钠、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(Sulfo-NHS)和二硫苏糖醇(DTT)均购自上海阿拉丁试剂有限公司；伊洛马司他(GM6001，美国MCE公司)；牛血清蛋白(BSA，上海国药集团化学试剂有限公司)；弗林蛋白酶(Furin，美国New England Biolab公司)；胰蛋白酶(Trypsin，美国Gibco公司)；重组基质金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9，美国R&D Systems公司)；RPMI 1640培养基、胎牛血清、青/链霉素抗生素(自美国HyClone公司)；3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基)-2, 5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝(MTT，上海碧云天公司)；Hoechst 33342(美国BD Biosciences公司)；鼠成纤维细胞NIH/3T3和小鼠乳腺癌细胞4T1均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

  安捷伦1260高效液相色谱仪；布鲁克Q-TOF3飞行时间质谱仪；布鲁克ultrafleXtreme基质辅助激光解析飞行时间质谱仪；岛津UV-3600紫外分光光度计；马尔文Nano ZS90粒径电位仪；爱丁堡FLS980荧光光谱仪；FEI Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜；Thermo ELEMENT 2电感耦合等离子体高分辨质谱仪；珀金埃尔默EnSpire酶标仪；珀金埃尔默IVIS^®小动物活体成像系统；奥林巴斯FV1200激光共聚焦显微镜。

  1.2   GPLGVRGY-FITC的合成、纯化和表征

  GPLGVRGY-FITC的合成路线见图式 1。将4.8mg (0.048mmol)叠氮丙胺和4.9mg (0.048mmol)TEA分别滴加至14mg (0.036mmol)FITC-NCS的1mL DMF溶液中，室温避光搅拌反应。HPLC跟踪反应结束后，经真空浓缩和柱层析分离纯化后得到叠氮异硫氰酸荧光素(FITC-N₃)。黄色粉末，¹H NMR(600MHz，DMSO-d₆) δ：9.92(s，1H)，8.16(s，1H)，8.13(s，1H)，7.70(s，1H)，7.15(d，J=12Hz，1H)，6.64(s，2H)，6.58(s，1H)，6.56(s，1H)，6.54(s，1H)，6.52(s，1H)，3.55(s，2H)，3.41~3.37(m，2H)，1.84~1.79(m，2H)；¹³C NMR(151MHz，DMSO-d₆)δ：181.20，168.90，159.96，152.37，147.62，141.77，130.13，129.37，126.98，124.43，117.27，113.05，110.26，102.71，49.04，40.91，28.21；HR-MS(ESI)m/z，C₂₄H₂₀N₅O₅S，实验值(计算值)：490.1175(490.1185) [M+H]⁺。

  图式 1

  

  图式 1.  GPLGVRGY-FITC的合成路线

  Scheme 1.  The synthetic route of GPLGVRGY-FITC

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  将7.3mg(0.015mmol) FITC-N₃和10.9mg (0.012 mmol) GPLGVRGY-Pra在0.96 mg，0.006 mmol)无水硫酸铜和2.4mg (0.012mmol)抗坏血酸钠催化作用下通过“点击”化学反应合成得到GPLGVRGY-FITC，并经HPLC纯化和质谱表征确认结构。黄色固体，MALDI-TOF-MS m/z：C₆₆H₈₄N₁₈O₁₅S，实验值(计算值)：1400.563 (1400.608) [M]⁺。

  1.3   金纳米棒的合成与表征

  GNRs按照文献方法制备^[19]。将0.6mL 0.01mol/L NaBH₄冰水溶液加入到0.25mL 0.01mol/L HAuCl₄和9.75mL 0.1mol/L CTAB混合溶液中，剧烈搅拌5min后停止反应，生成褐黄色种子溶液，将其保持在30℃水浴中静置备用。将5mL 0.01mol/L HAuCl₄、95mL 0.1mol/L CTAB和0.95mL 0.01mol/L AgNO₃混合，随后加入0.25mL 1.0mol/L的盐酸和0.55mL 0.1mol/L抗坏血酸溶液，还原使溶液慢慢褪色至无色，最后加入0.25mL备用金种溶液，搅拌1min后30℃静置反应4~6 h，溶液变为酒红色。反应结束后，9500r/min下离心(25min×2)后洗涤纯化，洗后用超纯水再分散备用，用ICP-MS标定好浓度，记为GNR。通过动态光散射(DLS)、Zeta电位、UV-Vis和TEM对合成的GNRs性质和形貌进行表征。

  1.4   GNR@FITC的制备

  由于CTAB具有一定的生物毒性，需要对GNRs进行修饰以提高其生物相容性。制备得到的GNRs表面被阳离子表面活性剂CTAB修饰，如果直接修饰负电性的HOOC-PEG-SH往往容易导致GNRs团聚，故采用分步修饰的策略，先在GNRs表面修饰一定量电中性的mPEG-SH，再进一步修饰HOOC-PEG-SH，便可以得到稳定性较好的GNRs溶液。具体制备方法为：1.0mL 80μg/mL GNRs溶液中加入mPEG-SH(MW=5kDa，5mg，0.5mL)，超声10min后，再加入HOOC-PEG-SH(MW=5kDa，5mg，0.5mL)，超声10min，室温避光搅拌8h。反应结束后，14000r/min下离心(25min×2)后洗涤纯化，洗后再用Tris缓冲液(pH=7.4，1.0mL)分散备用，记为GNR@COOH。利用DLS、Zeta电位、UV-Vis和TEM对修饰后的GNRs性质和形貌进行表征。

  上述PEG修饰的GNRs(80μg/mL，1.0mL)溶液中加入4.8mg (0.025mmol) EDC和12mg(0.055mmol) Sulfo-NHS活化15min，14000r/min离心10min去掉多余的EDC和Sulfo-NHS，再加入200μL PBS(pH=7.4)分散。后加入1.0mL(80mg/mL) GPLGVRGY-FITC的DMSO溶液，室温避光搅拌4h。反应结束后，14000r/min离心10min并用超纯水洗涤纯化3次，洗后用超纯水分散备用。通过DLS、Zeta电位、UV-Vis和TEM对反应后的GNRs性质和形貌进行表征。

  将80μg/mL GNR@FITC与10mmol/L DTT于37℃孵育1h后，测溶液的紫外吸收，与FITC标准溶液的紫外吸收曲线比对计算每个GNR表面修饰的GPLGVRGY-FITC的个数。

  1.5   体外研究探针对MMP-2检测的特异性和灵敏度

  为了研究探针对MMP-2检测的灵敏度，将GNR@FITC(250μg/mL)在37℃下与不同浓度的MMP-2(0，20，40，80，160，320 ng/mL)以及相同浓度MMP-2(320ng/mL)与不同浓度GNR@FITC(0，50，100，150，200，250 μg/mL)在PBS溶液(pH=7.4)中孵育2h，然后利用荧光光谱仪检测溶液的荧光信号变化(激发波长为495nm，发射范围为500~600 nm)。为进一步研究探针的特异性，在有/无MMP-2抑制剂GM6001(5mg/mL)存在的条件下，探针(250μg/mL)和MMP-2(320ng/mL)分别在37℃下孵育2h。同时，在相同条件下，探针还分别与BSA、Furin、Trypsin、MMP-9和MMP-2在37℃下孵育2h，对应溶液的荧光强度最终经荧光光谱仪测定。

  1.6   细胞成像

  小鼠乳腺癌细胞4T1与不同浓度的探针(0，1.5，3，6，12，24，48，96，192μg/mL)在5% CO₂和37℃下孵育24h后，加入0.5mg/mL噻唑蓝，用MTT实验对探针的细胞毒性进行评估。鼠成纤维细胞NIH/3T3和小鼠乳腺癌细胞4T1分别与50μg/mL探针于5% CO₂、37℃下孵育8h，利用激光共聚焦显微镜记录细胞荧光成像情况。此外，小鼠乳腺癌细胞4T1中分别加入50μg/mL探针和5mg/mL MMP-2抑制剂GM6001开展竞争实验研究。

  2.   结果与讨论

  2.1   探针的设计、纯化与表征

  首先，FITC-N₃经过FITC-NCS与叠氮丙胺反应制备而成。经柱层析纯化后，最终由核磁共振氢谱、碳谱和高分辨质谱进一步确认。FITC-N₃在Cu(I)的催化下与末端炔修饰的MMP-2多肽底物(GPLGVRGY)发生“点击”化学反应，制备得到GPLGVRGY-FITC，其HPLC谱见图 2(a)。

  图 2

  

  图 2.  (a) GPLGVRGY-FITC的HPLC图谱；(b)GNR、GNR@COOH和GNR@FITC的紫外吸收和照片(1，2和3)；(c) GNR、GNR@COOH和GNR@FITC的TEM照片

  Figure 2.  (a) The HPLC profile of GPLGVRGY-FITC; (b) UV-Vis absorption spectrum and photo of GNR, GNR@COOH and GNR@FITC; (c) TEM photos of GNR, GNR@COOH and GNR@FITC

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  GNRs主要通过种子合成法制备而得，在水溶液中其呈现均一、稳定的酒红色。由于GNRs的表面被阳离子表面活性剂CTAB包覆，故其表面呈正电荷，Zeta电位为4±3 mV；通过使用mPEG-SH取代掉CTAB得到PEG修饰的GNRs，其能够防止自聚集并且增强GNRs的生物相容性和稳定性。GNRs进一步修饰HOOC-PEG-SH后，溶液的颜色将由酒红色变成淡紫色，相应的Zeta电位变为-25±2 mV，表明HOOC-PEG-SH成功修饰于GNRs表面。最后，多肽分子GPLGVRGY-FITC在EDC和Sulfo-NHS的作用下通过与COOH基团反应修饰于GNRs表面。溶液颜色呈深紫色，Zeta电位升至-5±2 mV，表明GPLGVRGY-FITC被成功地修饰于GNRs表面，制备得到探针GNR@FITC。

  如图 2(b)所示，紫外可见吸收光谱显示，三种金棒均表现出相似的等离子共振吸收峰，在520nm和730nm存在2个最大吸收峰，修饰了PEG后的GNRs吸收峰略有蓝移^[20]。表 1数据显示，PEG修饰的GNRs较裸GNRs的水合粒径略有增大，且TEM结果显示(如图 2(c))，GNRs颗粒大小均一，分散性较好，尺寸大小变化较小，平均长宽分别约为54.3±8.2nm，16.6±4.5nm，平均长径比为3.3。此外，经过修饰的GNRs仍保留较强的吸收峰形和强烈的纵向等离子体吸收带，说明GNRs具有较好的稳定性。

  表 1

  

  表 1  GNR，GNR@COOH和GNR@FITC的Zeta电位和水合粒径

  Table 1.  Zeta potential and hydrodynamic diameter of GNR, GNR@COOH and GNR@FITC

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  纳米金棒	Zeta电位/mV	水合粒径/nm
  GNR	4 ± 3	70 ± 3
  GNR@COOH	-25 ± 2	82 ± 2
  GNR@FITC	-5 ± 2	86 ± 5

  通过比较GNR@COOH的归一化紫外吸收光谱与GPLGVRGY-FITC的归一化荧光发射光谱，发现两者有一定程度的重叠，通过计算可知，该光谱重叠部分积分面积为6.74×10^-14cm³·L·mol^-1，以此算出福斯特半径(R₀)为4.78nm，R₀的计算公式为：R₀=[8.79×10^-25·κ²·n^-4·Q_D·J(λ)]^1/6(式中J(λ)为光谱重叠积分；κ²为偶极子定向因子，一般取值为2/3；n为溶剂的折光率，取值为1.33；Q_D为FITC的荧光量子产率，取值为0.95)。此外，测得GNR@FITC与DTT孵育后上清溶液的紫外吸收，与FITC的标准紫外吸收曲线比对，可以计算得出水溶液中GPLGVRGY-FITC的浓度，进而推算出FITC的含量，再结合所使用GNRs的浓度和质量，便可以推算出每个GNR表面大约修饰了1160个GPLGVRGY-FITC分子。

  2.2   探针对MMP-2的灵敏度和特异性研究

  如图 3(a)显示，相同浓度GNR@FITC(250μg/mL)的荧光强度会随着MMP-2用量的增加呈线性增强，根据公式：最低检测限=3σ/S(σ为平行测量11次对照溶液荧光强度的标准偏差；S为不同量MMP-2对应探针溶液荧光强度曲线的斜率)计算出最低检测限可达1.28ng/mL，表明探针对MMP-2具有较强的检测灵敏度。当固定MMP-2浓度(320ng/mL)时，溶液的荧光强度会随着探针浓度的增加而增强，探针浓度达到200μg/mL后荧光强度增强平缓(如图 3(c)和3(d))，表明MMP-2的酶切活性达到最大。

  图 3

  

  图 3.  a) 相同探针在不同浓度MMP-2作用下的荧光光谱和荧光强度；(b)探针自身、探针与MMP-2及抑制剂竞争实验的荧光强度变化；相同MMP-2与不同浓度探针作用的荧光光谱(c)和荧光强度(d)；(e)探针对MMP-2的特异性和选择性研究；(f)探针对4T1细胞的毒性研究

  探针浓度250μg/mL，MMP-2浓度320ng/mL，抑制剂浓度5mg/mL

  Figure 3.  (a) Fluorescene spectrum and intensity of GNR@FITC with various concentrations of MMP-2; (b) Fluorescent intensity of indicated amount of probes after incubation with MMP-2 and inhibitor, respectively; Fluorescene spectrum (c) and intensity (d) of MMP-2 with various concentrations of GNR@FITC; (e) Fluorescence enhancement ratio of probes after incubation with different proteins; (f) Cytotoxicity of probe to 4T1 cells

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  随后，进一步开展了探针对MMP-2的特异性研究。如图 3(b)，当探针与MMP-2作用后，在518nm溶液的荧光强度较探针自身背景有显著的增强，增强高达68倍，而预先加了抑制剂的荧光强度则明显被抑制，仅增加32倍，证明探针对MMP-2具有一定的特异性。此外，为进一步评估探针的选择性，将相同浓度探针与不同种类相同量的生物酶(如BSA、Furin、Trypsin、MMP-9、MMP-2)作用后，通过荧光光谱仪跟踪检测溶液的荧光强度。如图 3(e)，仅与MMP-2作用后，溶液在518nm有较强的荧光信号增长，而其他酶荧光增强较小。总之，上述实验结果表明，探针对MMP-2具有较好的特异性和较高的检测灵敏度，能够潜在地应用于MMP-2酶的活性检测。

  2.3   小鼠乳腺癌细胞4T1成像

  首先，以4T1细胞为研究对象，通过MTT实验对探针的细胞毒性进行了评价。如图 3(f)显示，探针与4T1细胞孵育24h后，当探针浓度低于96μg/mL时，细胞保持80%以上的存活率，表明探针对4T1细胞的毒性很小，具有较好的生物相容性，适合于肿瘤细胞荧光成像。

  随后，进一步开展了肿瘤细胞的成像研究。小鼠成纤维细胞NIH/3T3和4T1分别与探针孵育8h后，利用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像。如图 4所示，4T1细胞表现出较强的绿色荧光信号，且荧光信号能够被MMP-2抑制剂有效地抑制，而NIH/3T3细胞则仅有微弱的荧光信号被检测到，表明探针能够用于MMP-2过表达肿瘤细胞的特异性和灵敏性成像。

  图 4

  

  图 4.  细胞成像研究

  NIH/3T3+探针；4T1+探针；4T1+抑制剂+探针。探针浓度50μg/mL，抑制剂浓度5mg/mL，比例尺=20μm

  Figure 4.  Cell imaging study

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  3.   结论

  本文基于金纳米棒和基质金属蛋白酶MMP-2特异性识别多肽底物，设计和构建了一种新的MMP-2特异性响应型FRET荧光分子探针。该探针在体外对MMP-2表现出较强的特异性和检测灵敏度，能够成功地应用于MMP-2过表达肿瘤细胞的成像，为临床肿瘤的较早期、快速准确诊断提供了重要方法和依据。

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  图 1  GNR@FITC对MMP-2酶的特异性检测

  Figure 1  Specific detection of MMP-2 using probe GNR@FITC

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  图式 1  GPLGVRGY-FITC的合成路线

  Scheme 1  The synthetic route of GPLGVRGY-FITC

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  图 2  (a) GPLGVRGY-FITC的HPLC图谱；(b)GNR、GNR@COOH和GNR@FITC的紫外吸收和照片(1，2和3)；(c) GNR、GNR@COOH和GNR@FITC的TEM照片

  Figure 2  (a) The HPLC profile of GPLGVRGY-FITC; (b) UV-Vis absorption spectrum and photo of GNR, GNR@COOH and GNR@FITC; (c) TEM photos of GNR, GNR@COOH and GNR@FITC

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  图 3  a) 相同探针在不同浓度MMP-2作用下的荧光光谱和荧光强度；(b)探针自身、探针与MMP-2及抑制剂竞争实验的荧光强度变化；相同MMP-2与不同浓度探针作用的荧光光谱(c)和荧光强度(d)；(e)探针对MMP-2的特异性和选择性研究；(f)探针对4T1细胞的毒性研究

  Figure 3  (a) Fluorescene spectrum and intensity of GNR@FITC with various concentrations of MMP-2; (b) Fluorescent intensity of indicated amount of probes after incubation with MMP-2 and inhibitor, respectively; Fluorescene spectrum (c) and intensity (d) of MMP-2 with various concentrations of GNR@FITC; (e) Fluorescence enhancement ratio of probes after incubation with different proteins; (f) Cytotoxicity of probe to 4T1 cells

  探针浓度250μg/mL，MMP-2浓度320ng/mL，抑制剂浓度5mg/mL

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  图 4  细胞成像研究

  Figure 4  Cell imaging study

  NIH/3T3+探针；4T1+探针；4T1+抑制剂+探针。探针浓度50μg/mL，抑制剂浓度5mg/mL，比例尺=20μm

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  表 1  GNR，GNR@COOH和GNR@FITC的Zeta电位和水合粒径

  Table 1.  Zeta potential and hydrodynamic diameter of GNR, GNR@COOH and GNR@FITC

  纳米金棒	Zeta电位/mV	水合粒径/nm
  GNR	4 ± 3	70 ± 3
  GNR@COOH	-25 ± 2	82 ± 2
  GNR@FITC	-5 ± 2	86 ± 5

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