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• 过渡金属在生命体系中是一个矛盾的存在，一方面这些金属在许多蛋白质中担任必需的辅因子，另一方面游离的或者水合形式的过渡金属具有一定毒性。Zn²⁺是许多参与水解和基团转移反应酶中的一种辅因子^[1]，也为蛋白质(如转录因子)提供了结构稳定性^[2-3]，并被认为是神经传递中的一种信号分子。然而，不稳定的Zn²⁺会干扰许多生物过程，如缺血或癫痫发作后以及头部损伤后锌稳态被破坏，不稳定的Zn²⁺增加从而导致神经损伤^[4-6]，由锌摄入不足是导致肠肢端皮炎重要原因^[7]，因此在生命体系中Zn²⁺被要求维持在低游离浓度^[8-9]。为了更好地了解锌在生物系统中的作用，实时监测细胞中不稳定锌的分布和浓度是非常重要的。

  光致发光技术以其高灵敏度、高选择性、高时空分辨率被认为是检测Zn²⁺最有效的手段之一。在过去的几十年中，人们报道了大量具有不同特性的光致发光Zn²⁺探针^[10-16]。尤其是比例计量型探针，可以避免光散射和探针浓度引起的伪影，达到定量检测活体样本中Zn²⁺目的。广泛应用于构建比例计量探针的机理有光诱导电荷转移(PCT)^[17-25]、荧光共振能量转移(FRET)^[26-35]、金属离子配位抑制激发态分子内质子转移(ESIPT)^[36-43]、荧光团互变异构^[44-45]和双荧光团方法^[46-48]等。

  除了上述一些机理以外，利用Zn²⁺配位诱导芳环共面化引起分子荧光光谱的改变这一特性^[49]设计Zn²⁺比例计量型荧光探针。基于此机理，Ajayaghosh等构建了含5，5′-二乙烯基-2，2′-联吡啶衍生物的比例Zn²⁺探针，该探针与Zn²⁺配位后，Zn²⁺诱导的芳香共平面增加了荧光分子的共轭，导致发射波长红移^[50]。该小组后来又设计多个Zn²⁺探针，进一步证明了这一结论^[51-53]。然而，基于这一机制构造的比例计量型探针很少^[54-56]。我们课题组基于此机理设计Zn²⁺荧光探针PBITA，其分子模型研究表明，Zn²⁺诱导的PBITA的红光发射位移可能与2-PBI的2个异芳族平面的共面有关 ^[57]。虽然PBITA的发射在与Zn²⁺结合后呈现38 nm的红移，但Zn²⁺诱导的荧光增强完全覆盖了自由PBITA的发射。因此，PBITA更被认为是一个增强型的Zn²⁺探针。为了进一步证实该机理，将探针PBITA进行修饰，研制了新的Zn²⁺探针DBITA。在DBITA中，在PBI的5-位修饰供电子基N，N-二甲基，通过分子内电荷转移促进探针的ICT(intramolecular charge transfer，ICT)效应，一方面使新Zn²⁺/探针配合物发生较长波长的红移，探针在与Zn²⁺结合前后显示出2个发射带，并成为一个真正的比例计量型Zn²⁺探针；另一方面，提高探针本身的发光效率，有利于DBITA在生物体系中的应用。

  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  KNO₃，Zn(NO₃)₂，HEPES(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid), EGTA(ethylenebis(oxy-ethylenenitrilo)tetraacetic acid)，2，6-二羟甲基吡啶和5-氯-2-硝基苯胺购自Alfa公司。常用药品(如邻苯二胺，三乙胺，对甲基苯磺酰氯，酸碱，常规溶剂如甲醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醇等)均为市售国产试剂，使用前未做进一步纯化。乙腈分别经P₂O₅回流，无水K₂CO₃干燥，CaH₂回流蒸出后使用。N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷和二甲基亚砜(DMSO)经CaH₂干燥后减压蒸出使用。四氢呋喃(THF)经钠/二苯甲酮回流蒸出后使用。二(2-甲基吡啶基)胺(BPA)参照文献方法合成^[58]。光谱性质测试中，所用溶剂如DMSO等为光谱纯试剂，购自Aldrich公司，水为MILIPORE处理过的超纯水。电喷雾质谱用LCQ电喷雾质谱仪(ESMS，Finnigan)测定，并用ISOPRO 3.0程序模拟其同位素分布模式。¹H，¹³C NMR在Bruker DRX-500或Bruker DRX-300核磁仪上用标准脉冲序列测定(298 K)。紫外光谱在Perkin-Elmer Lambda 35紫外可见光谱仪上测定。荧光光谱在AMINCO Bowman series 2发光光谱仪上测定。pH值用PHS-3精密pH计记录。紫外和荧光光谱数据用Origin软件包处理。

  1.2   DBITA的合成

  化合物Ⅰ(4-N，N-二甲氨基-邻苯二胺)和Ⅱ(二(2-吡啶甲基)(6-醛基-2-吡啶甲基)胺)根据文献方法合成^[59-60]。DBITA合成路线^[61]见Scheme 1。在装有搅拌磁子、恒压滴液漏斗和回流冷凝管的100 mL三颈烧瓶中加入新制的化合物Ⅰ(0.070 mg 0.46 mmol)、NaHSO₃(0.053 g，0.51 mmol)和乙醇(5 mL)。加热至回流，用恒压滴液漏斗缓慢向反应液中滴加化合物Ⅱ(0.156 mg，0.46 mmol)的乙醇溶液10 mL，20 min滴加完毕。保持回流反应12 h后停止。减压蒸馏去除溶剂，将所得油状物用CH₂Cl₂和水溶解，分出有机相，饱和NaHCO₃溶液和饱和食盐水洗涤，无水MgSO₄干燥，滤除干燥剂，减压蒸馏去除溶剂，柱层析分离(中性氧化铝，CH₂Cl₂~CH₂Cl₂/MeOH(200:1，V/V))得产品0.054 g，收率26%。棕黄色油状物，R_f=0.3(V_EtOAc:V_MeOH=20:1)。¹H NMR (500 MHz，CDCl₃)：δ 3.04(s，6H，-N(CH₃)₂)，3.91(s，2H，-CH₂)，4.03(s，4H，-CH₂)，6.93(s，1H，BI-H)，7.23(t，2H，J=6.0，Py-H)，7.29(d，2H, J=7.5，Py-H)，7.66~7.78(m，6H, BI-H and Py-H), 8.20(d, 1H，J=7.5，BI-H)，8.65(d，2H，J=4.5，Py-H)。¹³C NMR(125 MHz，CDCl₃)：δ 41.56，58.23，59.90, 93.99, 111.16, 118.95，119.22，119.79，122.17, 122.99, 123.43, 135.77，136.52，137.17，148.09，148.57, 148.74, 149.69, 156.93，158.98。MALDI-TOF(m/z)：Calcd. 450.23, Found:450.4 for [M+H]⁺。Element analysis(%) Calcd. for C₂₇H₂₇N₇：C，72.14；H，6.05；N，21.81。Found：C，72.89；H，6.54；N，21.03。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  DBITA合成线路图

  Scheme 1.  Synthesis of DBITA

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  1.3   DBITA的光谱性质测试

  DBITA用光谱纯DMSO配成1.18 mmol·L^-1。取DBITA的DMSO储备液加入到100 mL的容量瓶中并用HEPES缓冲溶液(50 mmol·L^-1，100 mmol·L^-1 KNO₃，pH=7.2)和DMSO定容，配成浓度为10 μmol·L^-1的(V_DMSO:V_HEPES=1:99)溶液，然后分别进行紫外以及荧光光谱的测量。

  DBITA的Zn²⁺紫外和荧光滴定实验在DMSO-H₂O(1:99，V/V，50 mmol·L^-1 HEPES，100 mmol·L^-1 KNO₃，pH=7.20)体系中进行，紫外滴定参比溶液为空白的DMSO-H₂O溶液。向3 mL DBITA(10 μmol·L^-1)的配体溶液中分别加入不同体积的Zn(NO₃)₂水溶液(1.2 mmol·L^-1)，每次加25 μL，充分混匀后进行紫外和荧光测试。

  1.4   金属离子选择性实验

  金属离子选择性及Zn²⁺与碱金属、碱土金属的竞争性实验都在上述DMSO-H₂O体系中进行。实验中，向3 mL DBITA(10 μmol·L^-1)的溶液中加入25 μL浓度为1.2 mmol·L^-1的金属离子水溶液，使金属离子浓度与DBITA浓度相等，充分混匀后进行测试。竞争性实验中，向3 mL DBITA(10 μmol·L^-1)的溶液中加入25 μL浓度为1.2 mol·L^-1的Zn(NO₃)₂水溶液，充分混匀后记录光谱。然后再向此溶液中分别加30 μL浓度为1.0 mol·L^-1的碱金属或碱土金属离子水溶液，使溶液中碱金属或碱土金属的量达到10 mmol·L^-1，即Zn²⁺浓度的1 000倍，充分混匀后再次记录光谱。

  1.5   DBITA对生物细胞内Zn²⁺的造影研究

  造影实验中所用HeLa细胞在含有10%胚胎小牛血清(FBS，Invitrogen)，青霉素(100 units·mL^-1)和链霉素(100 mg·mL^-1)的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM，Invitrogen)中，37 ℃，5%(V/V) CO₂的培养箱中培养。为了便于成像，HeLa细胞培养在玻璃底的培养皿中。当去掉介质后，细胞用不含金属的PBS溶液(10 mmol·L^-1)洗涤3次，加入10 μmol·L^-1 DBITA溶液在室温下孵育20 min；吸掉溶液，再用PBS溶液洗涤3次，然后用激光共聚焦荧光显微镜进行观测。细胞外源锌的引入通过在Zn(NO₃)₂/巯基吡啶硫酮(pyrithone(2-mercaptopyidine-N-oxide))的1:1的PBS溶液(5 μmol·L^-1)中孵育10 min，用激光共聚焦荧光显微镜进行造影。造影完毕后，细胞再用0.05 mmol·L^-1 TPEN(由TPEN的浓储液通过PBS稀释得到)处理20 min后，再用PBS洗涤一次后造影。

  成像在Olympus FV10-ASW激光共聚焦荧光显微镜上完成。激发波长为488 nm，观察波长在500~540 nm和580~620 nm之间。

  2.   结果与讨论

  2.1   DBITA的光谱性质

  为了便于比较，将PBITA与DBITA光谱数据列于表S1。紫外光谱实验结果表明, 与PBITA相比，由于在PBI的5位引入供电子基团N，N-二甲基，使DBITA的最大吸收峰红移到340 nm(ε=1.3×10⁴ L·mol^-1·cm^-1)，最大吸收峰归属于DBITA中苯并咪唑部分π-π^*跃迁引起的。荧光光谱中(图S1)，DBITA在水溶液中的荧光较强，荧光强度大约是PBITA的3.5倍，量子产率为0.18。其最大激发和发射波长为362和534 nm，与PBITA相比分别红移了约26和149 nm。与PBITA类似，在DBITA的激发以及发射光谱中除了最大激发和发射峰外，在392和493 nm处还同时存在一个激发和发射峰。以上结果表明，具有供电子作用的N，N-二甲基的引入，使DBITA的紫外及发射波长发生了红移，量子产率大幅度提高，达到了预期的设计目的。

  2.2   DBITA荧光对pH的依赖性

  由于生命体内pH值不会偏离中性太多，因此发射光谱在近中性条件下不随pH变化是Zn²⁺荧光探针能够在生命体系的应用必要条件之一。检测了pH值对DBITA荧光发射谱的影响。实验在含5 μmol·L^-1 DBITA的DMSO/H₂O(1:99，V/V)溶液中进行，溶液pH值用5 mol·L^-1的HNO₃及5 mol·L^-1的NaOH水溶液调节。

  如图S2所示，PBITA的荧光发射光谱受pH的影响较大。而DBITA中5位N原子、吡啶以及苯并咪唑的N原子在酸性条件下都容易发生质子化，减弱了分子的ICT效应，所以DBITA的荧光发射强度在pH 2~6的范围内随酸性的增强荧光强度逐渐减弱，并且在pH 2~3时发射波长会发生一定的红移。在pH 6~10的范围内DBITA的荧光强度受pH变化较小，都体现出较强的荧光。这说明螯合团与荧光团之间的PET效应很弱，即使BPA单元中的N原子质子化以后也不会使探针的荧光有明显增强，这与N，N-二甲基的推电子效应密切相关。随pH增大到10以上，探针的荧光强度有所减弱，这可能是由于咪唑脱质子后使5位的N，N-二甲基到咪唑以及吡啶的推拉电子效应(ICT效应)减弱导致的。结果表明，DBITA则在近中性条件下荧光强度较为稳定，具有适合应用于生命体内造影的潜力。

  2.3   DBITA与Zn²⁺的荧光响应行为

  在HEPES溶液中的Zn²⁺荧光滴定表明(图 1a)，随着Zn²⁺的加入，DBITA在493和534 nm处的发射峰逐渐降低，同时在609 nm处出现一个新的发射峰，并且荧光强度逐渐增强。当c(Zn²⁺)_total/c(DBITA)的值达到1后，2个发射峰的荧光强度不再发生改变，这说明Zn²⁺与DBITA的方式结合为1:1结合。用609和534 nm处的荧光强度的比值(F₆₀₉/F₅₃₄)与 c(Zn²⁺)/c(DBITA)作图可知，F₆₀₉/F₅₃₄比值与c(Zn²⁺)_total呈线性关系(图 1a插图)，比值大约从0.3增强到1.5。由于DBITA存在由从推电子基团N，N-二甲基到咪唑以及吡啶单元的ICT效应，当DBITA与Zn²⁺结合后，PBI与Zn²⁺配位后不仅会使芳环平面性增强，共轭程度增加，波长发生红移，而且由于Zn²⁺的拉电子作用导致拉电子单元拉电子能力增强，使分子内的ICT效应进一步增强，同样也会导致波长发生红移。这两种效应的叠加是导致DBITA与Zn²⁺结合后波长红移要比PBITA与Zn²⁺结合所导致的波长红移大的主要原因。另外，在含EGTA/Zn²⁺的HEPES缓冲溶液中对DBITA的Zn²⁺配合物的K_d值进行了测定。实验结果表明DBITA与Zn²⁺的结合能力要远高于PBITA(表S1)，配合物DBITA/Zn²⁺的K_d值为0.16 pmol·L^-1(图S3)，原因可能是因为N，N-二甲基较强的供电子能力增强了咪唑N原子的配位能力。

  图 1

  

  图 1.  Zn²⁺对10 μmol·L^-1 DBITA在HEPES溶液中的荧光(a)和紫外(b)滴定光谱图; (a)中插图为F₆₀₉/F₅₄₃滴定曲线, (b)中插图为340 nm波长处的紫外滴定曲线

  Figure 1.  (a) Emission spectra of 10 μmol·L^-1 DBITA (λ_ex, 362 nm) in HEPES buffer solution; Inset in the titration profile based on the emission ratio at 609 and 543 nm, F₆₀₉/F₅₄₃; (b) Absorption spectra of 10 μmol·L^-1 DBITA in HEPES buffer when titrated with Zn²⁺ (1.2 mmol·L^-1) solution; Inset in Zn²⁺ titration profile according to the absorbance at 340 nm

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  2.4   DBITA与Zn²⁺结合方式

  2.4.1   紫外滴定实验

  进一步采用紫外滴定、核磁滴定和质谱研究了DBITA与Zn²⁺结合方式。紫外滴定实验结果表明当在DBITA的HEPES溶液中滴加Zn²⁺以后，DBITA在340 nm处的吸收峰逐渐降低，并伴随有明显的红移，移动到364 nm处(图 1b)。PBITA吸收峰的红移是Zn²⁺诱导的芳环共面导致的结果。而对于DBITA来说，由于同时存在Zn²⁺诱导的芳环共面以及ICT效应的改变，使其吸收峰的红移距离(Δλ_abs=24 nm)要大于PBITA(Δλ_abs=15 nm)。DBITA的滴定光谱中在359 nm处出现了等消光点，这表示自由配体已完全转化为一种锌的配合物。用340 nm处的吸收峰吸收强度对c(Zn²⁺)_total/c(DBITA)作图可知：当c(Zn²⁺)_total/ c(DBITA)≤1时，紫外吸光度的降低与总锌浓度呈线性关系；而当c(Zn²⁺)_total/c(DBITA) > 1时，更高的总锌浓度也不会再使光谱发生明显的改变。这表明所生成的Zn²⁺配合物的化学计量比为1:1。

  2.4.2   核磁滴定实验

  Zn²⁺对DBITA的核磁滴定实验在CD₃OD体系中进行。由图 2可以看出，随着Zn²⁺的加入，除了自由的DBITA的信号峰外(图 2c)，还出现了另一组Zn²⁺/DBITA配合物的信号峰。当c(Zn²⁺)_total/c(DBITA)=0.5时，两组信号峰的强度基本相同(图 2b)；然而其比值达到1时，则只能观察到Zn²⁺配合物的信号峰(图 2a)。加入更多的Zn²⁺也不会引起核磁谱的进一步变化。这同样也证实了DBITA与Zn²⁺的结合比为1:1。

  图 2

  

  图 2.  Zn²⁺对DBITA在CD₃OD中的¹H核磁滴定谱图

  Figure 2.  ¹H NMR spectra of DBITA in CD₃OD upon Zn²⁺ titration

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  详细的信号峰的指认结果列于表S2。Zn²⁺的配位使得探针的所有质子的信号都发生了改变，这表明吡啶环上的氮原子以及咪唑环的氮原子都可能参与了Zn²⁺的直接配位。因此，我们推测Zn²⁺与DBITA的结合模式可能如图 2d所示。

  2.4.3   配合物质谱研究

  DBITA的Zn²⁺配合物的电喷雾质谱结果如图 3所示，在DBITA/Zn²⁺配合物的正离子电喷雾质谱中可以观察到2个峰：256.83处较低的峰为配合物的二价峰[DBITA+Zn²⁺]²⁺；512.33处的峰可以归属为配合物的一价峰[DBITA+Zn²⁺-H]⁺。这些离子峰的同位素分布方式与ISOPRO 3.0模拟的结果基本一致，这进一步表明了DBITA与Zn²⁺结合方式为1:1结合。

  图 3

  

  图 3.  DBITA/Zn²⁺配合物的正离子电喷雾质谱

  Figure 3.  MS spectrum of DBITA/Zn²⁺ complex

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  2.5   DBITA与Zn²⁺结合的选择性研究

  对金属离子的选择性荧光响应是一个合格探针所必须具有的重要的光学性质。因此我们在DMSO-H₂O体系中对DBITA与Zn²⁺结合的选择性进行了研究。实验结果(图 4a)表明，在生命体相关的金属离子存在下，DBITA对Zn²⁺和Cd²⁺有较好的选择性比例计量响应(F₆₀₉/F₅₃₄)，其它的金属阳离子，如等浓度的Cu²⁺，Hg²⁺，Pb²⁺，CO²⁺，Ni²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺ 以及1 000倍的碱金属和碱土金属离子等都对配体荧光强度无明显影响。由各种离子存在下DBITA在609和534 nm处的荧光强度的比值可知，Zn²⁺和Cd²⁺在2个波长下强度的比值都在1.6左右，而其余金属离子的比值都在0.3左右，因此DBITA对Zn²⁺的比例计量行为不会受到除Cd²⁺外其他金属离子的干扰。以上结果表明，DBITA与大部分Zn²⁺探针类似，难以排除处同一族性质极为相似的Cd²⁺对其增强以及比例计量行为的干扰。但由于正常细胞或生命体内没有Cd²⁺，所以不会对Zn²⁺的响应带来干扰。

  进一步研究了pH变化对DBITA的Zn²⁺比例计量响应行为的影响。如图 4b所示，DBITA在609和534 nm处的荧光强度的比值只在酸性条件下才会增强，而在pH≥5的范围内基本保持不变，而DBITA/Zn²⁺配合物的比值在pH 4~8之间稳定，因此可以认为DBITA对Zn²⁺比例计量行为不受pH干扰，非常适合于生理环境下Zn²⁺的响应。

  图 4

  

  图 4.  (a) HEPES缓冲溶液中(50 mmol·L^-1, pH 7.2, 0.1 mol·L^-1 KNO₃), 金属离子对10 μmol·L^-1 DBITA的荧光选择性响应柱状图(F₆₀₉/F₅₃₄, λ_ex=362 nm); 其中Zn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺的含量与DBITA含量相同, Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺的含量是DBITA含量的1000倍; (b) DBITA及其Zn²⁺配合物(10 μmol·L^-1)在609和543 nm波长下的荧光强度比值随pH变化曲线

  Figure 4.  (a) Emission ratio at 609 and 543 nm of DBITA (10 μmol·L^-1, λ_ex=362 nm) induced by different metal cations in HEPES buffer (50 mmol·L^-1, pH 7.2, 0.1 mol·L^-1 KNO₃); Final concentration for Zn²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺, F^e2+, Hg²⁺, Mn²⁺, Ni²⁺, Hg²⁺, Co²⁺ and Pb²⁺ is 10 μmol·L^-1, for Na⁺, K⁺, Ca2⁺, and Mg²⁺ is 0.10 mmol·L^-1, (b) Emission ratio F₆₀₉/F₅₃₄ of DBITA and DBITA/Zn²⁺ complex (10 μmol·L^-1) in aqueous solutions with different pH values, λ_ex=362 nm

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  2.6   DBITA对细胞内Zn²⁺的造影性能研究

  由于DBITA对Zn²⁺发射波长红移的比例计量响应，因此我们利用双通道对DBITA在细胞内的Zn²⁺造影能力进行了研究。虽然DBITA的最大激发波长在362 nm，但从激发光谱上可以看出在405 nm处仍可以对DBITA进行激发。因此，为了减小紫外激发对细胞带来的光损伤，我们选用了波长相对较长的405 nm作为激发波长对DBITA进行了造影研究。根据图S4可知，用405 nm作为激发波长对DBITA的金属离子选择性以及Zn²⁺的比例计量响应几乎没有影响，在荧光增强的作用上Zn²⁺导致的荧光增强4.95倍增加到6.35倍，而Cd²⁺导致的荧光增强5.12倍增加到5.31倍。

  DBITA溶液对HeLa细胞造影结果如图 5所示。绿色通道收集500~540 nm荧光，红色通道收集580~620 nm荧光；荧光比值为绿色通道荧光与红色荧光通道比值。HeLa细胞经DBITA溶液染色后，2个通道的比值非常低，约为0.098±0.011(图 5i)；这表明细胞中的游离Zn²⁺相对较低，DBITA主要以游离形式存在。用Zn(NO₃)₂/pyrithione溶液孵育后，再加入DBITA溶液，红色通道的荧光强度信号由117±59(图 5e)增加到2 678±348(图 5f)，绿色通道的荧光强度信号由1 232±69(图 5a)增加到3 871±116(图 5b)；因此，荧光信号的比值明显增加，大多数细胞的比值在0.73±0.04左右，少数细胞的比例增加到1.0左右(图 5j)。这表明外源性Zn²⁺的加入增加了细胞中Zn²⁺的浓度，DBITA与Zn²⁺结合后导致比值增大。继续将HeLa细胞用TPEN溶液孵育20 min后进行造影，结果如图 5k，细胞内两个通道的比值明显下降，约为0.45±0.04，但仍高于细胞的初始比例。这是由于DBITA对Zn²⁺有很强的螯合能力，即使在高浓度的TPEN存在下，DBITA螯合的Zn²⁺仍不能完全被去除。以上结果表明，DBITA具有良好的细胞膜透性，实现了细胞中Zn²⁺比值检测。根据文献报道，锌过量会对发育和成熟的神经系统产生深远的影响。例如，谷氨酸能突触释放过多的Zn²⁺是导致缺血时神经元死亡的原因^[4]，视神经损伤后Zn²⁺的积累导致视网膜神经节细胞死亡^[62]。同样，细胞内Zn²⁺的激增也与对成熟少突胶质细胞的兴奋性毒性或硝化性损伤有关^[63-65]。DBITA具有体内Zn²⁺过多的诊断和治疗潜力。

  图 5

  

  图 5.  DBITA对HeLa细胞内的激光共聚焦双通道成像: (a, e, i) HeLa细胞用DBITA(10 μmol·L^-1)溶液25 ℃孵育20 min; (b, f, j)将染色细胞暴露于5 μmol·L^-1 Zn(NO₃)₂/2-巯基吡啶-N-氧化物溶液中5 min, 然后再用DBITA溶液孵育20 min成像; (c, g, k)进一步用TPEN溶液(25 μmol·L^-1, 20 min)处理(b, f, j)中的细胞; (a, b, c) 500~ 540 nm通道荧光图像; (e, f, g) 580~620 nm通道荧光图像; (i, j, k)由(e, f, g)和(a, b, c)生成的比例图像, λ_ex=405 nm; (d)与(a~c)中所示图像对应的平均信号强度柱状图; (h)与(e~g)中所示图像对应的平均信号强度柱状图; (l)与(i~k)中所示图像对应的平均比值柱状图

  Figure 5.  Dual emission ratiometric imaging of intracellular Zn²⁺ in HeLa cells via DBITA (10 μmol·L^-1, 20 min) staining at 25 ℃: (a, e, i) HeLa cells incubated with DBITA at 25 ℃ for 20 min; (b, f, j) the stained cells were exposed to 5 μmol·L^-1 Zn(NO₃)₂/2-mercaptopyridine-N-oxide solution at 25 ℃ for 5 min, followed by washing with DBITA solution, (c, g, k) the cells in (b, f, j) further treated by TPEN solution (25 μmol·L^-1, 20 min, bottom); (a, b, c) Fluorescence images obtained according to the emission collected at 500~540 nm; (e, f, g) Fluorescence images obtained according to the emission collected at 580~620 nm; (i, j, k) Ratiometric images generated from (e, f, g) and (a, b, c), λ_ex=405 nm; (d) Histogram of the average signal intensity corresponding to images shown in (a~c); (h) Histogram of the average signal intensity corresponding to images shown in (e~g); (l) Histogram of the average ratio value corresponding to images shown in (i~k)

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  3.   结论

  综上所述，以2-PBI为荧光团，通过在PBI的5-位引入强的推电子基团N，N-二甲基，设计了Zn²⁺结合诱导发射光谱红移的比例计量型Zn²⁺探针DBITA。当探针与Zn²⁺结合后，可发生Zn²⁺诱导的芳环翻转/共面，从而使发射峰发生较大距离的红移。进一步用紫外-可见光谱、核磁共振氢谱和质谱研究了DBITA与Zn²⁺的1:1结合行为。在HeLa细胞内的比例计量造影实验表明，DBITA能够应用于细胞内Zn²⁺的定量检测。本研究进一步证明，通过Zn²⁺诱导的芳环翻转/共面是构筑比例计量型Zn²⁺荧光探针的有效策略。这一策略应该适合于2，2′-氮杂-1，1′-二芳基型荧光团的比例计量型探针的设计。

  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn

  
  
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  Scheme 1  DBITA合成线路图

  Scheme 1  Synthesis of DBITA

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  图 1  Zn²⁺对10 μmol·L^-1 DBITA在HEPES溶液中的荧光(a)和紫外(b)滴定光谱图; (a)中插图为F₆₀₉/F₅₄₃滴定曲线, (b)中插图为340 nm波长处的紫外滴定曲线

  Figure 1  (a) Emission spectra of 10 μmol·L^-1 DBITA (λ_ex, 362 nm) in HEPES buffer solution; Inset in the titration profile based on the emission ratio at 609 and 543 nm, F₆₀₉/F₅₄₃; (b) Absorption spectra of 10 μmol·L^-1 DBITA in HEPES buffer when titrated with Zn²⁺ (1.2 mmol·L^-1) solution; Inset in Zn²⁺ titration profile according to the absorbance at 340 nm

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  图 2  Zn²⁺对DBITA在CD₃OD中的¹H核磁滴定谱图

  Figure 2  ¹H NMR spectra of DBITA in CD₃OD upon Zn²⁺ titration

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  图 3  DBITA/Zn²⁺配合物的正离子电喷雾质谱

  Figure 3  MS spectrum of DBITA/Zn²⁺ complex

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  图 4  (a) HEPES缓冲溶液中(50 mmol·L^-1, pH 7.2, 0.1 mol·L^-1 KNO₃), 金属离子对10 μmol·L^-1 DBITA的荧光选择性响应柱状图(F₆₀₉/F₅₃₄, λ_ex=362 nm); 其中Zn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺的含量与DBITA含量相同, Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺的含量是DBITA含量的1000倍; (b) DBITA及其Zn²⁺配合物(10 μmol·L^-1)在609和543 nm波长下的荧光强度比值随pH变化曲线

  Figure 4  (a) Emission ratio at 609 and 543 nm of DBITA (10 μmol·L^-1, λ_ex=362 nm) induced by different metal cations in HEPES buffer (50 mmol·L^-1, pH 7.2, 0.1 mol·L^-1 KNO₃); Final concentration for Zn²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺, F^e2+, Hg²⁺, Mn²⁺, Ni²⁺, Hg²⁺, Co²⁺ and Pb²⁺ is 10 μmol·L^-1, for Na⁺, K⁺, Ca2⁺, and Mg²⁺ is 0.10 mmol·L^-1, (b) Emission ratio F₆₀₉/F₅₃₄ of DBITA and DBITA/Zn²⁺ complex (10 μmol·L^-1) in aqueous solutions with different pH values, λ_ex=362 nm

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  图 5  DBITA对HeLa细胞内的激光共聚焦双通道成像: (a, e, i) HeLa细胞用DBITA(10 μmol·L^-1)溶液25 ℃孵育20 min; (b, f, j)将染色细胞暴露于5 μmol·L^-1 Zn(NO₃)₂/2-巯基吡啶-N-氧化物溶液中5 min, 然后再用DBITA溶液孵育20 min成像; (c, g, k)进一步用TPEN溶液(25 μmol·L^-1, 20 min)处理(b, f, j)中的细胞; (a, b, c) 500~ 540 nm通道荧光图像; (e, f, g) 580~620 nm通道荧光图像; (i, j, k)由(e, f, g)和(a, b, c)生成的比例图像, λ_ex=405 nm; (d)与(a~c)中所示图像对应的平均信号强度柱状图; (h)与(e~g)中所示图像对应的平均信号强度柱状图; (l)与(i~k)中所示图像对应的平均比值柱状图

  Figure 5  Dual emission ratiometric imaging of intracellular Zn²⁺ in HeLa cells via DBITA (10 μmol·L^-1, 20 min) staining at 25 ℃: (a, e, i) HeLa cells incubated with DBITA at 25 ℃ for 20 min; (b, f, j) the stained cells were exposed to 5 μmol·L^-1 Zn(NO₃)₂/2-mercaptopyridine-N-oxide solution at 25 ℃ for 5 min, followed by washing with DBITA solution, (c, g, k) the cells in (b, f, j) further treated by TPEN solution (25 μmol·L^-1, 20 min, bottom); (a, b, c) Fluorescence images obtained according to the emission collected at 500~540 nm; (e, f, g) Fluorescence images obtained according to the emission collected at 580~620 nm; (i, j, k) Ratiometric images generated from (e, f, g) and (a, b, c), λ_ex=405 nm; (d) Histogram of the average signal intensity corresponding to images shown in (a~c); (h) Histogram of the average signal intensity corresponding to images shown in (e~g); (l) Histogram of the average ratio value corresponding to images shown in (i~k)

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