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• 天然抗生素在对抗耐药细菌方面发挥着重要的作用^[1-2]。目前已经批准上市的20多种抗生素中，仅有3种(磺胺药物，喹诺酮和恶唑烷酮)不是基于天然抗生素结构研发的药物^[3]。研究生活在特殊环境中的微生物，更有可能发现新的天然抗生素^[4]。Thermoactinomide A是从冰岛嗜热细菌菌株ISCAR 2354中分离出的一种由D型和L型氨基酸组成的新型环六肽，由6个氨基酸残基构成，结构为：Cyclic[D-Tyr-D-allo-Ile-L-Leu-D-Leu-L-Leu-L-Val](图 1)，相对分子质量为714.47^[5-6]。基于环状抗菌肽的不断发现，含有D/L混合型的结构被认为是很有前景的抗菌先导化合物^[7-9]。自2017年发现以来，对其研究仅局限于分离、纯化及结构鉴定等工作。由于在自然界中的含量非常低，要对其进行抗菌机理，构效关系研究，仅依靠从微生物代谢产物中提取无法满足需要。因而，采用固相-液相两步法对其进行化学合成，探讨固相合成条件对天然环肽收率的影响及环肽的抗菌性能，以满足目前天然多肽抗菌机理、构效关系研究的需要。

  图 1

  

  图 1.  Thermoactinomide A的结构式

  Figure 1.  The structure of thermoactinoamide A

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  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  Bruker Ultrashield 400 PLUS型核磁共振谱仪(NMR，德国Bruker公司)，TMS为内标，DMSO为溶剂；LC-20A型高效液相色谱仪(HPLC，日本岛津公司)；ChiralPak AS-H型色谱柱(日本DAICEL Chemical公司)；LCMS-8030型三重四极杆质谱仪(MS, 日本岛津公司)；UV-2450型紫外分光光度计(日本岛津公司)。

  Fmoc-氨基酸、2-氯三苯甲基氯树脂、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N, N, N′, N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)购自于上海吉尔生化有限公司；N, N′-二异丙基乙胺(DIPEA)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBOP)、1-羟基苯并三氮唑(HoBt)、冰醋酸均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水二氯甲烷(DCM)、无水N, N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)购自上海阿达玛斯试剂有限公司；GE Healthcare Sephadex LH-20购自广州市齐云生物技术有限公司；牛肉膏、可溶性淀粉、酸水解酪蛋白均购自国药集团化学试剂有限公司。以上试剂纯度均为分析纯。肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae NCTC 7466、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC 6051和Bacillus subtilis ATCC 6633由安徽工程大学微生物发酵安徽省工程技术研究中心提供。

  1.2   实验方法

  天然抗菌环肽Thermoactinoamide A的固相合成按Scheme 1路线进行合成^[6]。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Synthesis of thermoactinomide A

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  1.2.1   直链肽树脂的合成

  称取二氯三苯基氯树脂1000 mg(载样量为1.03 mmol/g)加入到固相合成反应管中，加入20 mL DCM浸泡0.5 h，抽干待用。将Fmoc-D-Tyr(tBu)-OH(322 mg，0.7 mmol)和DIPEA(754 μL，4.3 mmol)混溶于10 mL DCM，加入到抽干待用的树脂中，通入N₂气，反应2 h，抽滤后，分别用DCM和DMF各洗涤3遍。加入20 mL V(甲醇):V(DCM)=1:4的混合液，反应0.5 h，对未反应完的树脂进行封闭，抽滤后，分别用DCM和DMF各洗涤3遍，抽干待用，随机取出10多粒树脂放入检测管中，滴加检测试剂，沸水浴1 min，树脂无颜色变化，表明得到Fmoc-Tyr(tBu)-Resin(1)。

  向反应管中加入20 mL V(哌啶):V(DMF)=1:4的混合溶液，反应30 min，用于脱除Fmoc保护基。反应结束后，分别用DCM和DMF各洗涤5遍，抽干待用，随机取出10多粒树脂放入检测管中，滴加检测试剂，沸水浴1 min，树脂变蓝，表明得到NH₂-Tyr(tBu)-Resin(2)。重复上述连接氨基酸的步骤，在加入缩合试剂TBTU(278 mg，0.9 mmol)和DIPEA(661.6 μL，3.6 mmol)的情况下，依次接入Fmoc-D-allo-Ile-OH、Fmoc-L-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-L-Leu-OH和Fmoc-Val-OH，重复缩合→脱保护→缩合的步骤，每步反应结束后，通过检测试剂监测反应的进程，最终得到NH₂-Val-L-Leu-D-Leu-L-Leu-D-allo-Ile-Tyr(tBu)-Resin(3)。

  1.2.2   直链肽树脂的切割

  按照V(冰醋酸):V(三氟乙醇):V(DCM)=1:1:8的比例配制切割试剂。将1.2.1节中得到的直链肽树脂(3)，抽滤1 h，得到干燥的黄色固体，转移至50 mL离心管中，加入30 mL切割试剂，0 ℃，振荡反应2 h，将滤液抽滤至100 mL茄型瓶中，减压浓缩，得到淡黄色粉末状固体1988 mg，即直链肽(4)的粗品。

  1.2.3   直链肽的分离纯化

  将直链肽的粗品用甲醇溶解，通过制备型HPLC纯化。色谱条件：制备柱为C₁₈反向柱(250×50 mmol/L，5 μm)；检测波长220 nm；流动相A为0.08%(体积分数)TFA的乙腈溶液，流动相B为0.08%(体积分数)TFA的水溶液，梯度洗脱(0~30 min，流动相A：20%~80%)；流速30.0 mL/min。直链肽纯品保留时间为15.92 min，经冷冻干燥，得到1863 mg，收率84%。

  直连肽(4)白色粉末状的固体，收率84%；LC-MS计算值C₃₈H₆₂N₆O₇ [M+H]⁺ 789.55，[M+Na]⁺ 811.50实测值[M+H]⁺ 789.55，[M+Na]⁺ 811.50。

  1.2.4   直链肽的环合

  分别称取HoBt(428.4 mg，3.2 mmol)、PyBOP(1649.7 mg，3.2 mmol)和DIPEA(1104 μL，6.4 mmol)溶于500 mL无水DCM溶剂中，将溶液加入到2000 mL茄型瓶中。再称取直链肽500 mg溶于500 mL(300 mL无水DCM和200 mL无水DMF)，将溶液添加到恒压滴液漏斗中。将上述装置连接后抽真空，充Ar气保护，茄型瓶置于0 ℃的冰水中，缓慢滴加恒压滴液漏斗中的溶液，10 h滴加完毕后，室温反应过夜。先使用水泵减压蒸馏，除去反应液中的DCM，再使用油泵对其减压蒸馏，除去反应液中的DMF。以甲醇为缓冲液，用Sephadex LH-20凝胶柱，收集含有多肽溶液的部分，合并在茄型瓶中，减压蒸馏，得淡黄色粉末状固体366 mg，即带侧链保护基的环六肽(5)的粗品。

  1.2.5   脱保护

  将带侧链保护基的环六肽粗品置于50 mL离心管中，加入V(TFA):V(DCM)=9:1的混合溶剂15 mL，振荡2 h，将混合溶液转移至茄型瓶中，减压蒸馏，得淡黄色粉末状固体，即环肽Thermoactinomide A的粗品。

  1.2.6   环肽Thermoactinomide A的分离纯化

  将环肽Thermoactinomide A的粗品用甲醇溶解，通过制备型HPLC纯化。色谱条件：制备柱为C₁₈反向柱(250×50 mmol/L，5 μm)；检测波长220 nm；流动相A为0.08%(体积分数)TFA的乙腈溶液，流动相B为0.08%(体积分数)TFA的水溶液，梯度洗脱(0~20 min，流动相A：20%~80%)；流速30.0 mL/min。环肽Thermoactinomide A纯品保留时间为20.27 min，经冷冻干燥，得到白色粉末状的固体255 mg，由直链肽合成Thermoactinomide A的收率为51%。

  化合物(5)白色粉末状的固体，产率51%；¹H NMR(400 MHz, DMSO), δ:9.27(s, 1H), 8.52~8.44(d, J=8.0 Hz, 1H), 8.25~8.18(d, J=8.4 Hz, 1H), 8.11~7.97(t, J=15.8 Hz, 3H), 7.92~7.88(d, J=8.0 Hz, 1H), 7.10~7.04(d, J=8.8 Hz, 2H), 6.66~6.62(d, J=8.0 Hz, 2H), 4.63~4.58(m, 1H), 4.38~4.31(m, 2H), 4.23~4.16(m, 2H), 3.61~3.57(m, 1H), 2.87~2.80(m, 1H), 2.70~2.62(m, 1H), 2.13~2.06(dd, J=12.2, 8.0 Hz, 1H), 1.73~1.65(m, 1H), 1.64~1.54(m, 3H), 1.52~1.40(m, 7H), 1.10~1.03(m, 1H), 0.93~0.77(m, 30H)；¹³C NMR(100 MHz, DMSO), δ:174.34, 172.20, 171.85, 171.12, 171.00, 156.36, 130.57, 128.03, 115.37, 57.42, 54.77, 50.96, 50.50, 41.41, 41.27, 40.56, 40.35, 40.15, 39.94, 39.73, 39.52, 39.31, 36.98, 30.42, 24.64, 24.58, 24.41, 23.59, 23.46, 23.36, 22.19, 22.11, 21.69, 18.87, 18.86, 17.44, 15.61, 11.26；LCMS计算值C₃₈H₆₂N₆O₇ [M+H]⁺ 715.47，[M+Na]⁺ 737.49，实测值[M+H]⁺ 715.47，[M+Na]⁺ 737.49。

  1.3   Thermoactinomide A的抑菌活性实验

  抑菌实验的测定方法参照文献提供的CLSI-M27A3稀释法^[10]。

  2.   结果与讨论

  2.1   DIPEA的添加量对直链肽合成的影响

  为了提高带保护基的直链肽的合成纯度，省去对带保护基的直链肽进行分离纯化的步骤，分别采用HATU和TBTU作为缩合试剂，研究DIPEA的添加量对氨基酸链连接的影响。控制树脂与第1个氨基酸相连时DIPEA的添加量(6倍化学计量)，研究合成路线中从(2)到(3)添加不同DIPEA的量对直链肽(4)纯度的影响，结果如表 1所示，采用TBTU为缩合试剂时，随着DIPEA的量的增加，直链肽的纯度在不断提升，但化学计量超过5倍后，直链肽纯度的不再增加；采用HATU为缩合试剂时，随着DIPEA的量的增加，直链肽的纯度在不断下降，可能是环境中的碱性增加导致氨基酸活泼酯生成的较快，伴随着杂质的增多。鉴于HATU的价格较TBTU高，缩合试剂采用TBTU，同时选用5倍化学计量的DIPEA与TBTU对氨基酸链进行连接。

  表 1

  

  表 1  DIPEA的添加量不同对直链肽(4)纯度的影响

  Table 1.  Effect of the amount of different DIPEA added on the purity of linear peptide(4)

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  Stoichiometry of DIPEA	Yield of 4/%
  	HATU	TBTU
  2	58.6	45.9
  3	82.6	74.8
  4	82.7	77.9
  5	79.3	84.1
  6	79.5	84.3

  2.2   溶剂对直链肽环合的影响

  在直链肽环合过程中，使用无水DCM作为溶剂进行的环合，后续减压蒸馏溶剂时，操作相对简单；而使用含有DMF的DCM混合溶剂进行环合后，在减压蒸馏时，首先需要使用水泵除去混合液中的DCM，其次再使用油泵在液氮的辅助条件下除去DMF，工作量和操作步骤相对增加，但环肽得率会相对提高。为此实验通过研究合成路线中从(4)到(5)对直链肽使用不同比例的无水DCM和DMF进行溶解，从而研究溶剂对直链肽环合得率的影响，结果列于表 2。从表 2可知，采用不同比例的无水DCM和DMF混合液对环合收率有很大影响，随着DMF比例的增加，环合收率也在不断提高。当DCM和DMF的体积分别为300和200 mL时，产物的收率为73.3%，此产率虽略低于随后DMF比例增加得到的环合产率，但考虑到后续对混合溶剂处理的工作量，因此采用该比例较为合适。

  表 2

  

  表 2  采用不同比例的无水DCM和DMF混合液对环合产物的影响

  Table 2.  Effect of different ratios of anhydrous DCM and DMF mixture on cyclization products

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  	V(DCM):V(DMF)/mL
  	500:0	400:100	300:200	200:300	100:400	0:500
  m(Cyclohexapeptide)/mg	96.6	274.9	366.3	372.6	369.0	375.3
  Yield of Cyclohexapeptide/%	19.3	55	73.3	74.5	73.8	75.1

  2.3   pH值对环合产率的影响

  通过控制环合体系中初始pH值，探究酸碱度对环合产率是否有一定的影响，实验结果如表 3所示。从表 3可知，在酸性和中性条件下，直链肽不能发生环合；碱性条件下能够发生，但并不是碱性越强环合收率越高，最适合的条件为pH=8.0左右，环合收率最高，达到73.1%，该结果可能是酸性和中性条件下氨基酸不能形成相应的活泼酯，碱性过强时容易造成线性肽不同程度的聚合，从而不能使线性肽发生自身缩合。

  表 3

  

  表 3  溶液的不同pH值对环合收率的影响

  Table 3.  Effect of different pH of solution on cyclization yield

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  	pH
  	6.0	7.0	7.5	8.0	8.5	9.0
  m(Cyclohexapeptide)/mg	0	0	199.0	366.3	365.5	228.5
  Yield of cyclohexapeptide/%	0	0	39.8	73.3	73.1	45.7

  2.4   Thermoactinomide A抑菌活性分析

  采用CLSI-M27A3稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)，研究Thermoactinomide A对4种革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度，同时以万古霉素为阳性对照，结果表 4所示。由表 4可知，Thermoactinomide A对肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae NCTC 7466、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ATCC 6051和ATCC 6633的抑菌效果不明显，对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213的最小抑菌浓度为32 μg/mL。

  表 4

  

  表 4  Thermoactinomide A的最小抑菌浓度(MIC, μg/mL)

  Table 4.  Antibacterial activities(MIC, μg/mL) of Thermoactinomide A

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  	Gram-positive bacteria
  	Streptococcus pneumoniae NCTC 7466	Staphylococcus aureus ATCC 29213	Bacillus subtilis ATCC 6051	Bacillus subtilis ATCC 6633
  Thermoactinomide A	64±2	32±2	＞128	＞128
  Vancomgcin	1±0.5	1±0.5	1±0.5	1±0.5

  3.   结论

  报道了一种天然抗菌环肽Thermoactinomide A的高效合成法。以笏甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸为原料，在Fmoc固相合成的基础上，通过优化N, N′-二异丙基乙胺(DIPEA)的投料量，获得纯度较高的直链肽，再通过优化环合体系中无水DCM和DMF混合液的配比以及初始pH值，获得环合收率较高的环肽Thermoactinomide A，这种快速高效合成方法的建立，结合其侧链具有裸露—OH的特点，为下一步对该化合物的改造提供了基础。最后通过抑菌活性实验结果表明，Thermoactinomide A对金黄色葡萄球菌有良好的抑菌活性，也为进一步研发新的抗菌药物提供了参考和理论依据。

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  图 1  Thermoactinomide A的结构式

  Figure 1  The structure of thermoactinoamide A

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  Scheme 1  Synthesis of thermoactinomide A

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  表 1  DIPEA的添加量不同对直链肽(4)纯度的影响

  Table 1.  Effect of the amount of different DIPEA added on the purity of linear peptide(4)

  Stoichiometry of DIPEA	Yield of 4/%
  	HATU	TBTU
  2	58.6	45.9
  3	82.6	74.8
  4	82.7	77.9
  5	79.3	84.1
  6	79.5	84.3

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  表 2  采用不同比例的无水DCM和DMF混合液对环合产物的影响

  Table 2.  Effect of different ratios of anhydrous DCM and DMF mixture on cyclization products

  	V(DCM):V(DMF)/mL
  	500:0	400:100	300:200	200:300	100:400	0:500
  m(Cyclohexapeptide)/mg	96.6	274.9	366.3	372.6	369.0	375.3
  Yield of Cyclohexapeptide/%	19.3	55	73.3	74.5	73.8	75.1

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  表 3  溶液的不同pH值对环合收率的影响

  Table 3.  Effect of different pH of solution on cyclization yield

  	pH
  	6.0	7.0	7.5	8.0	8.5	9.0
  m(Cyclohexapeptide)/mg	0	0	199.0	366.3	365.5	228.5
  Yield of cyclohexapeptide/%	0	0	39.8	73.3	73.1	45.7

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  表 4  Thermoactinomide A的最小抑菌浓度(MIC, μg/mL)

  Table 4.  Antibacterial activities(MIC, μg/mL) of Thermoactinomide A

  	Gram-positive bacteria
  	Streptococcus pneumoniae NCTC 7466	Staphylococcus aureus ATCC 29213	Bacillus subtilis ATCC 6051	Bacillus subtilis ATCC 6633
  Thermoactinomide A	64±2	32±2	＞128	＞128
  Vancomgcin	1±0.5	1±0.5	1±0.5	1±0.5

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