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  全叶马兰为菊科马兰属植物 (Kalimeris integrifolia Turcz.ex DC.), 别名全缘叶马兰、野白菊 (湖北)、黄花三草、扫帚花、扫帚鸡肠、全叶紫菀, 主要生于山坡、林缘、灌丛、路旁, 我国大部分地区均有分布, 也分布于朝鲜、日本、西伯利亚东部^[1]. 《中华本草》^[2]中记载, 全叶马兰味苦、性寒, 具有清热解毒、止咳、散瘀止血的功效.至今为止, 没有文章报道过全叶马兰的次级代谢产物的研究, 本课题组近年一直从事马兰相关研究, 从马兰中分离并成分包括甾体、萜类、黄酮、酚酸等多种类型, 并进行了肝细胞保护及抗肿瘤活性研究^[3~6].为了更加深入地研究马兰属植物的次生代谢产物, 阐明全叶马兰和马兰属各物种间的化学成分差异性, 我们对全叶马兰进行了化学成分研究, 从中分离纯化得到2个新的黄酮化合物, 运用HR-ESIMS, 1D和2D NMR等光谱技术确定新化合物的结构为Kalinturflavone A (1) 和Kalinturflavone B (2)(图 1).黄酮类化合物具有抑制MMP-9的生物活性^[7].本研究分别利用五种肿瘤细胞株HL-60, SMMC-7721, A-549, MCF-7和SW480对所分离得到的两个黄酮1和2进行活性测试, 但两者活性都很弱 (IC₅₀＞40 μmol/L).

  图 1  化合物1和2的结构图 Figure 1.  Structures of compounds 1 and 2

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  1   结果与讨论

  1.1   化合物1的结构鉴定

  黄色针状结晶 (甲醇), HR-ESI-MS给出化合物的分子式为C₁₉H₁₈O₉ (m/z 389.0894 [M-H]^-, 计算值为389.0878), 提示有11个不饱和度.在IR光谱中, 3419、1657、1615和1594 cm^-1处吸收带显示, 该化合物依次存在羟基、羰基、苯环, 经UV光谱 (λ_max) 在306 nm吸收带, 结合盐酸-镁粉反应阳性初步推断该化合物为一黄酮类化合物.由¹H NMR谱中低场单峰δ 12.35 (s, 1H) 显示此峰为羟基与羰基形成氢键后所出的峰, 通过HSQC二维相关谱发现氢谱中δ 6.98 (s, 1H) 与碳谱中δ 104.2 (C-3) 峰相关, 所以确定此峰为C环3号位的氢信号, 可进一步确定该化合物为黄酮类化合物; 氢谱中低场两个单峰信号δ 9.69 (s, 1H) 及9.33 (s, 1H) 为两个羟基信号, 两个双峰δ 7.31 (d, J＝1.6 Hz, 1H) 和7.24 (d, J＝1.6 Hz, 1H) 显示为黄酮AB系统中B环上2′-H和6′-H信号, 并且由于H-2′和H-6′信号未重叠, 所以可知B环上的取代基不对称, 因此可知3′和5′位的取代基分别为羟基和甲氧基, 这一点也可以通过HSQC和HMBC二维相关谱进行验证.由氢谱中高场区四个单峰信号δ 3.95 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.76 (s, 3H) 可知此化合物有四个甲氧基, 并结合上述结论可知A环全部被取代, 通过HMBC二维相关谱可知δ 3.83 (s, 3H, OCH₃) 与136.2 (C-6) 相关, 3.95 (s, 3H, OCH₃) 与148.1 (C-7) 相关, 3.76 (s, 3H, OCH₃) 与139.8 (C-4′) 相关, 3.89 (s, 3H, OCH₃) 与153.5 (C-5′) 相关, 并且12.35 (s, 1H, OH) 与144.6 (C-5), 136.2 (C-6), 106.5 (C-10) 相关, 9.33 (s, 1H, OH) 与148.1 (C-7), 130.7 (C-8), 141.4 (C-9) 相关, 所以6、7、4′及5′位上均为甲氧基; 9.33 (s, 1H, OH) 与130.7 (C-8) 相关, 9.69 (s, 1H, OH) 与150.9 (C-3′) 相关, 所以8和3′位为羟基 (图 2).综上所述, 并与文献[8~12]对照, 确定该化合物为5, 8二羟基-2-(3-羟基-4, 5-二甲氧苯基)-6, 7-二甲氧基-4H-色烯-4-酮 (图 1), 命名为Kalintur-flavone A, 其¹H NMR、¹³C NMR数据见表 1.

  图 2  化合物1和2的主要HMBC () 和ROESY () 相关 Figure 2.  Main HMBC () and ROESY () relevant of compounds 1 and 2

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  表 1  化合物1 (600/150 MHz, DMSO-d₆) 和2 (600/150 MHz, CDCl₃) 的NMR数据 Table 1.  NMR data of compounds 1 (600/150 MHz, DMSO-d₆) and 2 (600/150 MHz, CDCl₃)

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  No.	1			2
  	δH (J in Hz)	δC		δH (J in Hz)	δC
  2		163.6			164.2
  3	6.98 s	104.2		6.56 s	104.2
  4		182.9			182.7
  5		144.6			151.6
  5-OH	12.35 s			12.74 s
  6		136.2			136.5
  7		148.1			151.7
  8		130.7			123.1
  8-OH	9.33 s
  9		141.4			144.5
  10		106.5			106.7
  1'					174.4
  2'				2.80~2.78 m	41.1
  3'				1.41 d (7.2)	17.0
  4'				1.95~1.93 m, 1.72~1.69 m	26.8
  5'				1.09 t (7.6)	11.7
  6-OCH3	3.83 s	60.5		3.96 s	61.0
  7-OCH3	3.95 s	61.2		4.02 s	61.4
  1′		125.8			123.4
  2′	7.31 d (1.6)	108.1		7.76 d (8.8)	128.1
  3′		150.9		6.98 d (8.8)	114.4
  3′-OH	9.69 s
  4′		139.8			162.7
  5′		153.5		6.98 d (8.8)	114.4
  6′	7.24 d (1.6)	102.3		7.76 d (8.8)	128.1
  4′-OCH3	3.76 s	60.1		3.88 s	55.5
  5′-OCH3	3.89 s	56.0

  表 1  化合物1 (600/150 MHz, DMSO-d₆) 和2 (600/150 MHz, CDCl₃) 的NMR数据
  Table 1.  NMR data of compounds 1 (600/150 MHz, DMSO-d₆) and 2 (600/150 MHz, CDCl₃)

  1.2   化合物2的结构鉴定

  黄色粉末 (甲醇), HR-ESI-MS给出化合物的分子式为C₂₃H₂₄O₈ (m/z 427.1399 [M-H]^-, 计算值为427.1398), 提示有12个不饱和度.通过红外光谱、质谱、氢谱可初步了解该化合物与化合物1母核结构类似, 都是黄酮类化合物, 该化合物的氢谱碳谱与化合物1不同的是少了一个甲氧基、两个羟基, 多了两个甲基、一个亚甲基, 一个次甲基和一个羰基.由¹H NMR谱中δ 7.76 (d, J＝8.8 Hz, 2H), 6.98 (d, J＝8.8 Hz, 2H) 表示B环为单取代苯环, 并由HMBC二维相关谱可知δ 3.96 (s, 3H, OCH₃) 与136.5 (C-6) 相关, 4.02 (s, 3H, OCH₃) 与151.7 (C-7) 相关, 3.88 (s, 3H, OCH₃) 与162.7 (C-4′) 相关, 由此相关可知3个甲氧基的位置; 再由HSQC和¹H-¹H COSY二维相关谱可将两个甲基、一个亚甲基, 一个次甲基和一个羰基链接起来, 形成一个2-甲基丁酸酯基团, 基于A环上的氢除8位外全部被取代, 所以此链只能在8位与黄酮母核成酯, 并且通过ROESY二维相关谱可看到5′′位甲基氢与7位甲氧基上的氢有相关 (图 2).综上所述, 并与文献[13, 14]对照, 确定该化合物为5-羟基-6, 7-二甲氧基-2-(4'-甲氧基苯基)-4-氧代-4H-色烯-8-(2''-甲基丁酸酯) (图 1), 命名为Kalinturflavone B, 其¹H NMR、¹³C NMR数据见表 1.

  2   实验部分

  2.1   仪器与试剂

  质谱由Waters AutoSpec Premier P776和Xevo TQ-S质谱仪测定 (美国Waters公司生产); 紫外光谱由Shimadzu double-beam210A型紫外分光光度计 (日本岛津) 测定, 熔点由WRS-2型熔点仪 (上海仪电物理光学仪器公司) 测定, 比旋光度由SEPA-300数字型旋光仪 (日本Horiba) 测定, 核磁共振数据由Bruker Avance Ⅲ-600测定 (德国Bruker公司生产), 以TMS为内标; 分析型和制备型HPLC分别为Agilent 1100 HPLC型和Agilent 1200 HPLC型, 检测器为DAD检测器, 分析型泵为四元泵, 制备型泵为二元泵, 进样器为自动进样器 (美国安捷伦公司生产), 分析型色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18;制备型色谱柱同为Agilent Zorbax SB-C18;正相柱层析硅胶 (80~100目和200~300目) 以及GF₂₅₄预制硅胶板均由青岛海洋化工厂生产; Rp-18反相硅胶 (40~75 μm) 由日本Fuji silysia化学公司生产; Sephadex LH-20为瑞典Amersham Biosciences公司产品.

  2.2   植物材料

  全叶马兰药材2014年9月采于安徽合肥市磨店乡, 经安徽中医药大学中药标本中心杨青山老师鉴定为菊科马兰属全叶马兰 (Kalimeris integrifolia Turcz.ex DC.) 干燥全草.凭证标本 (No. 201409) 存放在安徽中医药大学天然药物化学研究组.

  2.3   提取分离

  全叶马兰干燥地上部分13 kg, 80%乙醇回流提取3次, 每次2 h, 合并提取液减压浓缩后, 得到2568 g浸膏, 直接采用正相硅胶柱层析以二氯甲烷-甲醇为流动相进行梯度洗脱, 洗脱后共得到M1~M7七个部分. CH₂Cl₂/MeOH (V：V＝30：1, 20：1) 洗脱部位M4通过正相硅胶柱层析, 以[V(石油醚)：V(乙酸乙酯＝50：1, 30：1, 20：1, 15：1, 10：1, 5：1, 3：1, 2：1, 1：1]梯度洗脱, 薄层色谱 (TLC) 检识后合并相似流份共得到4个组分 (M₄1~M₄4), M₄1放置后母液经正相硅胶柱层析以[V(石油醚)：V(乙酸乙酯＝30：1, 20：1, 15：1, 10：1, 5：1, 3：1, 2：1, 1：1]梯度洗脱, TLC检识后合并相似流份共得到7个组分 (M₄₁1~M₄₁7), M₄₁4经正相硅胶柱层析[V(石油醚)：V(丙酮)＝15：1, 10：1, 5：1, 3：1, 2：1, 1：1]梯度洗脱, TLC检识后合并相似流份共得到9个组分 (M₄₁₄1~M₄₁₄9), M₄₁₄3放置后析出以黄色沉淀, 将沉淀与母液分离后, 沉淀溶解后, 葡聚糖凝胶柱层析纯化后得到化合物2 (316.7 mg); M₄₃5经正相硅胶柱层析[V(石油醚)：V(丙酮)＝15：1, 10：1, 5：1, 3：1, 2：1, 1：1]梯度洗脱, TLC检识后合并相似流份共得到9个组分 (M₄₃₅1~M₄₃₅9), M₄₃₅6葡聚糖凝胶柱层析纯化后得到化合物1 (30.6 mg).

  Kalinturflavone A (1):黄色针状晶体, 熔点251~253 ℃; ¹H NMR和¹³C NMR数据见表 1; UV (MeOH) λ_max[lg ε/(L·mol^-1·cm^-1)]: 306 (4.35), 207 (4.52) nm; IR (KBr) ν_max: 3419, 1657, 1615, 1594, 1485, 1458, 1430, 1387, 1231, 1106, 1031, 1000, 960, 845 cm^-1; HR-EI-MS calcd for C₁₉H₁₇O₉ ([M-H]^- 389.0878, found 389.0894.

  Kalinturflavone B (2):黄色粉末, 熔点110~112 ℃, [α]_D¹⁹-3.4 (c 0.013, CHCl₃); ¹H NMR和¹³C NMR数据见表 2; UV (CHCl₃) λ_max[lg ε/(L·mol^-1· cm^-1)]: 327 (4.30), 283 (4.23) nm; IR (KBr) ν_max: 3443, 3427, 2969, 2937, 1756, 1657, 1603, 1577, 1508, 1487, 1463, 1431, 1376, 1262, 1220, 1184, 1114, 1067, 1030, 1012, 834 cm^-1; HR-ESI-MS calcd for C₂₃H₂₃O₈ [M-H]^-427.1398, found 427.1399.

  辅助材料 (Supporting Information)新化合物1和2的UV, IR谱, HR-EIMS谱, 1D NMR和2D NMR谱图.这些材料可以免费从本刊网站 (http://sioc-journal.cn/) 上下载.

• 1. [1]

     中国科学院中国植物志编辑委员, 中国植物志, 第74卷, 科学出版社, 北京, 1985.Chinese Flora Editorial Board of Chinese Academy of Sciences Flora of China, Vol. 74, Science Press, Beijing, 1985 (in Chinese).

  2. [2]

     国家中医药管理局《中华本草》编委会, 中华本草, 上海科学技术出版社, 上海, 1999.Chinese Herbal Editorial Board Chinese Herbal, Shanghai Science and Technology Press, Shanghai, 1999 (in Chinese).

  3. [3]

     季鹏, 王国凯, 刘劲松, 罗争辉, 刘吉开, 王刚, 天然产物研究与开发, 2014, 26, 212.Ji, P.; Wang, G. K.; , Liu, J. S.; Luo, Z. H.; Liu, J. K.; Wang, G. Nat. Prod. Res. Dev. 2014, 26, 212 (in Chinese).

  4. [4]

     钟文武, 刘劲松, 张聪佴, 陈爱民, 许应生, 王刚, 广西植物, 2012, 32, 261. doi: 10.3969/j.issn.1000-3142.2012.02.023Zhong, W. W.; Liu, J. S.; Zhang, C. E.; Chen A. M.; Xu, Y. S.; Wang G. Guihaia 2012, 32, 261 (in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1000-3142.2012.02.023

  5. [5]

     王国凯, 刘劲松, 张聪佴, 王诤, 蔡百祥, 王刚, 中药材, 2015, 38, 82.Wang, G. K.; Liu, J. S.; Zhang, C. E.; Wang, Z.; Cai, B. X.; Wang, G. Chin. Med. Mater. 2015, 38, 82 (in Chinese).

  6. [6]

     刘劲松, 王国凯, 王刚, 余波, 王飞, 刘吉开, 中成药, 2010, 32, 462. doi: 10.3969/j.issn.1001-1528.2010.03.033Liu, J. S.; Wang G.; Wang, G. K.; Yu, B.; Wang, F.; Liu, J. K. Chin. Trad. Pat. Med. 2010, 32, 462 (in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1001-1528.2010.03.033

  7. [7]

     张骥, 申鹏, 陆涛, 余丹妮, 李卉, 杨国忠, 化学学报, 2011, 69, 383.Zhang, J.; Shen, P.; Lu, T.; Yu, D.; Li, H.; Yang, G. Z. Acta Chim. Sinica 2011, 69, 383 (in Chinese).

  8. [8]

     Tchinda, A. T.; Mouokeu, S. R.; Ngono, R. A.; Ebelle, M. R.; Mokale, A. L.; Nono, D. K.; Frédérich, M. Nat. Prod. Res. 2015, 29, 1990. doi: 10.1080/14786419.2015.1022541

  9. [9]

     Bui, M. L.; Grayer, R. J.; Veitch N. C.; Kiteb, G. C.; Trana, H.; Nguyena, Q. K. Biochem. Syst. Ecol. 2004, 32, 943. doi: 10.1016/j.bse.2004.03.001

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      Fushiya, S.; Kishi, Y.; Hattori, K.; Batkhuu J.; Takano, F.; Singab, A. N.; Okuyama, T. Planta Med. 1999, 65, 404. doi: 10.1055/s-1999-14084

  11. [11]

      Parmar, V. S.; Bisht, K. S.; Sharma, S. K.; Jain, R.; Taneja, P.; Singh, S.; Simonsen, O.; Boll, P. M. Phytochemistry 1994, 36, 507. doi: 10.1016/S0031-9422(00)97104-8

  12. [12]

      Xu, N. S.; Yang, H. M.; Cui, M.; Song, F. R.; Liu, Z. Q.; Liu, S. Y. Chin. J. Chem. 2012, 30, 1433. doi: 10.1002/cjoc.v30.7

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      Zhang, Y. L.; Jiang, L. L.; Xiao, T. S.; Li, Y. B. J. Asian. Nat. Prod. Res. 2015, 17, 717. doi: 10.1080/10286020.2014.992887

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      Maldonado, E.; Toscano, R. A.; Mancera, C.; Tripp, M. T.; Ortega, A. Phytochemistry 1992, 31, 1003. doi: 10.1016/0031-9422(92)80203-Q

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  图 1  化合物1和2的结构图

  Figure 1  Structures of compounds 1 and 2

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  图 2  化合物1和2的主要HMBC () 和ROESY () 相关

  Figure 2  Main HMBC () and ROESY () relevant of compounds 1 and 2

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  表 1  化合物1 (600/150 MHz, DMSO-d₆) 和2 (600/150 MHz, CDCl₃) 的NMR数据

  Table 1.  NMR data of compounds 1 (600/150 MHz, DMSO-d₆) and 2 (600/150 MHz, CDCl₃)

  No.	1			2
  	δH (J in Hz)	δC		δH (J in Hz)	δC
  2		163.6			164.2
  3	6.98 s	104.2		6.56 s	104.2
  4		182.9			182.7
  5		144.6			151.6
  5-OH	12.35 s			12.74 s
  6		136.2			136.5
  7		148.1			151.7
  8		130.7			123.1
  8-OH	9.33 s
  9		141.4			144.5
  10		106.5			106.7
  1'					174.4
  2'				2.80~2.78 m	41.1
  3'				1.41 d (7.2)	17.0
  4'				1.95~1.93 m, 1.72~1.69 m	26.8
  5'				1.09 t (7.6)	11.7
  6-OCH3	3.83 s	60.5		3.96 s	61.0
  7-OCH3	3.95 s	61.2		4.02 s	61.4
  1′		125.8			123.4
  2′	7.31 d (1.6)	108.1		7.76 d (8.8)	128.1
  3′		150.9		6.98 d (8.8)	114.4
  3′-OH	9.69 s
  4′		139.8			162.7
  5′		153.5		6.98 d (8.8)	114.4
  6′	7.24 d (1.6)	102.3		7.76 d (8.8)	128.1
  4′-OCH3	3.76 s	60.1		3.88 s	55.5
  5′-OCH3	3.89 s	56.0

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