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• 时代在进步，人类对食品、化工、农业、环境、生物医学等领域的分析检测技术要求越来越高。高效液相色谱(HPLC)是物质分离检测的重要技术。色谱柱是HPLC系统分离混合物的核心部件，色谱柱性能的优劣直接关系到分离效果。传统的液相色谱基本采用填充柱，虽然它的制备技术不断改进，应用领域不断拓展，但其填充工序繁琐、柱填料种类单一、柱压较高、分离效率与填料粒径、流动相流速的矛盾等都限制了其发展^{[1, 2]}。为了有效解决这些问题，诺贝尔化学奖获得者Synge于1952年首次提出了整体固定相(Monolithic stationary phase)概念^[3]。整体柱是由单体、交联剂、致孔剂和引发剂的混合液在柱管内原位聚合成整体连续的多孔材料，可根据需要对整体材料进行修饰改性。通过调整聚合单体的结构、比例、聚合温度、时间等条件，可以制备具有不同孔径及分布的功能性整体柱，以适应不同需求和分离模式。整体柱通常具有制备简单、通透性好、柱压低的特点^[4]，近年来已经被广泛应用在HPLC和毛细管电色谱(CEC)^[5]技术中。HPLC整体柱可以分离分析小分子化合物及蛋白质。CEC可以用于分离带电化合物、中性化合物及手性化合物。整体柱按照基质材料的化学性质可以分为无机硅胶整体柱、有机聚合物整体柱、有机-无机杂化聚合物整体柱等三类^[6]。本文将在前人综述的基础上，结合最新研究成果，侧重对不同类型HPLC整体柱的特点、改性方法及应用前沿进行总结论述，对于已经有较多文献报道的CEC整体柱则不再赘述。

  1.   无机硅胶整体柱

  最早的无机类整体柱是在硅胶的基础上制成，与有机聚合物整体柱相比，无机硅胶整体柱具有耐高温、机械强度高、通透性好等优势。此类整体柱通常以四烷氧基硅烷(TMOS)为主要原料，聚环氧乙烷或聚乙二醇为致孔剂，采用溶胶-凝胶法制备而成，可通过柱后衍生得到不同性能的整体柱。目前已经商品化的无机硅胶整体柱主要有SilicaROD^TM[7]、PrepRODs^TM、Chromonolith^{TM[8, 9]}。成品硅胶整体柱主要为网架结构和颗粒堆积聚集型结构，孔隙率大于80%。柱体中的微米级大孔使其拥有良好的通透性，纳米级中孔的存在则保证柱体具有一定的比表面积和柱容量^[10]，大孔和中孔的同时存在使它比传统的填充柱有更好的渗透性、机械强度高、化学稳定性好，可以在较高的流速下仍保持较低的压力。Itoh等^[11]利用硅胶整体柱中纳米尺度的中孔实现了对纳米颗粒和小分子物质的同时分离，其中纳米颗粒是由于水动力效应被分离；而小分子则通过与中孔中固定相的表面相互作用而分离。目前，对于无机硅胶整体柱的研究主要集中于制备方法，不同方法制备的柱子在性能和结构上都呈现出差异。传统的溶胶-凝胶法制备无机硅胶整体柱时首先使用稀氢氧化钠、稀盐酸对反应容器的管壁进行预处理，以使硅胶骨架与管壁有效键合形成Si-O-Si-O的网络骨架，这样制成的整体柱更加均匀，机械性能好不易弯曲开裂，但缺点是操作步骤繁杂、经济效益低。为了解决这些问题，在无机填充柱的基础上诞生了干凝胶法^[12]、颗粒固载法和颗粒熔融法，这种在普通填充柱上进行修饰得到的无机整体柱机械强度好、化学性质稳定，特别适合一些极性小分子的分离。

  尽管此类整体柱优点诸多，但仍存在一些缺陷和不足，如硅胶整体柱在凝胶的制备和干燥过程中极易出现开裂和弯曲的问题，致使其制备技术曾长期被日本一些公司所垄断。其次，硅胶整体柱需要包覆等后续步骤才能投入使用，且修饰步骤不能与制备步骤同时进行，这无疑增加了工作量。除此之外，柱体应用范围受到pH的限制，原材料选择范围窄、对于分离生物大分子不适用等原因使得越来越多的研究者把目光投向了有机-无机杂化整体柱^[13]。

  2.   有机聚合物整体柱

  有机聚合物整体柱是用不同的有机单体、交联剂及一种或多种致孔剂在引发剂的引发下进行原位共聚而成，其中致孔剂的作用是在整体柱中形成尺寸不同、形状各异的孔道。用于制备有机聚合物整体柱的体系主要为三种：聚丙烯酰胺体系、聚甲基丙烯酸酯体系和聚苯乙烯体系^[14]，这三种体系现已发展得较为成熟。不同体系采用不同的聚合原料聚合，得到的整体柱性能也有所差异。对于有机聚合物整体柱来说，除了聚合原料，聚合条件控制对成品柱体的性能来说至关重要。不同聚合条件下制备的整体柱在骨架形态、孔径大小、孔的形貌及分布、机械强度等方面均有差别，这些差别主要由聚合时间和温度、单体与交联剂的浓度、引发剂的比例、致孔剂的组成及种类等方面共同决定^[4]。相比于无机整体柱，有机聚合物整体柱具有选材范围广、孔径均匀、渗透性好、传质速率高和使用不受pH限制等优点，是目前研究的热点。已经商品化的有机聚合物整体柱主要为CIM^TM。近年来，在食品^[15]、医药^{[16, 17]}、农学^[18]等领域的推动下，以三类传统有机聚合物整体柱为基础衍生出的有机分子印迹整体柱受到了广泛关注。这种分子特异性识别材料合成技术^[19~21]与原位聚合整体柱技术相结合诞生的产物，既解决了分子印迹聚合物制备步骤复杂繁琐的问题，又赋予整体柱选择性高、重现性好及使用寿命长的特点，一经报道便成为分析化学领域的焦点和研究热点^[22]。目前，分子印迹有机聚合物整体柱已经成为分子印迹技术发展的重要方向^{[20, 23]}，常用的功能单体主要有甲基丙烯酸(MAA)、丙烯酰胺(AM)、4-乙烯基吡啶(4-VP)等^[22]。由于其柱压低、通透性好、传质快、使用方便等特点，已成功应用于HPLC和CEC技术中，尤其是在手性物质的分离与分析^[24]、蛋白质组学研究^[25~27]等方面具有极好的应用前景。

  2.1   聚丙烯酰胺类整体柱

  图式 1列出了聚丙烯酰胺体系常用的功能单体和交联剂。由于该体系选用的单体大多易溶于水，一般采用水溶性的过硫酸铵作引发剂。此类整体柱具有良好的生物兼容性，非常适用于蛋白质、多肽等生物大分子的分离。聚合时控制合适的聚合条件(如反应温度、引发剂用量、交联剂及致孔剂比例、致孔剂的组成等因素)可以得到较理想的孔径分布，提高柱效。研究表明^[28]，预聚液相分离的过程是孔形成的关键。若同时增加交联剂用量和过硫酸铵的浓度，则会促进相分离过程，从而通过增加生成聚合物链之间的疏水相互作用而在凝胶基质中形成通孔，进一步降低流动阻力，增加柱子的机械强度，延长使用寿命。为了满足不同色谱技术的分离要求，可在原料中添加具有特定功能的单体，例如在预聚液中加入N-烯丙基二甲基胺可以得到阴离子交换柱；若加入丙烯酸可以得到阳离子交换色谱柱。除此之外，Chocholouskova等^[29]将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)作为功能单体添加到聚合物中来改变热稳定性和极性，并探讨了其浓度对聚甲基丙烯酸酯整体柱性能的影响，通过流动相组成和工作温度的变化对不同极性小分子的保留时间进行了研究。聚丙烯酰胺类整体柱的缺点是质地软、孔径不均匀、易溶胀、性能不稳定等，正是这些难题的存在限制了聚丙烯酰胺整体柱的应用，有关报道主要集中在20世纪末^[30]和21世纪初^{[31, 32]}，近五年的报道极少。

  图式 1

  

  图式 1.  聚丙烯酰胺类整体柱常用的功能单体和交联剂

  Scheme 1.  The functional monomer and crosslinking agent of polyacrylamide monolithic column

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  2.2   聚甲基丙烯酸酯类整体柱

  聚甲基丙烯酸酯体系最早是由Svec等^[33]在1996年报道的。该类整体柱主要以甲基丙烯酸酯(如甲基丙烯酸丁酯(BMA)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA))、N-烯丙基二甲基胺、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)等为功能单体，以二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)为交联剂，由过氧化苯甲酰(BPO)或偶氮二异丁腈(AIBN)引发聚合。目前，有机聚合物整体柱中大部分是以甲基丙烯酸酯类为基质的，最典型的就是前面提到的已经商品化的CIM^TM。聚甲基丙烯酸酯类整体柱具有选材范围广、稳定性好、使用时不受pH限制和易于改性等优势。关于此类整体柱的报道主要涉及利用不同的氨基化合物与GMA中的环氧基团反应，以及酸性条件下由环氧物质开环成二醇的反应等。由于该类整体柱选材范围广，不同单体所含的酯基部分不同，制成的整体柱性质会随酯基部分变化而变化^[34]：若酯基部分含有烷基，柱体疏水程度可由甲基丙烯酸酯所占比例和烷基链的长度来调整，得到的整体柱可在反相色谱模式下分离苯的同系物或蛋白质；若酯基部分含有环氧基团，则易于通过水解、胺解反应引入新的功能基团，常应用于离子交换色谱和亲和色谱^[35]。致孔剂是孔形成的关键，不仅要考虑致孔剂与聚合体系的相容性和极性，致孔剂的组成及各成分的比例决定了单体浓度和相分离的时间，一旦改变单体的组成或比例就要对致孔剂做出相应的调整^[36]。致孔剂通常由一种或几种小分子醇类组成，如甲醇、乙醇、正丙醇、1, 4-丁二醇、环己醇和十二醇等。随着对致孔剂作用机理的深入研究，常温离子液体^[37]、高内向乳液^[38]、低共熔溶剂等也成为整体柱的一类新型致孔剂，其中高内向乳液常应用于聚苯乙烯体系中，低共融溶剂则更多应用于CEC整体柱中。Wang等^[39]以离子液体为致孔剂成功制备了质地均匀、渗透性好的聚甲基丙烯酸酯类整体柱，并将其成功运用于HPLC中的小分子分离。研究表明，交联剂和致孔剂的比例共同决定着整体柱的孔径分布和孔隙率。一般来讲，交联剂过量，会使交联程度增加，柱体收缩严重，柱压较高，但是由于形成的柱体孔径小、比表面积大，对小分子物质的分离有利^[40]。聚合时间和温度也会对柱体内部结构造成影响，聚合程度不完全时也有可能得到性能好的柱子，具体工艺条件要看分离要求和对温度、时间的灵活掌控。

  该类整体柱虽然选材组合多样但制备方法却相对单一且简单，一般是将预聚液混匀灌入碱处理后的石英毛细管中，脱气后以热或光源原位引发自由基聚合，聚合完成后把致孔剂除去得到柱体，一步即可完成。Han等^[41]利用热诱导相分离法制备了P(MMA-co-GMA)整体柱，该整体柱在酶固定化方面展现出良好的性能。Simone等^[42]采用γ-射线引发聚合制备的聚甲基丙烯酸酯基整体毛细管柱，优化实验条件后分离出具有不同疏水性和广泛分子量的九种蛋白质。Currivan等^[43]创新性地采用两步聚合法制备了两性甲基丙烯酸酯基聚合物整体柱，第一步合成的骨架不做修饰直接在第二步中起分离纯化作用，内部结构主要由第二步形成，这样制备的整体柱对酚、酸、磺酮类、核苷和核酸起到较好的分离效果。同其他两类有机聚合物整体柱一样，分子印迹技术的引入赋予了聚甲基丙烯酸酯类整体柱特异性识别功能，改性后的此类整体柱在物质的“追踪”和检测方面发挥重要作用。Guo等^[44]以甲基丙烯酸(MAA)、EGDMA为原料，以瘦肉精克仑特罗为模板成功制备有机分子印迹整体柱，并建立了一种分子印迹整体柱与二维液相色谱结合分析法，对猪肝和猪尿中盐酸克仑特罗进行了检测和分析。分子印迹技术的加入所带来的“靶向性”识别功能，极大地降低了由于柱体不均匀、易溶胀造成的比表面积小、性能下降的影响，是该类整体柱未来发展的主要方向之一。

  2.3   聚苯乙烯类整体柱

  聚苯乙烯类整体柱是指以苯乙烯、氯甲基苯乙烯为单体，二乙烯基苯为交联剂，结合甲醇、乙醇、甲苯等不同的致孔剂，在AIBN或BPO的引发下共聚成具有分离性能的整体柱材料。由于苯环的存在使此类整体柱具有一定的疏水性，常被用于反相或疏水色谱中分离检测生物大分子和多肽^[34]。2013年，Tomohiko等^[45]在金属离子和非离子表面活性剂的作用下制备了低压聚苯乙烯整体色谱柱，实验证明其具有很好的耐酸性，非常适用于分离酸性和中性大分子物质。随着聚苯乙烯类整体柱技术的深入研究，逐渐向着检测小分子的方向发展。2016年，Grzywinski等^[46]制备了超交联胆固醇基聚苯乙烯整体柱，研究表明，在含有7%的甲基丙烯酸胆甾醇酯和1%的甲苯的混合物中聚合而成整体柱，其表面积为452m²/g，分离苯时理论塔板数可达63000板/m，此类整体柱可用于小分子化合物及蛋白质的分离。2017年，许涵秋^[47]以二甲亚砜/正十二醇为二元致孔剂用于聚苯乙烯整体柱合成，所制备的整体柱对小分子与大分子化合物均有良好的分离效果。为了解决此类整体柱应用范围窄的问题，越来越多的研究者对其进行了改性，得到了较好的效果。2016年，Koriyama等^[48]将聚苯乙烯整体柱接枝热敏聚合物PNIPAAm进行改性，制备了对固醇类等生物活性物质有较好分离作用的聚苯乙烯毛细管整体柱。除此之外，还可以将苯乙烯作为功能单体加入聚甲基丙烯酸酯整体柱中，对其进行改性。2017年，Mao等^[49]用原位聚合法一步合成了具有离子液体和苯乙烯双官能团的PEGDMA毛细管整体柱材料(见图 1)，极大地简化了制作步骤，避免了二次修饰的麻烦，为整体柱的制备和修饰提供了新思路。尽管聚苯乙烯类整体柱出现较早，制备方法比较成熟，但仍面临单体和交联剂选择范围窄、修饰手段多为柱后衍生、柱体疏水性太强造成应用范围窄等问题，如何采用带有不同官能团的单体或新型交联剂制备出极性不同、功能多样化、适用范围广的聚苯乙烯类整体柱成为今后主要的研究方向。

  图 1

  

  图 1.  原位共聚法一步合成离子液体和苯乙烯双官能团改性的聚二甲基丙烯酸乙二醇酯整体柱的方案^[49]

  Figure 1.  Scheme for synthesis of the monolithic column with ionic liquid and styrene-modified bifunctional group by a single-step in situ copolymerization^[49]

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  3.   有机-无机杂化整体柱

  整体柱表面的物理化学性质、对溶剂和溶质的保留程度、孔隙率和孔径分布、机械强度等因素决定其分离性能和应用范围。原位聚合得到的有机聚合物整体柱通常会存在一定的孔径分布，导致其分离小分子化合物时扩散严重、柱效差，所以用HPLC分离小分子化合物时，一般使用无机硅胶整体柱和有机聚合物骨架制成的CEC整体柱，而生物大分子及聚合物的分离多见于有机聚合物整体柱。这说明无论是无机硅胶整体柱还是有机聚合物整体柱，都存在各自的独特优势和一些无法避免的缺陷，有机-无机杂化整体柱的出现在一定程度上解决了这个难题。有机-无机杂化整体柱结合了有机聚合物整体柱和无机硅胶整体柱的优点^[50]，既没有有机聚合物整体柱在溶剂中易发生溶胀、稳定性差的问题，又避免了无机硅胶整体柱制备步骤繁琐、柱后二次衍生等问题^{[51, 52]}，已经在许多领域发挥着重要作用，其中具有代表性的研究成果汇总于表 1中。

  表 1

  

  表 1  有机-无机杂化整体柱的研究成果

  Table 1.  The achievements of hybrid organic-silica monolithic columns

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  硅单体	有机单体	分离(或识别)物质	文献
  TMOS	C18-TMS a	多环芳烃，芳香醛，酮类	[53]
  TMOS/γ-MAPS b	VPBA c	含顺式二醇的生物分子，糖蛋白	[57]
  TMOS/VTMS d	AETAe	核苷，核苷酸	[58]
  POSS	BPADMAf or EDMA	烷基苯，苯酚，苯胺，多环芳烃	[59]
  TMOS/γ-MAPS	VPBA	含顺式二醇的化合物，烷基苯，酰胺，苯胺	[51]
  TEOS/AEAPTESg/γ-MAPS	VPBA	含顺二醇生物分子	[60]
  POSS	溴化1-乙烯基-3-(全氟苄基)-咪唑鎓	烷基苯，多环芳烃，核苷，卤代化合物	[61]
  IMSNh	C18 monomer	硫脲，苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯	[50]
  POSS	AM	胺，核苷，硝基苯胺	[62]
  TEOS/AEAPTES	CTABi	凝血酶	[63]
  aC18-TMS: N-十八烷基二甲基[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]氯化铵；bγ-MAPS: 3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷；cVPBA: 4-乙烯基苯基硼酸；d VTMS:乙烯基三甲氧基硅烷；e AETA: [2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基甲基硫酸铵；f BPADMA:双酚A二甲基丙烯酸酯；gAEAPTES: N-(β-氨基乙基)-γ-氨基丙基三乙氧基硅烷；hIMSN:介孔二氧化硅纳米粒子；iCTAB:十六烷基三甲基溴化铵

  Hayes等^[53]首次制备了有机-硅胶杂化整体柱并将其用于CEC中，实验证明该整体柱对多环芳烃、苯衍生物、醛和酮有较好的分离效果。其中值得一提的是，在反应过程中毛细管内壁的硅羟基也参与了缩聚反应，使柱体与毛细管紧密结合，这与聚合前对石英管或金属管内表面进行前处理的方法有异曲同工之妙。Zhang等^{[54, 55]}在无孔二氧化硅纳米颗粒上接枝聚丙烯酰胺线性“刷子”，得到的杂化整体柱可以通过亲水作用分离出完整的糖蛋白，在疾病诊断方面有重要意义。Aydogan等^[56]在甘油单丙烯酸酯(GMM)和EDMA中添加了经过前处理的二氧化硅纳米颗粒，制成的杂化整体柱可用于亲水高效液相色谱(HILIC)中分离极性小分子化合物。

  有机-无机杂化整体柱制备方法通常是在溶胶-凝胶过程中将功能单体引入，避免再次修饰的麻烦。由于传统溶胶-凝胶过程本身操作就较为繁杂，近年来出现的“一锅法”^{[50, 51, 57, 60]}省略了溶胶-凝胶步骤(见图 2)，极大地简化了此类整体柱的制作过程。随着有机-无机杂化整体柱逐渐成为研究热点^[64]，其制备方法也变得多样化，Ou等^[65]曾在这方面进行过详细的整理和总结。Wang等^[58]在“一锅法”的基础上进行了改进，在溶胶混合物和有机单体的预聚液中加入水溶性引发剂AIBA，得到了均质体系，通过有机单体的缩聚和共聚制备了亲水和强阴离子交换相互作用(HI-SAX)混合模式的有机-二氧化硅杂化整体柱，并实现了基本的核酸碱基和核苷的分离。鉴于以无机硅胶整体柱为基础的制备工艺对硅胶基质的孔径分布、通透性、稳定性等要求较高，一些科研工作者尝试用多面体齐聚倍半硅氧烷(POSS)代替硅胶前驱体，利用其本身具有的微观结构改善整体柱的各项性能^[66]。实验表明，POSS的引入能够有效增加杂化整体柱的热稳定性、抗氧化性和机械强度，同时能够减少聚合物整体柱的溶胀现象^[59]。

  图 2

  

  图 2.  IMSN-C18有机-无机杂化整体柱的制备方案^[50]

  Figure 2.  Scheme for preparation of IMSN-C18 organic-inorganic hybrid monolithic column^[50]

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  Shan等^[61]用溴化1-乙烯基-3-(全氟苄基)-咪唑鎓为功能单体制备了一种新型杂化整体柱(见图 3)，其中无机POSS单体本身具有交联功能，无需再添加额外的交联剂，制备步骤简单，得到的整体柱对小分子有较好的分离效果。翁中亚等^[62]以AM为有机功能单体、POSS为无机硅单体、四氢呋喃(THF)为致孔剂制备了孔径均匀、柱压低、柱效高、重现性好的亲水型杂化整体柱。为了得到可以应用在某些特殊领域的有机-无机杂化整体柱，可以在制备好的柱体上进行修饰改性。

  图 3

  

  图 3.  POSS-VIMPFP杂化整体柱的合成过程^[61]

  Figure 3.  Synthesis process of POSS-VIMPFP hybrid monolithic column^[61]

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  Zhao等^[63]在凝血酶的作用下采用一步共凝法制备了有机-无机杂化整体柱，并用带有配体的纳米金对其进行修饰(见图 4)，制成的杂化整体柱对凝血酶蛋白质的“追踪”和检测有极好的效果。除了对整体柱进行改性的方法，还可以将分子印迹技术与有机-无机杂化整体柱技术结合，制备出具有特异性识别功能的整体柱。单纯的有机分子印迹整体柱在不同溶剂中易溶胀和收缩，使聚合物的形态和结构发生变化，降低了对分子的识别能力^[19]，而加入无机材料制成的有机-无机杂化印迹整体柱机械强度高、稳定性好、不易受溶剂影响，可以在HPLC中更好地发挥作用。Yang等^[67]以杀虫剂残留物异丙威(IPC)为模板，MAA作为有机功能单体，甲基三甲氧基硅烷(MTMS)作为无机前体，EGDMA作为交联剂，合成了PMAA/SiO₂分子印迹杂化整体柱，并成功对大米中残留的IPC进行了高效分离和快速富集。

  图 4

  

  图 4.  以凝血酶配体修饰的纳米金改性有机-硅胶杂化整体柱的制备^[63]

  Figure 4.  Scheme for preparation of aptamer@GNP@ AEAPTES-silica hybrid monolithic columns^[63]

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  4.   整体柱的改性方法

  在整体柱的制备过程中，控制聚合条件可以得到满足色谱工作基本要求的整体柱，而柱体改性步骤可以使其适应色谱的不同工作模式，在达到分离目的的前提下拓宽整体柱的应用范围，是整体柱能否商品化的关键。通过添加具有特殊官能团的单体得到性能不同的整体柱，这是最简单直接的办法，也是最常用的改性方法之一，但缺点是容易受到聚合过程的影响得不到想要的产物，如官能团遭到破坏、成品性能差异等。Zhou等^[68]在有机聚合物整体柱制备过程中添加了ACB^[6](allyloxy- cucurbit^[6]uril)进行修饰改性，使其对化妆品中的雌激素具有特异性识别作用(见图 5)。Qi等^[69]创新性地将γ-MAPS接到TiO₂纳米管表面制成功能单体，与EGDMA、AIBN共聚得到整体柱，经一系列实验表明该整体柱对磺胺类药物有较好的选择性和灵敏性。

  图 5

  

  图 5.  ACB[6]作为功能单体改性的有机聚合物整体柱合成方案^[68]

  Figure 5.  Scheme for the synthesis of ACB[6]@poly (BMA-EDMA) monolith^[68]

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  除了添加功能单体共聚改性的方法外，聚合物表面改性也是当前研究热点。表面改性是指在保持材料或制品原性能的前提下，赋予其表面新的性能。表面改性方法的报道有很多，大体上可以归结为表面化学反应法、表面接枝法和一些其他改性方法。传统的表面化学反应法是通过水解、缩合、开环和氧化还原等一系列化学反应，对整体柱内部表面进行有机化学包覆和无机颗粒沉积包覆。近年来一些科研工作者通过化学“点击反应”实现了对整体柱的杂化改性，这种小单元拼接的方法简单且高效。Liu等^[70]通过巯基-烯的“点击反应”对整体柱进行功能化改性(见图 6)，得到的杂化整体柱可以用于几千种蛋白质和多肽的分离鉴别。Bai等^[71]在引入POSS交联的基础上，利用巯基-烯“点击反应”对整体柱进行改性后，将酰肼类物质结合到整体柱表面，完成了对糖肽的富集(见图 7)。

  图 6

  

  图 6.  以溶胶-凝胶化学和巯基-烯点击反应为基础的功能化整体柱的制备过程示意图^[70]

  Figure 6.  Illustration of preparation process for functional monoliths based on sol-gel chemistry and thiol-ene click reaction^[70]

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  图 7

  

  图 7.  通过光引发巯基-烯的点击反应制备杂化整体柱，并利用肼对其进行改性^[71]

  Figure 7.  Preparation of hybrid monolithic column and hydrazine- modified material via photo-initiated thiol-ene reaction^[71]

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  目前，大部分整体柱均采用表面基团接枝法进行改性，希望能够通过接枝一些聚合物长链来增加官能团密度。这些聚合物链在孔中会像“触角”一样，通过改变构象与溶质产生最有效的作用，提高柱容量和分离效率的同时不会影响其渗透性。通常，可以进行表面接枝的孔结构应满足两个条件：首先要有足够多的大孔使流动相传质阻力减小，柱压降低；其次是要有足够大的表面积和较多的功能基团来满足后续的化学修饰。Nagase等^[72]用原子转移自由基聚合(ATRP)法将热敏材料IPPAm与甲基丙烯酸正丁酯共聚在硅胶整体柱孔洞表面形成“刷子”(见图 8)，并通过对苯甲酸、胰岛素片段的洗脱证明这种耐热整体柱是分离分析生物分子的有力工具。值得一提的是，这种由ATRP制成的整体柱又叫作ATRP整体柱，近年来通过此类活性可控反应(如ATRP^{[37, 73]}、ROMP^[74~76]等)接枝制成的不同性能的整体柱逐渐引起了研究者的广泛关注，具有较好的应用前景。除了以上两种表面改性方式，还可以外加强烈的机械作用或磁场作用对整体柱表面进行激活，在一定程度上改变表面细微结构从而获得具有不同的功能的整体柱。随着科技水平的日新月异，表面改性的方法趋向于多样化，如何用廉价易得的原料和简单的操作步骤达到表面改性的目的将成为我们未来研究的重点。

  图 8

  

  图 8.  原子转移自由基聚合法将热敏材料IPPAm与甲基丙烯酸正丁酯共聚改性硅胶整体柱的方案^[72]

  Figure 8.  Scheme for preparation of P(IPAAm-co-BMA)-brush- grafted monolithic silica rod using surface-initiated ATRP^[72]

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  5.   结语

  目前，HPLC整体柱已广泛应用于食品和日用品的检测^{[68, 77]}、生物制药^{[10, 11, 78]}、生命科学^[79]、临床医学^[80]以及环境科学^[81]等领域，为芳烃^[46]、酚类^[82]、手性物质^[24]、生物大分子(如蛋白质^{[63, 83]}、多肽^[70]、氨基酸^[84]、核酸^{[43, 85]}等)及一些小分子^{[46, 86]}化合物的分离分析提供了新的思路。随着整体柱技术的不断发展，其应用范围在不断延伸和拓展，在亲和色谱^{[43, 87]}、反相色谱^[88]、疏水色谱^[89]、离子交换色谱^[90]、体积排阻色谱^[83]等技术手段中发挥着重要作用。除此之外，整体柱还可以通过液相色谱与其他技术联用^{[42, 77, 85~87, 91, 92]}完成固相萃取^{[82, 93~95]}、选择性富集^[96]、生物反应器的制备^[97]、样品的前处理^[98]、产物“追踪”及毒物化验^{[44, 67]}等一系列复杂的操作。以上具体应用实例已经有相关文献[6, 13, 14, 27, 65, 85, 99]进行了总结和报道，这里将不再例举。

  整体柱技术发展至今，制备技术日渐成熟，各类体系发展趋于完善，成为色谱柱“家族”的重要组成部分。由于其具有的独特优势，已被广泛用于HPLC技术中，其中有机聚合物整体柱在生物大分子的分离、分析和检测方面发挥巨大作用。虽然整体柱具有诸多优点，但是在使用中仍存在易溶胀和收缩、样品扩散使峰型展宽、分离小分子柱效低、使用寿命短等问题。因此，探索新的制备手段、优化制备条件、研究分离过程和机理对于开辟全新的应用领域有更大的理论和现实意义。根据已有的文献和报道，我们预测整体柱技术未来将会向以下几个方面发展：(1)制备具有微观精细结构的整体柱，通过对孔的尺寸及形状的调控或接枝官能团来获得不同的分离性能；(2)选择不同类型的功能单体参与聚合改变柱体表面属性，拓宽应用范围；(3)在分子印迹技术的基础上，通过后续改性制备更具有定向选择性的整体柱，同时开发生物大分子的印迹模板，推动各类分子印迹整体柱走向商业化；(4)随着整体柱技术的发展，在微量分离分析、天然产物富集萃取、加压毛细管电色谱、样品前处理等方面具有应用潜力；(5)跨学科合作，采用数学建模法研究分离机理，优化分离效率，使整体柱不仅对蛋白质、氨基酸等大分子具有很好的分离效果，对小分子也可以进行快速筛选和鉴定；(6)未来整体柱将广泛应用于色谱技术与其他技术联用方面，发展前景广阔。

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      Y Shan, X Shi, G Xu. J. Sep. Sci., 2015, 38(6):982~989. doi: 10.1002/jssc.201400967

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  图式 1  聚丙烯酰胺类整体柱常用的功能单体和交联剂

  Scheme 1  The functional monomer and crosslinking agent of polyacrylamide monolithic column

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  图 1  原位共聚法一步合成离子液体和苯乙烯双官能团改性的聚二甲基丙烯酸乙二醇酯整体柱的方案^[49]

  Figure 1  Scheme for synthesis of the monolithic column with ionic liquid and styrene-modified bifunctional group by a single-step in situ copolymerization^[49]

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  图 2  IMSN-C18有机-无机杂化整体柱的制备方案^[50]

  Figure 2  Scheme for preparation of IMSN-C18 organic-inorganic hybrid monolithic column^[50]

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  图 3  POSS-VIMPFP杂化整体柱的合成过程^[61]

  Figure 3  Synthesis process of POSS-VIMPFP hybrid monolithic column^[61]

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  图 4  以凝血酶配体修饰的纳米金改性有机-硅胶杂化整体柱的制备^[63]

  Figure 4  Scheme for preparation of aptamer@GNP@ AEAPTES-silica hybrid monolithic columns^[63]

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  图 5  ACB[6]作为功能单体改性的有机聚合物整体柱合成方案^[68]

  Figure 5  Scheme for the synthesis of ACB[6]@poly (BMA-EDMA) monolith^[68]

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  图 6  以溶胶-凝胶化学和巯基-烯点击反应为基础的功能化整体柱的制备过程示意图^[70]

  Figure 6  Illustration of preparation process for functional monoliths based on sol-gel chemistry and thiol-ene click reaction^[70]

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  图 7  通过光引发巯基-烯的点击反应制备杂化整体柱，并利用肼对其进行改性^[71]

  Figure 7  Preparation of hybrid monolithic column and hydrazine- modified material via photo-initiated thiol-ene reaction^[71]

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  图 8  原子转移自由基聚合法将热敏材料IPPAm与甲基丙烯酸正丁酯共聚改性硅胶整体柱的方案^[72]

  Figure 8  Scheme for preparation of P(IPAAm-co-BMA)-brush- grafted monolithic silica rod using surface-initiated ATRP^[72]

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  表 1  有机-无机杂化整体柱的研究成果

  Table 1.  The achievements of hybrid organic-silica monolithic columns

  硅单体	有机单体	分离(或识别)物质	文献
  TMOS	C18-TMS a	多环芳烃，芳香醛，酮类	[53]
  TMOS/γ-MAPS b	VPBA c	含顺式二醇的生物分子，糖蛋白	[57]
  TMOS/VTMS d	AETAe	核苷，核苷酸	[58]
  POSS	BPADMAf or EDMA	烷基苯，苯酚，苯胺，多环芳烃	[59]
  TMOS/γ-MAPS	VPBA	含顺式二醇的化合物，烷基苯，酰胺，苯胺	[51]
  TEOS/AEAPTESg/γ-MAPS	VPBA	含顺二醇生物分子	[60]
  POSS	溴化1-乙烯基-3-(全氟苄基)-咪唑鎓	烷基苯，多环芳烃，核苷，卤代化合物	[61]
  IMSNh	C18 monomer	硫脲，苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯	[50]
  POSS	AM	胺，核苷，硝基苯胺	[62]
  TEOS/AEAPTES	CTABi	凝血酶	[63]
  aC18-TMS: N-十八烷基二甲基[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]氯化铵；bγ-MAPS: 3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷；cVPBA: 4-乙烯基苯基硼酸；d VTMS:乙烯基三甲氧基硅烷；e AETA: [2-(丙烯酰氧基)乙基]三甲基甲基硫酸铵；f BPADMA:双酚A二甲基丙烯酸酯；gAEAPTES: N-(β-氨基乙基)-γ-氨基丙基三乙氧基硅烷；hIMSN:介孔二氧化硅纳米粒子；iCTAB:十六烷基三甲基溴化铵

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