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• 随着消费水平的提高和护肤观念的增强，人们的日常生活已离不开化妆品，越来越多的人开始注重保养，同时也对化妆品的功效和质量提出了更高的要求^[1-2]。《化妆品安全技术规范》(2015年版)明确规定，对于防晒类化妆品，尿刊酸(URA)属于违禁成分，甲氧基肉桂酸乙基己酯(EHMC)、丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷(B-MDM)是准用成分，常用作防晒添加剂。一些不良商家为达到更好的防晒效果，将尿刊酸加入化妆品中，且对某些准用成分也过量使用，严重损害到了消费者的健康。防晒添加剂可吸收紫外线，对于太阳照射引起的皮肤损伤能有效缓解，但过量使用存在安全隐患，例如，使人体内分泌受到干扰，产生紊乱现象，人体发育毒性产生的可能性增加，机体免疫力低下，刺激肌肤表皮，从而出现皮肤过敏等不良症状^[3-5]，因此，对于市场上的防晒产品中违禁添加剂的筛查及对防晒剂含量的快速测定具有重要意义。

  目前应用于检测化妆品中防晒添加剂含量的方法多样，常用的方法包括高效液相色谱法(HPLC)^[6-8]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)^[9]和气相色谱-质谱联用法(GC-MS)^[10]，但这些方法各有优缺点：HPLC的优点是仪器成本较低，仪器精密度较高，但是只能对已知、特定的样品进行分析；LC-MS、GC-MS优点在于可对未知样品进行分析，与HPLC共同的缺点是样品前处理过程复杂，分析时间较长，仪器成本、溶剂耗材较贵，容易造成离子抑制效应^[1]。而实时直接分析(Direct Analysis in Real Time，DART)作为一种可结合高分辨质谱的新型离子源，具有实时原位、快速和绿色等多方面优点，在药物发现与开发(ADME)、食品药品安全控制与检测、司法鉴定、临床检验和材料分析等领域已成功广泛地应用^[11-16]。DART技术自2005年出现以来，发展较为迅速，在目前已知的直接分析技术中，它是最早实现商品化的接口技术^[17]，其适用范围广，可通过调节载气温度，对样品表面分子进行差异化解析并离子化，从而实现无损耗定性和定量检测分析，效率高，质谱信息获得速度快^[18]。因为DART离子化是发生在开放的条件下，所以易受周围环境因素影响，尽管其有这样的缺点，但是由于方法对待测样品要求不高，前期处理简便，所以该技术越来越多地受到各个领域的青睐，也将被广泛应用于化妆品的检测方法开发中^[19]。本研究利用DART-MS/MS技术，建立了一种对化妆品中URA、EHMC、B-MDM快速筛查及定量的方法，快捷高效、前处理简便、绿色环保，如能配合小型质谱仪可实现原位在线现场检测，可极大地提高化妆品市场安全监管的效率及水平，该方法可为防晒化妆品的违法添加产品监测提供借鉴。

  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；乙醇(分析纯，哈尔滨生物制药有限公司)；尿刊酸对照品(山东西亚化学工业有限公司)；甲氧基肉桂酸乙基己酯对照品(南京广润生物有限公司)；丁基甲氧基二苯甲酰基甲烷对照品(衢州市瑞尔丰化工有限公司)；高纯N₂气、He气(纯度99.999%，长春巨洋氧气厂)；空白O/W型防晒霜(实验室自制)；防晒霜(O/W型)样品购于本地超市。

  DART离子源(美国Ion Sense公司)；Waters Purifier-RM200超纯水机(长春莱博特公司)；Agilent 6520-Q-TOF质谱仪(美国安捷伦公司)；BT25S电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；KQ-500 DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Centrifuge 5810 R型离心机(德国Eppendorf公司)。

  1.2   实验方法

  1.2.1   对照品溶液的制备

  精密称取URA、EHMC、B-MDM对照品各5.0 mg，置于5.0 mL容量瓶中，分别用甲醇、乙醇、乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，配置成1.0 g/L的对照品储备溶液，于4 ℃冰箱保存，备用。

  1.2.2   标准曲线的绘制

  精密称取0.2000 g空白O/W型防晒霜样品置于10.0 mL具塞玻璃离心管中，向每个样品中分别精密加入不同质量的URA、EHMC、B-MDM对照品溶液，配置成浓度分别为0、25、50、100、200、500、750和1000 mg/L的标准曲线系列溶液；分别向3种样品中加入10.0 mL甲醇、乙醇、乙醇，摇匀，超声提取5 min，8000 r/min离心5 min，将上清液过0.45 μm微孔滤膜，得供试品溶液，于4 ℃冰箱保存备用。以测得的峰面积(y)为纵坐标，对应的标准溶液质量浓度(x，mg/L)为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线。

  1.2.3   检测条件

  气体的选择  DART离子源常用的工作气体为N₂气和He气，N₂气作为离子化试剂时较He气易发生副反应^[20]，为了减少副反应的发生，本实验在分析样品时通入He气，由于N₂气较He气成本低，出于对节约成本的考虑，在待机时通入N₂气，节省资源。

  DART条件  气体压力为0.5 MPa，定量分析采用筛网模块方式进行检测，载样器滑动速度为0.2 mm/s，正离子模式采集，其它参数采用仪器默认设置。

  质谱条件  扫描范围m/z 50~750，分辨率为35000，AGC Target 1×10^-6(Automatic Gain Control)，正离子模式扫描(Full scan)，DART离子源与质谱入口间距离1 cm，其它参数采用仪器默认设置^[21]。

  2.   结果与讨论

  2.1   工作参数优化

  2.1.1   载气温度的选择

  DART离子源需要一定的载气温度才可对表面分子进行差异化解析并使之离子化，所以不同检测物质的载气温度是重要的参数，温度高低会影响检测效率。适当高温会加速待测样品气化，热解析效率提高^[1]，使更多样品离子化从而进入质谱，但温度过高使样品受热降解，而温度过低无法使样品离子化完全。

  为使载气温度达到最优，分别配置3种成分的10 mg/L的供试品溶液，按1.2.2节步骤处理并按1.2.3节方法进行检测，用移液枪各移取10.0 μL至筛网模块，平行5次，在DART-MS软件分别手动调节载气温度为50、100、150、200、250、300、350、400和450 ℃，在离子源温度350 ℃、fragmentors电压175 V、格栅电压350 V的条件下检测响应值与载气温度的关系，检测结果利用峰面积进行比较。结果表明，载气温度随着温度的升高峰面积呈现先增大后减小的趋势，分别在300、350和150 ℃时最高，其后逐渐下降(图 1A)。

  图 1

  

  图 1.  载气温度(A)、fragmentors电压(B)和格栅电压(C)参数的优化

  Figure 1.  Optimization of gas temperature (A), fragmentors voltage (B) and grid voltage (C)

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  2.1.2   Fragmentors电压的选择

  Fragmentors电压增大会提高响应值，大到一定程度则会有碎片产生。为使fragmentors电压达到最适值，分别配置3种成分的10 mg/L的供试品溶液，按1.2.2节步骤处理并按1.2.3节方法进行检测，用移液枪各移取10.0 μL至筛网模块，平行5次，在DART-MS软件分别手动调节fragmentors电压为50、100、150、200、250、300和350 V，在离子源温度350 ℃、载气温度250 ℃、格栅电压350 V的条件下检测响应值与fragmentors电压的关系，检测结果利用峰面积进行比较。结果表明，fragmentors电压随着电压的增加峰面积呈现先增大后减小的趋势，分别在100、150和100 V时峰面积最大，其后逐渐下降(图 1B)。

  2.1.3   优化格栅电压

  分别配置3种成分的10 mg/L的供试品溶液，按1.2.2节步骤处理并按1.2.3节方法进行检测，用移液枪各移取10.0 μL至筛网模块，平行5次，在DART-MS软件分别手动调节格栅电压为100、150、200、250、300、350和400 V，在离子源温度350 ℃、载气温度250 ℃、fragmentors电压150 V的条件下检测响应值与格栅电压的关系，检测结果利用峰面积进行比较。结果表明，格栅电压随着电压的增加峰面积呈现先增大后减小的趋势，电压分别在150、250和350 V时较高，其后出现下降趋势(图 1C)。

  经过优化，URA的最佳检测方法是：载气温度300 ℃、fragmentors电压100 V、格栅电压150 V；EHMC的最佳检测方法是：载气温度350 ℃、fragmentors电压150 V、格栅电压250 V；B-MDM的最佳检测方法是：载气温度150 ℃、fragmentors电压100 V、格栅电压350 V。

  2.2   定性分析

  本实验对防晒霜样品定性检测采用直接进样方式。取少量防晒霜样品，放置于DART离子源与质谱接口处的离子化区域内，按1.2.3节方法进行检测，利用四级杆飞行时间质谱仪进行信号收集，在质谱图中可看到URA的[M+H]⁺峰(m/z 139.0513)、EHMC的[M+H]⁺峰(m/z 291.4070)和B-MDM的[M+H]⁺峰(m/z 311.3985)，进而直接定性，3种成分的实测值与理论值对比如表 1所示。虽然直接检测信号强度低，但对于化妆品定性鉴别影响不大。3种成分的串联质谱图如图 2所示。

  表 1

  

  表 1  实测值与理论值对比

  Table 1.  Comparasion of the theoretical values and measured values

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  Components	Theoretical value [M+H]+	Measured value	Deviation
  URA	139.050 8	139.051 3	3.60
  EHMC	291.407 9	291.407 0	-3.09
  B-MDM	311.397 9	311.398 5	-1.93

  图 2

  

  图 2.  URA(A)、EHMC(B)和B-MDM(C)的二级质谱图

  Figure 2.  MS² spectra of URA (A), EHMC (B) and B-MDM (C) obtained by DART-MS

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  2.3   定量分析

  依据《化妆品安全技术规范》(2015年版)的规定，对URA、EHMC和B-MDM进行定量检测。按1.2.2节步骤处理并按1.2.3节方法连续进样检测，通过正离子模式扫描模式，分别对3种成分的提取离子流图(图 3)进行积分，通过峰面积计算含量。

  图 3

  

  图 3.  URA(A)、EHMC(B)和B-MDM(C)的提取离子流图

  Figure 3.  EIC of URA(A), EHMC(B) and B-MDM(C) obtained by DART-MS

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  2.3.1   线性范围及检出限

  按1.2.2节步骤处理样品并按1.2.3节方法测定得其回归方程、相关系数等列于表 1。可以看出：该方法的线性关系良好(r＞0.99)，按照3倍信噪比(S/N=3)得最低检出限为7.5 mg/L；按照10倍信噪比(S/N=10)得定量限(LOQ)为25 mg/L。

  表 2

  

  表 2  回归方程、相关系数及检出限

  Table 2.  Regression equation, correlation coefficient and detection limit

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  Components	The regression equation	The correlation coefficient(r)	Linear range/(mg·L-1)	Detection limit/(mg·L-1)
  URA	y=33786x-1E+06	0.99	50~1000	15
  EHMC	y=19359x-78647	0.991	25~1000	7.5
  B-MDM	y=38257x-2E+06	0.992	50~1000	15

  2.3.2   精密度

  分别配置3种成分的100 mg/L的供试品溶液，按1.2.2节步骤处理并按1.2.3节方法连续进样检测，每个样品重复测定6次，记录峰面积。结果表明，3种成分的相对标准偏差(RSD)平均值在3.59%~11.23%之间，表明仪器精密度良好。

  2.3.3   回收率、相对标准偏差及定量限

  将空白O/W型防晒霜在工作曲线的线性范围内分别加入低、中、高浓度(即50%、100%及150%)的对照品溶液，按1.2.2节步骤处理并按1.2.3节方法测定其回收率，n=6，求其平均值。结果表明，平均回收率在96.7%~109.2%，相对标准偏差(RSD)在1.31%~8.65%之间，结果见表 3。

  表 3

  

  表 3  化妆品中防晒剂的回收率和相对标准偏差

  Table 3.  Spiked recoveries and RSDs of sunscreens in cosmetics

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  Components	Spiked/(mg·L-1)			Average recovery/%	RSD/%
  	50%	100%	150%
  URA	5.09	10.17	15.26	102.9 98.3 100.6	3.83 2.25 1.31
  EHMC	5.15	10.10	15.15	96.7 109.2 104.5	4.18 8.65 4.24
  B-MDM	5.03	10.06	15.09	105.4 102.2 108.6	5.54 2.98 7.39

  2.3.4   稳定性试验

  分别配置3种成分的100、200和500 mg/L的供试品溶液，按1.2.2节步骤处理并按1.2.3节方法测定，每种成分每个浓度进行3样本分析。分别将供试品在室温下放置0、2、4、6、8、12 h进样测定，考察供试品溶液在放置不同时间条件下的稳定性，依次记录峰面积。结果表明，供试品溶液在12 h内稳定。

  2.4   实际样品测定

  应用本研究建立的方法对市面流通的防晒霜进行检测，结果显示，样品中的违禁成分URA未检出，其余两种防晒剂的含量在本方法的定量线性范围内，EHMC检出质量分数在10%以内，B-MDM的检出质量分数范围在5%以内。本方法在检出限、定量限等方面优于传统方法，表明本方法切实可行。

  3.   结论

  本研究利用DART技术结合高分辨质谱，建立了一种快速筛查化妆品中非法防晒添加剂的方法，通过对载气温度、fragmentors电压和格栅电压等参数进行优化，确定了最佳实验条件。该方法采用筛网模块进样，样品前处理简单、试剂消耗量少、无需色谱分离过程、绿色环保、离子化和重现性均较好，可对防晒化妆品中的违禁添加剂如URA等，在几秒钟时间即可完成其定性筛查工作，对于准用防晒添加剂如EHMC、B-MDM在30~90 s即可完成初步的定量检测，具有较好的方法精密度与重现性，该方法为以后化妆品市场的监管提供有力的方法支持及借鉴，同时为拓展DART-MS技术在化妆品快速筛查领域奠定了一定的基础。

  
  
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  图 1  载气温度(A)、fragmentors电压(B)和格栅电压(C)参数的优化

  Figure 1  Optimization of gas temperature (A), fragmentors voltage (B) and grid voltage (C)

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  图 2  URA(A)、EHMC(B)和B-MDM(C)的二级质谱图

  Figure 2  MS² spectra of URA (A), EHMC (B) and B-MDM (C) obtained by DART-MS

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  图 3  URA(A)、EHMC(B)和B-MDM(C)的提取离子流图

  Figure 3  EIC of URA(A), EHMC(B) and B-MDM(C) obtained by DART-MS

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  表 1  实测值与理论值对比

  Table 1.  Comparasion of the theoretical values and measured values

  Components	Theoretical value [M+H]+	Measured value	Deviation
  URA	139.050 8	139.051 3	3.60
  EHMC	291.407 9	291.407 0	-3.09
  B-MDM	311.397 9	311.398 5	-1.93

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  表 2  回归方程、相关系数及检出限

  Table 2.  Regression equation, correlation coefficient and detection limit

  Components	The regression equation	The correlation coefficient(r)	Linear range/(mg·L-1)	Detection limit/(mg·L-1)
  URA	y=33786x-1E+06	0.99	50~1000	15
  EHMC	y=19359x-78647	0.991	25~1000	7.5
  B-MDM	y=38257x-2E+06	0.992	50~1000	15

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  表 3  化妆品中防晒剂的回收率和相对标准偏差

  Table 3.  Spiked recoveries and RSDs of sunscreens in cosmetics

  Components	Spiked/(mg·L-1)			Average recovery/%	RSD/%
  	50%	100%	150%
  URA	5.09	10.17	15.26	102.9 98.3 100.6	3.83 2.25 1.31
  EHMC	5.15	10.10	15.15	96.7 109.2 104.5	4.18 8.65 4.24
  B-MDM	5.03	10.06	15.09	105.4 102.2 108.6	5.54 2.98 7.39

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