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• 天然过氧化物酶是一种以铁卟啉血红素为辅基，参与生命体内生理代谢的生物大分子。生物传感器是一种对生物物质敏感并利用适当的理化换能器将其浓度转换为颜色、光、电等信号进行检测的新型传感器，与传统检测方法相比，具有简便、灵敏、快速等优点。天然过氧化物酶可通过催化底物氧化，如过氧化氢(H₂O₂)，使生物传感器产生颜色变化信号、电信号或化学发光信号，从而实现对分析物的检测。并因其固有的催化活性和与底物结合的特异性，与其它生物传感器相比，基于天然过氧化物酶开发的生物传感器具有灵敏度高的特性，这也使其被广泛地应用于生物传感器领域。然而天然过氧化物酶对存储条件要求苛刻、提取和纯化的过程复杂、成本昂贵，且在恶劣的实验环境下存在不稳定、易失活的问题，这些问题也限制了天然过氧化物酶更广泛的应用^[1]。因此，研究者们开始致力于设计一种易于合成、价格低廉、性能稳定且具有过氧化物酶样活性的非蛋白质分子化合物，用作过氧化物模拟酶。血红素/G-四链体DNA酶(Hemin/G-quadruplex DNAzyme)便是其中一类过氧化物模拟酶，因具有易于合成、价格低廉、性能稳定等特性得到了研究人员们的广泛关注。1994年，Breaker等^[2]利用体外筛选技术首次合成了DNA酶(DNAzyme)，它能催化依赖铅离子(Pb²⁺)的RNA磷酸酯裂解，从而进行快速的反应。随后，Travascio等^[3]报道了DNA适配体-血红素复合物具有增强的过氧化物酶活性。血红素(Hemin)是多种酶的活性辅助因子，包括过氧化物酶，具有低的内在过氧化物酶活性。在金属离子的存在下，由体外筛选技术筛选的富含鸟嘌呤(G)的单链短序DNA，可通过分子内G-四链体(G-quadruplex)的形成与血红素紧密结合，从而形成一种血红素/DNA复合物，该复合物即Hemin/G-quadruplex DNAzyme，其过氧化物酶活性明显高于单独的血红素。也因其具有比天然过氧化物酶更好的热稳定性和生物相容性，且可编程、易修饰以及可通过聚合酶链式反应(PCR)容易地合成而被广泛应用于生物传感器领域。在这篇综述中，讨论了G-四链体的结构与特点，增强Hemin/G-quadruplex DNAzyme活性的策略及基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme开发的生物传感器在生物标志物、微生物与生物毒素以及金属离子检测中的应用。

  1.   G-四链体的结构与特点

  G-四链体在1962年由Gellert等^[4]首次发现，是富含G的DNA链在K⁺、Na⁺或NH₄⁺等离子的存在下折叠成的平行或反向平行的四分体结构，利用在单链间或单链内对应的G残基之间形成的Hoogsteen型碱基对堆叠排列而成。G-四链体由1、2或4个DNA分子组成，其具有许多不同的拓扑结构，如分子间的四链四链体(图 1a)、分子间的双链四链体(图 1b-1d)和分子内的单链四链体(图 1e-1h)，这取决于富含G的DNA链的数量和方向。G-四链体可以与Hemin嵌合形成具有类过氧化物酶活性的Hemin/G-quadruplex DNAzyme，其表现出来的类过氧化物酶活性受G-四链体结构的影响。Cheng等^[5]研究了平行、反平行和混合的反平行/平行G-四链体结构的类过氧化物酶活性，发现分子内平行的G-四链体结构具有很强的类过氧化物酶活性，而分子内反平行的G-四链体结构的活性非常弱，分子间平行的G-四链体结构也仅显示出较弱的类过氧化物酶活性，这是因为分子内平行的G-四链体结构有利于血红素的末端堆积。随后，Kong等^[6-7]的研究工作表明了G-四链体的形成是决定Hemin/G-quadruplex DNAzyme是否具有类过氧化物酶活性的关键因素，也再次表明了血红素和平行的G-四链体形成的复合物具有比由血红素和反平行形成的复合物高得多的类过氧化物酶活性，血红素的存在还可以促进一些G-四链体从反平行结构向平行结构的转化。Cheng等^[8]的研究表明，3个G-四链环的顺序在G-四链体的拓扑构象的形成中起着重要的作用，环是两个相邻G区域之间的序列。合适的环转位可以通过增加G-四链体与血红素结合亲和力来增强Hemin/G-quadruplex DNAzyme的类过氧化物酶活性。G-四链体的拓扑结构还受溶液中阳离子的影响，在K⁺的存在下形成的G-四链体结构主要为平行的G-四链体，在Na⁺的存在下主要形成反平行的G-四链体结构，而某些情况下，在NH₄⁺的存在下形成的G-四链体结构表现出最强的类过氧化物酶活性，这是因为NH₄⁺稳定的G-四链体具有较高的抗自由基产物降解的能力^[9-10]。这些工作为设计出具有更高类过氧化物酶活性的新型Hemin/G-quadruplex DNAzyme和寻找出此类DNAzyme的新用途提供了巨大的帮助。

  图 1

  

  图 1.  不同类型的G-四链体的示意图，(a)分子间平行的四链四链体；(b)分子间平行的双链四链体；(c和d)分子间反平行的双链四链体；(e)分子内平行的单链四链体；(f和g)分子内反平行的单链四链体；(h)分子内混合平行的四链体^[6]。(箭头代表核苷酸链从5′-3′的走向)

  Figure 1.  Schematic representation of different types of G-quadruplex.(a)intermolecular four-stranded parallel quadruplex.(b)intermolecular two-stranded parallel quadruplex.(c and d)intermolecular two-stranded antiparallel quadruplex.(e)unimolecular parallel quadruplex.(f and g) unimolecular antiparallel quadruplex.(h)unimolecular mixed-parallel quadruplex^[6].(arrows indicate 5′-3′ polarity)

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  2.   增强血红素/G-四链体DNA酶活性的策略

  虽然开发的Hemin/G-quadruplex DNAzyme，与天然酶相比，具有稳定性好、对环境不敏感和制备成本低等优点，但它的催化活性仍不能令人满意。近年来，研究人员们开发了许多有效的策略来增强Hemin/G-quadruplex DNAzyme的活性，主要包括添加外源性酶增强剂、对DNA序列进行修饰以及对血红素/G-四链体DNA酶进行修饰。

  2.1   添加外源性酶增强剂

  如上所述，Hemin/G-quadruplex DNAzyme的类过氧化物酶活性受溶液中所含阳离子的影响，此外，研究人员们还发现添加某些外源性酶增强剂可增强Hemin/G-quadruplex DNAzyme的活性。Kong等^[11]研究了腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)对Hemin/G-quadruplex DNAzyme所介导的反应的影响，结果表明ATP起积极作用且抑制了ABTS·⁺(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的歧化，添加2 mmol/L ATP后，富含G的DNA序列对血红素的亲和力提高了近2.5倍，随后，Stefan等^[12]深入研究了ATP增强Hemin/G-quadruplex DNAzyme催化活性的机理，发现ATP是作为稳定剂，稳定了血红素、血红素/G-四链体复合物和氧化产生的自由基阳离子，从而提高了催化的整体效率。Stefan等^[13]还发现用类似DOTA(1, 4, 7, 10-四(羧甲基)-1, 4, 7, 10-四氮杂环十二烷)大环的模板合成的G-四分体也对Hemin/G-quadruplex DNAzyme的催化活性起增强作用，将其用于检测可将检测方法的灵敏度提高8倍。Qi等^[14]报告，生物多胺(精胺(C₁₀H₂₆N₄)、亚精胺(C₇H₁₉N₃)和腐胺(C₄H₁₂N₂))对Hemin/G-quadruplex DNAzyme的类过氧化物酶活性均有积极影响，其中精胺表现出最强的增强作用，可使Hemin/G-quadruplex DNAzyme的催化活性增强3.6~6倍，这是因为精胺不仅保护血红素不受过氧化氢(H₂O₂)的快速降解，还可以将G-四链体浓缩成有序的微聚集体，并为催化反应提供有利的微环境。虽然添加外源性酶增强剂能一定程度上增强Hemin/G-quadruplex DNAzyme的催化活性，但添加的酶增强剂通常为高浓度的，且可能不适合受这些增强剂影响的催化或分析的应用。

  2.2   对DNA序列进行修饰

  Hemin/G-quadruplex DNAzyme的催化活性还受形成G-四链体的DNA序列的影响。Li等^[15]将DNA双链体结构掺入G-四链体中适当的位点提高了酶的活性，这归因于该策略赋予其较高的与血红素结合的亲和力，具有四链/双链体结构的抗血栓性寡核苷酸与血红素结合的亲和力通常比没有双链体结构的G-四链体结构高4~10倍。Kong等^[6]发现在T_nG₄T_m序列的5′末端添加胸腺嘧啶(T)核苷酸可增强所形成的DNAzyme的活性，但是在3′末端添加T核苷酸的作用不大。Chang等^[16]报道了添加在G-四链体核心序列5′和3′末端的特定侧翼序列d(CCC)增加了G-四链体与血红素结合的亲和力，从而显著增强了Hemin/G-quadruplex DNAzyme的活性，该DNAzyme的在含K⁺的溶液中的米氏常数(K_m)为0.7~1.1 mmol/L，远低于被首次报道的Hemin/G-quadruplex DNAzyme的K_m值(2.6~2.9 mmol/L)。Li等^[17]通过在G-四链体的核心序列的3′末端添加3个相邻的腺嘌呤增强了Hemin/G-quadruplex DNAzyme的活性，与原始Hemin/G-quadruplex DNAzyme相比，使用该策略后的DNAzyme的催化活性增强了5~20倍，腺嘌呤可能类似于天然辣根过氧化物酶(HRP)中的远端组氨酸，起一般酸碱催化剂的作用。近期，Chen等^[18]研究了G-四链环和侧翼区域中的近端核苷酸(腺嘌呤(dA)或胞嘧啶(dC)核苷酸)对催化活性的作用。数据表明，dA/dC可以模仿在血红蛋白活性位点中发现的组氨酸的作用，当将dA/dC插入G-四链环和侧翼区域时，催化增强是有效的，分别可使Hemin/G-quadruplex DNAzyme的催化活性增强4.9和12倍，但是必须特别注意dA/dC的定位。Virgilio等^[19]在形成G-quadruplex的序列AG₄A和AG₆A的中间引入了一个5′-5′极性位点反转，以获得d(^3′AGG^5′-^5′GGA^3′)(或AG₂-G₂A)和d(^3′AGGG^5′-^5′GGGA^3′(或AG₃-G₃A)，从而获得具有两个相同外部的G-四链体，即两个3′-末端的G-quadruplex，它们对于血红素的结合至关重要，该策略使Hemin/G-quadruplex DNAzyme的催化活性增强7倍。这为G-四链体形成序列对其整体催化能力的影响提供了宝贵线索，并为进一步改进提供了思路。

  2.3   对血红素/G-四链体DNA酶进行修饰

  Hemin/G-quadruplex DNAzyme的活性较低，Golub等^[20]考虑可能是因为DNAzyme缺乏其底物结合的位点，于是该课题组通过将Hemin/G-quadruplex DNAzyme与序列特异性核酸结合位点(适体)共价缀合增强了DNAzyme的催化活性，最高可增强20倍。DNA适体部分结合的非核苷酸配体充当DNAzyme的底物。酶与适体的共价缀合将活性位点和识别位点结合成了一个完整结构的杂化结构，缩短了底物与Hemin/G-quadruplex DNAzyme的活性之间的距离从而提高了对底物的亲和力。但催化反应会依赖于底物的反复识别和释放，催化效率又受动力学效应的影响，所以这种动力学效应是耗时的。Zhou等^[21]开发了更简单易行的方法来提高Hemin/G-quadruplex DNAzyme与底物结合的亲和力，即将底物L-半胱氨酸与血红素共价结合后，再与富含G的DNA序列反应，构建了L-半胱氨酸-Hemin/G-quadruplex人工自催化复合物，因为Hemin/G-quadruplex DNAzyme能催化L-半胱氨酸氧化为半胱氨酸，同时生成H₂O₂。L-半胱氨酸与血红素的共价结合提高了该复合物与底物L-半胱氨酸结合的亲和力，K_m为2.615 μmol/L，远低于Hemin/G-quadruplex对L-半胱氨酸的K_m值(约为8.640 μmol/L)，这是因为L-半胱氨酸-Hemin/G-quadruplex为L-半胱氨酸在活性位点的富集提供了结合位点，还消除了底物L-半胱氨酸的扩散动力学效应，加快了底物中间体的转移速率，防止了中间体在扩散过程中的损失。此外，该课题组还据此开发了一种新型的自催化平台用于凝血酶的灵敏检测。然而使用这些策略开发的Hemin/G-quadruplex DNAzyme对所检测的靶标有限制。

  Xiao等^[22]受阳离子单体增强DNAzyme活性以及阳离子组蛋白对自然界中的阴离子DNA的稳定作用的启发，将Hemin/G-quadruplex DNAzyme与阳离子肽结合在一起制备了DNAzyme-肽共轭物(图 2a)。共价附于DNAzyme的阳离子肽稳定了平行的G-四链体结构并增强了与血红素结合的亲和力，从而增强了Hemin/G-quadruplex DNAzyme的催化作用，与原始DNAzyme相比显示出增强的类过氧化物酶活性高达4倍，且该策略开发的Hemin/G-quadruplex DNAzyme可用于许多应用。酶折叠成三维结构，巧妙地排列它们的活性基团，可以获得显著的催化性能。Wang等^[23]受此启发先是设计了含谷氨酰胺(Gln)的肽(Q肽)，然后将其与Hemin/G-quadruplex DNAzyme一起自组装成具有类似辣根过氧化物酶活性位点和催化功能的纳米纤维。结果表明，Q肽和含有鸟嘌呤的DNA序列(G-DNA)对血红素活性具有显著的协同作用。此外，引入Q肽，促进了血红素与底物之间的电子转移，进一步地提高了催化活性，与DNA/Hemin或肽/Hemin相比，G-DNA/Q肽/Hemin复合物的催化效率提高了10倍。

  图 2

  

  图 2.  (a) 将Hemin/G-quadruplex DNAzyme与阳离子肽共价结合的示意图^[22]；(b)利用DNA四面体结构固定Hemin/G-quadruplex DNAzyme的示意图^[24]

  Figure 2.  (a)Schematic diagram for covalent combination of Hemin/G-Quadruplex DNAzyme and cationic peptides^[22].(b)Schematic diagram for Hemin/G-Quadruplex DNAzyme fixed using DNA tetrahedron structure^[24]

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  近期，我们课题组^[24]提出了一种新型的基于DNA四面体支架的DNA酶(Tetrazymes)并通过电化学方法对其催化活性进行了评价(图 2b)。利用DNA纳米结构的稳定性和DNA四面体支架良好的定向性来控制活性中心与电极表面的距离，从而调控Tetrazymes的酶活性。我们发现Hemin/G-quadruplex DNAzyme固定在DNA四面体内的Tetrazymes表现出最强的电催化能力，比无DNA四面体支架的Hemin/G-quadruplex DNAzyme的酶活性高出6~14倍。这可能是因为，DNA四面体支架使G-四链体对血红素的亲和力增加，且可以防止Hemin/G-四链体的低聚；由于受到DNA四面体的保护，Tetrazymes的活性中心处于更稳定的环境中；Hemin/G-quadruplex DNAzyme的活性中心均匀分布在空间分离的DNA四面体纳米结构上，从而使催化位点之间的相互作用最小化，促进了催化作用。这类Tetrazymes有可能成为开发电化学酶传感器的通用酶标。

  2.4   其它策略

  Hemin/G-quadruplex DNAzyme具有较低的催化活性，还可能是由于血红素会从复合物中解离出来。血红素基团与DNA寡核苷酸共价结合是提高Hemin/G-quadruplex DNAzyme的类过氧化物酶活性较有前途的方法，合成途径有两种：胺偶联和点击反应^[25]。此外，Liu等^[26]通过对血红素辅因子进行功能化修饰开发了具有卓越催化活性的Hemin/G-quadruplex DNAzyme。他们发现血红素的外围基团，两个羧基基团，对酶活性没有作用，只参与蛋白质残基的相互作用以促进辅因子的结合。可通过氨基羧酸偶联改变这两个羧基基团，生成酰胺衍生物，从而使得血红素辅助因子的末端被功能化。该课题组的实验结果表明，该策略大大提高了催化效率，对于ABTS-H₂O₂催化系统，催化活性的增强高达11倍，该改造后的血红素辅因子可能会取代原来的血红素。G-四链体的离散单元多聚化以形成多价DNAzyme也是增强DNAzyme的类过氧化物酶活性的新兴设计策略。Adeoye等^[27]研究了5个形成G-四链体结构的DNA序列(AS1411、Bcl-2、c-MYC、PS5.M和PS2.M)的多聚化的催化活性。他们的研究结果表明，形成平行G-四链体结构的DNA序列(AS1411，Bcl-2，c-MYC)的多聚化可通过单体单元之间的协同相互作用使催化速率显著提高，其中的Bcl-2，从三聚中显示出近8倍的增强效应；相反，形成非平行结构(PS5.M和PS2.M)的DNA序列的多聚化没有显示出相似水平的协同增效活性。该研究报告的简单多聚体构建体为进一步研究如何使用这种方法构建更有效的催化DNA纳米器件提供了基础。

  3.   基于血红素/G-四链体DNA酶的生物传感器的应用

  天然过氧化物酶因具有出色的催化能力经常被用于生物传感器的信号放大。与天然过氧化物酶类似，具有类过氧化物酶活性的Hemin/G-quadruplex DNAzyme对特定底物具有较高的催化活性，但比天然过氧化物酶的化学性质更稳定，这使得Hemin/G-quadruplex DNAzyme逐渐成为天然过氧化物酶的替代物，被广泛应用于开发生物传感器。此外，由于Hemin/G-quadruplex DNAzyme还具有催化活性可控、生物相容性好、可编程、易修饰以及和能容易地与核酸放大技术结合的特性，基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme开发的生物传感器具有灵敏度高、稳定性好以及操作简便等特点，因而被进一步应用于生物标志物、微生物与生物毒素以及金属离子等方面的检测。

  3.1   生物标志物的检测

  生物标志物是指可用于客观评估正常生物学过程、致病过程以及治疗干预后的药理反应的指标，其生化实体覆盖很广，如蛋白质、酶、核酸以及体内发现的肿瘤细胞等，被广泛用于疾病的识别、分类、早期诊断和预防，对临床诊断和治疗具有重要的意义^[28-29]。但由于存在于体内的生物标志物含量低、背景复杂、干扰大，对其进行检测通常很困难。所以，临床上急需一种可准确、可靠、灵敏且快速的检测方法对其进行检测。Hemin/G-quadruplex DNAzyme所具有的较高的催化活性、高生物相容性、高热稳定性、可编程、易修饰性以及简便制备性成功地吸引了研究人员的关注，基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme开发了一系列用于灵敏地检测生物标志物的生物传感器。其中用于凝血酶的检测的研究最为常见，基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器对其以及其它的生物标志物的检测性能分别如表 1^[30-33]、表 2^[34-42]所示。

  表 1

  

  表 1  基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器对凝血酶的检测性能^[30-33]

  Table 1.  Detection performance of biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme for Thrombin^[30-33]

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  Signal amplifier	Method	Detection limit	Linear range	Ref.
  Goxa/HG-DNAzymeb	Electrochemistry	0.3 fmol/L	1 fmol/L to 10 nmol/L	[30]
  Cu2O-Auc/HG-DNAzyme	Electrochemistry	23 fmol/L	100 fmol/L to 20 nmol/L	[31]
  HG-DNAzyme/T-Aptd/SiO2@GOe@CFf	Chemiluminescence	6.3 fmol/L	15 fmol/L to 25 nmol/L	[32]
  HG-DNAzyme/peptide-PtNTsg@rGOh	Electrochemistry	15 fmol/L	50 fmol/L to 60 nmol/L	[33]
  a.Glucose oxidase；b.Hemin/G-quadruplex DNAzyme；c.Cuprous oxide and Au nanomaterials；d.Thrombin aptamer；e.Graphene oxide；f.Carbon fiber；g.Platinum nanotubes；h.Reduced graphene oxide.

  表 2

  

  表 2  基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器对其他生物标志物的检测性能^[34-42]

  Table 2.  Detection performance of biosensor based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme for other biomarkers^[34-42]

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  Detection target	Method	Detection limit	Linear range	Ref.
  Gastric cancer exosomes	Electrochemistry	9.54×102 particles/mL	4.8×103 to 4.8×106 particles/mL	[34]
  HepG2a	Electrochemistry	5 cells/mL	1×102 to 1×107 cells/mL	[35]
  Target DNA	Electrochemistry	54 fmol/L	100 fmol/L to 1 nmol/L	[36]
  MicroRNA-205	Chemiluminescence	0.13 nmol/L	0.4 to 62.5 nmol/L	[37]
  Lysozyme	Chemiluminescence	1.25×10-11 g/L	2.64×10-10 to 6.6×10-8 g/L	[38]
  CEAb	Electrochemistry	3.2 fg/mL	10 fg/mL to 200 ng/mL	[39]
  CEA	Chemiluminescence	63 pg/mL	0.1 to 150 ng/mL	[40]
  PDGF-BBc	Colorimetry	0.055 pg/mL	0.1 to 1000 pg/mL	[41]
  IFN-γd	Electrochemistry	0.6 fmol/L	1 fmol/L to 50 pmol/L	[42]
  a.Human liver hepatocellular carcinoma cells；b.Carcinoembryonic antigen；c.Platelet-derived growth factor；d.Interferon-gamma.

  Kong等^[30]利用低背景信号的高效靶标活化酶级联电催化技术，即通过调节靶标诱导的Hemin/G-quadruplex DNAzyme和葡萄糖氧化酶(GOx)之间的电催化效率，建立了凝血酶超灵敏检测的电化学生物传感器(图 3a)。该系统使用刚性DNA四面体(TDN)支架将葡萄糖氧化酶(GOx)锚定在远离电极表面的顶点，引入目标凝血酶和Hemin，就会在电极表面附近的TDN的另一个顶点处形成充当电化学信号探针的Hemin/G-quadruplex DNAzyme，从而激活高效酶级联电催化，产生用于目标检测的理想电化学响应。这种直接化学策略不仅可以避免在现有的两种生物酶的传统级联电催化中的高背景信号，而且可以同时提高酶级联的电催化效率，实现生物分子的超灵敏电分析检测。该电化学生物传感器对目标凝血酶的检测限低至0.3 fmol/L。

  图 3

  

  图 3.  (a) 基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测凝血酶的示意图^[30]；(b)基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测HepG2细胞的示意图^[35]

  Figure 3.  (a)Schematic diagram for the detection of Thrombin by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[30].(b)Schematic diagram for the detection of HepG2 cells by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[35]

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  Huang等^[34]报道了一种基于Hemin/G-Quadruplex辅助信号放大策略的灵敏传感器，用于胃癌外泌体的电化学检测。该平台包含抗CD63抗体修饰的金电极和胃癌外泌体特异性适体，适体连接至与G-四链体环形模板互补的引物序列。当胃癌外泌体存在时会触发滚环扩增(RCA)并生成大量的G-四链体单位。然后产物与血红素一起孵育形成Hemin/G-quadruplex DNAzyme，这种类似于过氧化物酶的DNAzyme会催化H₂O₂的还原并产生电化学信号，从而实现胃癌外泌体的特异性检测。该适体传感器对胃癌外泌体的检测限为9.54×10² particles/mL，线性响应范围为4.8×10³~4.8×10⁶ particles/mL。该电化学适体传感器的检出限低于大多数先前报道的方法，其高灵敏度归因于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme对RCA反应产生的过氧化氢还原和信号放大的联合作用。

  Chen等^[35]基于多支杂交链反应扩增策略和DNA纳米结构建立了一种适体传感器，用于人肝癌细胞(HepG2细胞)的灵敏电化学检测(图 3b)。将扩展了适体的DNA四面体修饰在金电极上，其特异性捕获HepG2细胞后，借助适体和HepG2细胞的特异亲和力，将由MIL-101(一种典型的Fe-金属-有机骨架)@AuNPs、HRP以及Hemin/G-Quadruplex DNAzyme合成的功能性杂合纳米探针附着到细胞上，形成三明治结构。功能性杂合纳米探针在H₂O₂的存在下氧化对苯二酚(HQ)产生电化学信号，从而实现对HepG2细胞的检测。该生物传感器由于采用了MIL-101@AuNPs、HRP和Hemin/G-Quadruplex DNAzyme作为三重信号放大，且引入了DNA四面体结构，显示出高选择性、可接受的灵敏度和良好的可靠性，其检测下限为5个细胞/mL。

  Gao等^[36]基于邻近杂交触发Hemin/G-quadruplex DNAzyme形成，构建了一种无标记的电化学DNA传感器。首先将硫醇化修饰的G-DNA1固定在Au电极表面上。在存在目标DNA的情况下，就会通过形成Y型结构三元复合物触发G-DNA1，Hemin和G-DNA2的邻近组装，导致Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的形成，从而生成电化学信号。该传感器观察到的信号增益实现了54 fmol/L的检测极限，线性动态范围为100 fmol/L~1 nmol/L。

  Sun等^[38]制备了溶菌酶适体(L-Apt)和Hemin/G-quadruplex DNAzyme修饰的石墨烯量子点@氧化石墨烯@碳纤维复合材料(DNAzyme/L-Apt/GQDs@GO@CF)，并利用此复合材料实现了对溶菌酶(LZM)的灵敏化学发光检测。该课题组先是合成了GQDs@GO@CF复合材料，然后，将L-Apt固定在GQDs@GO@CF的表面上，提高了复合材料的特异性识别能力；随后，通过碱基互补配对作用将具有类过氧化物酶活性的Hemin/G-quadruplex DNAzyme与L-Apt结合在一起。当LZM存在时，由于LZM与L-Apt之间具有较强的特异性识别能力，DNAzyme将从L-Apt/GQDs@GO@CF表面被释放出来，释放的DNAzyme便进一步催化CL(化学发光)反应，产生CL信号，实现对LZM的检测。由于GQDs@GO@CF为L-Apt提供了丰富的结合位点、LZM与L-Apt之间具有较强的特异性识别特性以及Hemin/G-quadruplex DNAzyme具有较高的催化活性，该用于LZM检测的CL生物传感器显示出较高的灵敏度，线性范围为2.64×10^-10~6.60×10^-8 g/L，检测限为1.25×10^-11 g/L。

  Hemin/G-quadruplex DNAzyme所具有的比天然过氧化物酶更高的稳定性以及较高的催化活性，使得基于其开发的用于生物标志物检测的生物传感器与传统生物传感相比，具有稳定性、灵敏度和准确度更高的特性。除此之外，基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的电化学生物传感器还具有检测装置轻便、廉价、响应时间短以及易于微型化和集成化的优点，但附加的电子介质会使电化学生物传感器的化学背景信号较高，检测限较高。基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的化学发光生物传感器是一类以高灵敏的CL反应为换能反应且用来确定某些生物组分含量的生物传感器，具有检测限低、线性工作范围广、信燥比高等特点，但其特异性较差，未来可通过引入一些特定的识别材料来改善。尽管目前基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme开发的用于生物标志物检测的生物传感器已具有较好的灵敏度和准确度，但它仍有改进的可能性，这一点可从提高Hemin/G-quadruplex DNAzyme的稳定性和催化活性出发，也可结合具有优异性能的纳米材料。

  3.2   微生物与生物毒素的检测

  食源性致病微生物，如单核细胞增生性李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157：H7，可通过污染食物而导致人类或动物食物中毒甚至患上威胁生命的食源性疾病^[43]。生物毒素是微生物的次生代谢产物，对人类和动物具有肾毒性、致畸性和致癌性，且一旦进入食物链便很难去除^[44]。生物毒素中最常见且毒性较强的是黄曲霉素和赭曲霉素，广泛存在于谷类和豆类等农产品中。因此，对食品中的微生物与生物毒素进行检测具有重要意义，然而，传统检测方法大多需要使用较为复杂的设备且不能实现快速的现场检测。Hemin/G-quadruplex DNAzyme的出现为开发快速、简便、灵敏的用于微生物与生物毒素的检测的生物传感器提供了可能性，对于微生物，通常是利用其自身的DNA序列实现对其的检测，而生物毒素，通常可简便地基于适体实现检测。近年来，基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器对微生物与生物毒素的检测性能如表 3^[45-51]所示。

  表 3

  

  表 3  基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器对微生物与生物毒素的检测性能^[45-51]

  Table 3.  Detection performance of biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme for microorganisms and biotoxin^[45-51]

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  Detection target	Method	Detection limit	Linear range	Ref.
  L. monocytogenesa	Colorimetry	47.5 CFU per reaction	-b	[45]
  S. enterica Typhimuriumc	Colorimetry	-	1~105 CFU/mL	[46]
  S. aureusd	Chemiluminescence	5 CFUe/mL	5~104 CFU/mL	[47]
  OTAf	Chemiluminescence	4.28 pg/mL	0.01~100 ng/mL	[48]
  AFB1g	Colorimetry	1 pmol/L	1 pmol/L~100 nmol/L	[49]
  LPSh	Colorimetry	100 pg/mL	1~200 ng/mL	[50]
  L. monocytogenes	Chemiluminescence	1.1 fmol/L	0.002~20000 pmol/L	[51]
  a.Listeria monocytogenes；b.Not mentioned；c.Salmonella enterica Typhimurium；d.Staphylococcus aureus；e.Colony Forming Units；f.Ochratoxin A；g.Aflatoxin B1；h.Lipopolysaccharides.

  Liu等^[45]开发了基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的环介导等温扩增(LAMP)生物传感平台，用于单核细胞增生李斯特菌的比色检测(图 4a)。该课题组设计了4种引物以与目标DNA中的6个不同序列杂交，从而在LAMP步骤中进行了高度特异性的扩增。在添加Hemin的情况下，在LAMP中同时扩增的G-四链体序列会形成DNAzyme。具有类过氧化物酶活性的DNAzyme将无色的ABTS氧化为绿色的ABTS^·+，从而实现单核细胞增生李斯特氏菌的比色检测，该测定法每次反应可特异性检测出低至47.5 CFU的单核细胞增生李斯特菌，且该比色检测法已成功应用于检测加标猪肉样品中的单核细胞增生李斯特菌。

  图 4

  

  图 4.  (a) 基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测单核细胞增生李斯特菌的示意图^[45]；(b)基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测赭曲霉素的示意图^[48]

  Figure 4.  (a)Schematic diagram for the detection of Listeria monocytogenes by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[45].(b)Schematic diagram for the detection of Ochratoxin A by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[48]

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  用于金黄色葡萄球菌检测的生物传感器通常是建立在间接监测菌株产生的特定细菌DNA序列或特征性生物毒素上，很难将死细菌与活细菌区分开来。为了解决这个问题，Xu等^[47]采用切刻酶扩增反应(NEAR)和滚环扩增(RCA)技术，建立了基于适体的超灵敏金黄色葡萄球菌化学发光生物传感器。该课题组先是开发了包含适体和探针序列的适体探针(AP)，其可将输入的金黄色葡萄球菌菌株转化为探针序列信号，从而使释放的探针序列的浓度与输入即金黄色葡萄球菌菌落的数量成正比。随后，所得的游离探针充当引物引发NEAR和RCA反应，进一步放大检测信号。通过扩增RCA的环状模板(CT)富集富含G的片段，并使富含G的片段在K⁺和Hemin的存在下形成Hemin/G-quadruplex DNAzyme。最后该复合物催化H₂O₂介导的鲁米诺氧化，从而触发化学发光信号，实现金黄色葡萄球菌的检测，该生物传感器在5~10⁴ CFU/mL的浓度下具有良好的线性相关性，检测限为5 CFU/ mL。

  Shen等^[48]使用单二氧化硅光子晶体微球(SPCM)和Hemin/G-quadruplex DNAzyme构建了高通量、低背景信号的基于适体的化学发光生物传感器，用于赭曲霉素(OTA)的检测(图 4b)。将包含血红素和OTA的适体序列的DNA序列固定在SPCM的表面上，当样品中存在血红素和OTA时，血红素及其适体将自组装形成Hemin/G-quadruplex DNAzyme。同时，OTA与其适体结合。然后在上述系统中添加鲁米诺和H₂O₂，Hemin/G-quadruplex DNAzyme催化鲁米诺产生化学发光。此外，该课题组设计了封闭链B，样品中存在OTA时，其不会与其互补DNA序列杂交。相反，不存在OTA时，封闭链B很容易与其互补DNA杂交，并且消除Hemin/G-quadruplex DNAzyme，使之不会产生化学发光信号。所以，该生物传感器具有高通量、低背景信号的特性，其线性检测范围为0.01~100 ng/mL，检测限为4.28 pg/mL。

  Wu等^[49]巧妙地将发夹DNA探针与核酸外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)辅助的信号放大相集成，构建了用于黄曲霉毒素B1(AFB1)扩增检测的免洗和无标记比色生物传感器。AFB1的存在可激活Exo Ⅲ对发夹探针的连续裂解反应，使得大量自由G-四链体序列自动积累，G-四链体与辅因子血红素结合便可形成具有类过氧化物酶活性的Hemin/G-quadruplex DNAzyme，从而在存在H₂O₂的情况下催化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)氧化产生比色响应。因此，该生物传感器可简便、快速的检测AFB1，其可通过肉眼检测到低至1 pmol/L的AFB1。

  综上所述，基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器利用微生物与生物毒素自身的DNA序列或适体便可实现快速、简便、准确的检测，这为食品的安全提供了一份可靠的保障。基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme开发的用于微生物与生物毒素的生物传感器不仅包括之前所述的电化学生物传感器和化学发光生物传感器，还包括比色生物传感器。比色生物传感器是一类通过对生物分析物的颜色变化进行视觉观察或光谱测量来检测所含目标物的生物传感器，在某些情况下，可直接通过肉眼去观察颜色变化，具有便携、简单易行的特点，可用于现场检测，而电化学生物传感器和化学生物传感器因需要专门的分析仪器才能得到输出信号，不适用于现场检测。但基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的用于微生物与生物毒素检测的比色生物传感器仍然存在背景信号较高，检测限高的不足之处，未来还应充分利用Hemin/G-quadruplex DNAzyme的可编程性和可修饰性，从而进一步使得检测方法灵敏度更高、准确度更可信，并能拓宽其应用，而不再局限于待测物本身的特性。

  3.3   金属离子的检测

  重金属离子是一种会通过食物链严重损害人类健康和生态系统的污染物，常见的重金属离子有铅离子(Pb²⁺)、汞离子(Hg²⁺)和铜离子(Cu²⁺)^[52]。基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器可结合一种特殊的功能性核酸，即Pb²⁺依赖性DNAzyme，实现对Pb²⁺的检测，Pb²⁺依赖性DNAzyme对Pb²⁺具有特异性识别能力，可以在其特定位置剪切互补链。结合胸腺嘧啶-Hg²⁺-胸腺嘧啶(T-Hg²⁺-T)碱基对配位，可实现Hg²⁺的检测。对于Cu²⁺的检测，可利用铜(Ⅰ)离子(Cu⁺)催化的点击化学或结合Cu²⁺依赖性DNAzyme实现对其的检测。近年来，研究人员们结合核酸放大技术或通过引入纳米复合材料的方式开发了许多用于灵敏地检测金属离子的基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器，它们对金属离子的检测性能如表 4^[53-58]所示。

  表 4

  

  表 4  基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器对金属离子的检测性能^[53-58]

  Table 4.  Detection performance of biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme for Metal ion^[53-58]

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  Detection target	Method	Detection limit	Linear range	Ref.
  Pb2+	Electrochemistry	3.3 fmol/L	10 fmol/L~200 nmol/L	[53]
  Pb2+	Electrochemistry	38 fg/mL	0.1 pg/mL~1000 ng/mL,	[54]
  Hg2+	Colorimetry	2 pmol/L	0.05~2 nmol/L	[55]
  Cd2+	Colorimetry	10 pmol/L	10 pmol/L~1 mmol/L	[56]
  Zn2+	Colorimetry	3.5 nmol/L	10 nmol/L~100 μmol/L	[57]
  Cu2+	Colorimetry	5.9 nmol/L	0.05~50 μmol/L	[58]

  Qing等^[53]基于同时用作双酶和直接电子介体的Hemin/G-quadruplex纳米线开发了一种超灵敏的电化学生物传感器，用于Pb²⁺的检测(图 5a)。靶标Pb²⁺特异性识别并切割固定在玻碳电极上的Pb²⁺依赖性DNA酶后会促进引物的捕获，该引物在存在Hemin的情况下会进一步触发RCA产生了大量的Hemin/G-quadruplex纳米线。所形成的Hemin/G-quadruplex纳米线同时起到烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶和HRP的作用，将电解质中的NADH氧化为NAD⁺，同时生成大量H₂O₂，从而加速血红素直接电子转移到电极，显著改善与目标Pb²⁺浓度有关的电化学响应，实现了Pb²⁺的超灵敏检测，该策略避免了电化学信号标签的繁琐标记过程，其对Pb²⁺的线性检测范围为10 fmol/L~200 nmol/L，检测限为3.3 fmol/L。

  图 5

  

  图 5.  (a) 基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测Pb²⁺的示意图^[53]；(b)基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测Hg²⁺的示意图^[55]

  Figure 5.  (a)Schematic diagram for the detection of Pb²⁺ by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[53].(b)Schematic diagram for the detection of Hg²⁺ by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[55]

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  熵驱动的催化反应是基于熵的增加，由一系列的链置换反应组成。在整个过程中碱基对的总数不变，从而可以提供可靠和准确的结果。基于此，Yun等^[55]提出了一种基于T-Hg²⁺-T配位化学和熵驱动的催化反应的用于Hg²⁺检测的比色生物传感器(图 5b)。T-Hg²⁺-T配位化学诱导熵驱动的催化反应的发生，从而释放富含G的序列，该序列在Hemin和K⁺的辅助下会形成具有类过氧化物酶活性的Hemin/G-quadruplex DNAzyme，并催化TMB变成自由基阳离子TMB⁺，使溶液颜色从无色变为蓝色。熵驱动催化反应的高扩增效率和T-Hg²⁺-T配位化学的强亲和力大大地提高了对Hg²⁺检测的灵敏度和准确度，该策略的检测限低至2 pmol/L。

  Zhou等^[56]在目标诱导的三向G-四链体连接的基础上，成功开发了用于检测镉离子(Cd²⁺)的比色测定法。其工作原理是基于可以在没有任何酶的情况下进行的脚趾介导的链置换反应，选择3个发夹结构(H1、H2和H3)通过一系列脚趾介导的链置换反应来构建三向G-四链体连接，以放大级联信号。当Cd²⁺存在时，加入血红素便可形成了大量的Hemin/G-quadruplex DNAzyme，从而生成肉眼可观察到的颜色信号，实现对Cd²⁺的检测。该生物传感器对Cd²⁺表现出出色的特异性和灵敏度，检测限低至10 pmol/L，且操作简单方便，无需进行标记，清洗和修饰，因此适用于Cd²⁺的常规监测。

  Ge等^[58]利用点击化学和Hemin/G-quadruplex DNAzyme构建了一种比色生物传感器，其可在没有固定和洗涤步骤的情况下，灵敏快速地检测Cu²⁺。该比色生物传感器的反应机理为抗坏血酸钠还原剂还原Cu²⁺产生Cu⁺后会促进叠氮化物和炔烃修饰的短G富集序列之间的环加成反应发生，从而使其连接成G-四链体形成序列，该序列在Hemin和K⁺的存在下自组装成Hemin/G-quadruplex DNAzyme。该DNAzyme可以借助H₂O₂将其无色底物TMB催化为自由基阳离子TMB⁺的蓝色产物，从而实现Cu²⁺的比色检测，该方法的线性检测范围为0.05~50 μmol/L，检测限为5.9 nmol/L。上述几个报道充分说明，基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器结合金属离子相应的化学特性，可实现金属离子的灵敏检测。

  4.   结论与展望

  本文总结了近年来Hemin/G-quadruplex DNAzyme活性增强策略的研究进展及其在生物传感器中的应用。与天然过氧化物酶相比，Hemin/G-quadruplex DNAzyme具有良好的热稳定性、生物相容性、可编程性、易修饰性、成本低、制备过程简易、易存储以及催化活性可控等特性，被广泛地用于开发检测各种目标分析物的生物传感器，且均表现出较令人满意的灵敏度和准确度。但其催化活性仍不能与天然蛋白酶相媲美，而催化活性对所开发的生物传感器的灵敏度起着决定性的作用。所以，为了进一步拓宽Hemin/G-quadruplex DNAzyme在生物传感器领域的应用，充分发挥其潜力，研究人员们应深入研究形成G-四链体的序列、血红素的可修饰性、血红素与G-四链体结合的方式以及Hemin/G-quadruplex DNAzyme的可修饰性，即从最本质进行研究，从而开发出更有效的酶活性增强策略。在应用方面，近年来，Hemin/G-quadruplex DNAzyme大多被用于比色、化学发光以及电化学生物传感器领域，事实上，可以引入更灵敏的检测手段，如荧光传感。此外，研究人员们应充分利用Hemin/G-quadruplex DNAzyme的可编程性和易修饰性，从而最大程度地减小背景信号，除了结合其自身的核酸放大技术，还可以结合近年来发展起来的纳米材料，相信这将会进一步提高整个生物传感器的灵敏度。预计未来，Hemin/G-quadruplex DNAzyme的发展是迅速的。

  
  
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  图 1  不同类型的G-四链体的示意图，(a)分子间平行的四链四链体；(b)分子间平行的双链四链体；(c和d)分子间反平行的双链四链体；(e)分子内平行的单链四链体；(f和g)分子内反平行的单链四链体；(h)分子内混合平行的四链体^[6]。(箭头代表核苷酸链从5′-3′的走向)

  Figure 1  Schematic representation of different types of G-quadruplex.(a)intermolecular four-stranded parallel quadruplex.(b)intermolecular two-stranded parallel quadruplex.(c and d)intermolecular two-stranded antiparallel quadruplex.(e)unimolecular parallel quadruplex.(f and g) unimolecular antiparallel quadruplex.(h)unimolecular mixed-parallel quadruplex^[6].(arrows indicate 5′-3′ polarity)

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  图 2  (a) 将Hemin/G-quadruplex DNAzyme与阳离子肽共价结合的示意图^[22]；(b)利用DNA四面体结构固定Hemin/G-quadruplex DNAzyme的示意图^[24]

  Figure 2  (a)Schematic diagram for covalent combination of Hemin/G-Quadruplex DNAzyme and cationic peptides^[22].(b)Schematic diagram for Hemin/G-Quadruplex DNAzyme fixed using DNA tetrahedron structure^[24]

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  图 3  (a) 基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测凝血酶的示意图^[30]；(b)基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测HepG2细胞的示意图^[35]

  Figure 3  (a)Schematic diagram for the detection of Thrombin by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[30].(b)Schematic diagram for the detection of HepG2 cells by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[35]

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  图 4  (a) 基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测单核细胞增生李斯特菌的示意图^[45]；(b)基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测赭曲霉素的示意图^[48]

  Figure 4  (a)Schematic diagram for the detection of Listeria monocytogenes by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[45].(b)Schematic diagram for the detection of Ochratoxin A by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[48]

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  图 5  (a) 基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测Pb²⁺的示意图^[53]；(b)基于Hemin/G-Quadruplex DNAzyme的生物传感器检测Hg²⁺的示意图^[55]

  Figure 5  (a)Schematic diagram for the detection of Pb²⁺ by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[53].(b)Schematic diagram for the detection of Hg²⁺ by biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme^[55]

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  表 1  基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器对凝血酶的检测性能^[30-33]

  Table 1.  Detection performance of biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme for Thrombin^[30-33]

  Signal amplifier	Method	Detection limit	Linear range	Ref.
  Goxa/HG-DNAzymeb	Electrochemistry	0.3 fmol/L	1 fmol/L to 10 nmol/L	[30]
  Cu2O-Auc/HG-DNAzyme	Electrochemistry	23 fmol/L	100 fmol/L to 20 nmol/L	[31]
  HG-DNAzyme/T-Aptd/SiO2@GOe@CFf	Chemiluminescence	6.3 fmol/L	15 fmol/L to 25 nmol/L	[32]
  HG-DNAzyme/peptide-PtNTsg@rGOh	Electrochemistry	15 fmol/L	50 fmol/L to 60 nmol/L	[33]
  a.Glucose oxidase；b.Hemin/G-quadruplex DNAzyme；c.Cuprous oxide and Au nanomaterials；d.Thrombin aptamer；e.Graphene oxide；f.Carbon fiber；g.Platinum nanotubes；h.Reduced graphene oxide.

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  表 2  基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器对其他生物标志物的检测性能^[34-42]

  Table 2.  Detection performance of biosensor based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme for other biomarkers^[34-42]

  Detection target	Method	Detection limit	Linear range	Ref.
  Gastric cancer exosomes	Electrochemistry	9.54×102 particles/mL	4.8×103 to 4.8×106 particles/mL	[34]
  HepG2a	Electrochemistry	5 cells/mL	1×102 to 1×107 cells/mL	[35]
  Target DNA	Electrochemistry	54 fmol/L	100 fmol/L to 1 nmol/L	[36]
  MicroRNA-205	Chemiluminescence	0.13 nmol/L	0.4 to 62.5 nmol/L	[37]
  Lysozyme	Chemiluminescence	1.25×10-11 g/L	2.64×10-10 to 6.6×10-8 g/L	[38]
  CEAb	Electrochemistry	3.2 fg/mL	10 fg/mL to 200 ng/mL	[39]
  CEA	Chemiluminescence	63 pg/mL	0.1 to 150 ng/mL	[40]
  PDGF-BBc	Colorimetry	0.055 pg/mL	0.1 to 1000 pg/mL	[41]
  IFN-γd	Electrochemistry	0.6 fmol/L	1 fmol/L to 50 pmol/L	[42]
  a.Human liver hepatocellular carcinoma cells；b.Carcinoembryonic antigen；c.Platelet-derived growth factor；d.Interferon-gamma.

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  表 3  基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器对微生物与生物毒素的检测性能^[45-51]

  Table 3.  Detection performance of biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme for microorganisms and biotoxin^[45-51]

  Detection target	Method	Detection limit	Linear range	Ref.
  L. monocytogenesa	Colorimetry	47.5 CFU per reaction	-b	[45]
  S. enterica Typhimuriumc	Colorimetry	-	1~105 CFU/mL	[46]
  S. aureusd	Chemiluminescence	5 CFUe/mL	5~104 CFU/mL	[47]
  OTAf	Chemiluminescence	4.28 pg/mL	0.01~100 ng/mL	[48]
  AFB1g	Colorimetry	1 pmol/L	1 pmol/L~100 nmol/L	[49]
  LPSh	Colorimetry	100 pg/mL	1~200 ng/mL	[50]
  L. monocytogenes	Chemiluminescence	1.1 fmol/L	0.002~20000 pmol/L	[51]
  a.Listeria monocytogenes；b.Not mentioned；c.Salmonella enterica Typhimurium；d.Staphylococcus aureus；e.Colony Forming Units；f.Ochratoxin A；g.Aflatoxin B1；h.Lipopolysaccharides.

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  表 4  基于Hemin/G-quadruplex DNAzyme的生物传感器对金属离子的检测性能^[53-58]

  Table 4.  Detection performance of biosensors based on Hemin/G-quadruplex DNAzyme for Metal ion^[53-58]

  Detection target	Method	Detection limit	Linear range	Ref.
  Pb2+	Electrochemistry	3.3 fmol/L	10 fmol/L~200 nmol/L	[53]
  Pb2+	Electrochemistry	38 fg/mL	0.1 pg/mL~1000 ng/mL,	[54]
  Hg2+	Colorimetry	2 pmol/L	0.05~2 nmol/L	[55]
  Cd2+	Colorimetry	10 pmol/L	10 pmol/L~1 mmol/L	[56]
  Zn2+	Colorimetry	3.5 nmol/L	10 nmol/L~100 μmol/L	[57]
  Cu2+	Colorimetry	5.9 nmol/L	0.05~50 μmol/L	[58]

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