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• 在农业生产中，农用化学品被广泛用于保护农作物和牲畜。但是，过量和不正确使用这些杀虫剂会导致环境污染，双甲脒农药是一类在兽医学和农业中被广泛用作杀虫剂和杀螨剂的农药^[1-4]，通过喷洒在家畜身上来抵抗昆虫和害虫，从而可能被动物食用和皮肤吸收。双甲脒母体及其代谢产物具有致癌性，经过皮肤吸收都会引起动物的中毒，造成较大危害^[5-8]。EN委员会法规2017/6233规定了双甲脒及其代谢物在各种使用过此杀螨剂的家畜中的最大残留限量(MRL)，同时我国环境保护部发布的《农药安全使用规定》将其列为高毒杀螨剂^[9]，并规定了其适用范围。但在日常生产生活中，由于双甲脒的不合理使用，常会引起牲畜中毒情况的发生^[10-12]。

  双甲脒(Amitraz, AMZ)在动物体内会代谢或降解为2, 4-二甲基苯胺(2, 4-Dimethylaniline, DMA)、单甲脒(Semiamitraz, DMPF)及2, 4-二甲基苯基甲酰胺(N-(2, 4-Dimethylphenyl)formamide, DMF)，其分子结构式见图 1。目前, 报道的关于双甲脒及其代谢物的检验方法包括气相色谱法^[13-14]、气相色谱-串联质谱法^[15-16]、液相色谱法^[16-17]及液相色谱-串联质谱法^[18-22]，其中液相色谱-串联质谱法因具有良好的灵敏度，越来越多地被用于各种食品中危害物的检测。目前, 关于已报道的双甲脒检测方法通常是酸性条件下将双甲脒水解为2, 4-二甲基苯胺，以2, 4-二甲基苯胺为检测目标物，对其定量后换算成双甲脒的含量，并不能对双甲脒及中间代谢产物进行定性定量检测^[23-25]，但该前处理方法有衍生过程，实验周期长，准确性偏低，此外，目前已有的检测方法都集中在蜂蜜和鱼类等水产品，高雪^[26]和侯建波^[27]等分别建立了蜂王浆和血液中双甲脒及其代谢物的检测方法，黄娟^[28]等建立了蔬菜水果中双甲脒及其代谢物的检测方法，而针对动物体内中双甲脒农药及其代谢产物的检测方法研究较少。因此, 建立动物体内双甲脒其代谢产物的快速、灵敏、准确的检测方法十分必要。

  图 1

  

  图 1.  AMZ及其3种代谢物DMA、DMPF和DMF的化学结构式

  Figure 1.  Chemical structures of AMZ and its metabolites DMA, DMPF and DMF

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  Captiva EMR-Lipid小柱是一种增强型脂质净化柱，其将体积排阻和疏水相互作用进行结合，通过吸附脂类分子上长直链的脂肪链，来选择性和高效性地去除脂质，而不会降低目标分析物的萃取效率^[29-30]。Captiva EMR-Lipid小柱构造简单，实用，可以简化样品前处理工作流程，本研究利用Captiva EMR-Lipid小柱净化法，建立了适合猪肉和猪肝基质中双甲脒类农药及其代谢产物的前处理方法，然后利用液相色谱-串联质谱法对双甲脒及其代谢产物进行定性定量检测。该方法具有灵敏度高、重现性好、线性范围宽、稳定性及专属性好等特点，为猪肉和猪肝中的双甲脒农药及其代谢产物检测提供了科学依据。

  1.   实验部分

  1.1   材料、试剂和仪器

  猪肉与猪肝均购自本地物美超市；乙腈(Acetonitrile, ACN)购自美国MI公司，色谱纯；甲酸(Formic acid, FA)和氢氧化铵(NH₄OH)购自中国百灵威科技有限公司，分析纯；AMZ、DMA、DMPF和DMF标准品(纯度≥99%)均购自天津阿尔塔科技有限公司，色谱纯；单个标准品储备液由乙腈配制成10 mg/mL，置于棕色容量瓶中并在-20 ℃下储存；混合标准溶液(1 mg/mL)在使用前由乙腈配制；用于冷萃取的萃取溶剂乙腈于-20 ℃下储存。

  1290-6495B型液相色谱-串联质谱仪(美国Agilent公司，配有喷射流电喷雾离子源)；Eppendorf 5810R型离心机(德国Eppendorf公司)；Milli-Q型超纯水器(美国Millipore公司)；SA-20型涡旋器(美国SI公司)；SPEX Geno/Grinder 2010型高通量动植物组织研磨机(美国SPEX SamplePrep公司)；Captiva EMR-Lipid型过滤柱、QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)型萃取试剂盒和Vac Elut 20型真空萃取装置(美国Agilent公司)。

  1.2   实验方法

  1.2.1   样品提取

  准确称取2 g粉碎的肉样品(精确至0.01 g)于50 mL具塞离心管中，加入1 mL水至猪肉样品(肝脏样品不加水)，加入两个陶瓷均质子和10 mL冰乙腈，用手剧烈震荡1 min，加入QuEChERS萃取试剂盒(含4 g Na₂SO₄和1 g NaCl)，使用高通量动植物组织研磨机在1000 r/min下振荡5 min，然后在10 ℃下以4000 r/min的速度离心5 min。移取4 mL上清液至新试管中，加入1 mL水，充分混匀。

  1.2.2   样品净化

  将5 mL样品混合液直接上样至Captiva EMR-Lipid过滤柱，调节真空萃取装置的阀以进行重力洗脱，然后真空干燥过滤柱，脂肪被最大可能地保留在Captiva EMR-Lipid小柱上，而分析物随着上样液流出。将洗脱液过0.22 μm滤膜。在样品瓶中将猪肉洗脱液用水按体积比为1:2的比例进行稀释，进样10 μL进行LC/MS/MS测定，肝脏样品无需稀释，直接进样2 μL进行测定。

  1.2.3   色谱条件

  色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流动相：A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液，B为体积分数为0.1%的甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序：0~0.5 min，5% B；0. 5~3.0 min，5%~45% B；3.0~5.0 min，45%~95% B；5.0~7.0 min，95% B；7.0~7.1 min，95%~5% B。流速保持0.4 mL/min。进样量为10 μL；柱温为35 ℃；自动进样器温度为10 ℃。

  1.2.4   质谱条件

  离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：3500 V；雾化器压力：2.41×10⁵ Pa；离子源温度：130 ℃；干燥气温度：210 ℃；干燥气流量：13 L/min；鞘气温度：400 ℃；鞘气流量：12 L/min。其它质谱条件见表 1。

  表 1

  

  表 1  双甲脒及其代谢物的质谱参数

  Table 1.  MS parameters of AMZ and its target metabolites

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  Compound	Retention time/min	Precursor ions	Product ion	Collision energy/eV
  AMZ	5.48	294.2	163.1a	9
  			122.0	32
  DMA	1.73	122.1	105.0a	17
  			103.0	25
  DMPF	2.29	163.2	122.2a	21
  			107.2	29
  DMF	3.06	150.1	107.1a	21
  			132.1	37
  a.quantitative ion.

  2.   结果与分析

  2.1   质谱条件的选择

  在正离子模式下，采用直接进样方式对10 ng/mL单化合物标准溶液进行母离子全扫描，确定分子离子峰，再以分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描。选择2个特征子离子进行测定，其中以信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子，另一个离子对作为定性离子。采用1 μg/kg猪肉和猪肝的基质匹配标准溶液对建立的质谱方法评估，初始根据响应选择DMA的定量和定性离子分别为m/z 107和m/z 77，但猪肝基质匹配标准溶液中获得两个离子色谱图受到较大的基质干扰，前延峰非常明显，如图 2所示，容易导致定量不准和离子对丰度比较大的偏差，影响最终定量的准确性，而响应强度排第三的m/z 105离子色谱图峰型对称，峰型较好，因此选择受基质干扰小的m/z 105离子为定量离子，响应强度第四的m/z 103离子作为定性离子。最终得到的AMZ和3种代谢物的定量离子色谱图如图 3所示。

  图 2

  

  图 2.  液相色谱-串联质谱采集猪肝基质中DMA不同离子的色谱图(1 μg /kg)

  Figure 2.  LC-MS/MS chromatograms of different ions of DMA in matrix-matched standard solution with 1μg/kg

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  图 3

  

  图 3.  AMZ和3种代谢物(DMA、DMPF和DMF)定量离子的色谱图(10 μg/kg)

  Figure 3.  LC-MS/MS chromatograms of the quantitative ions of AMZ and three metabolites (DMA, DMPF and DMF in methanol spiked at 10 μg/kg

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  2.2   提取条件的选择

  分散固相萃取(dispersive solid phase extraction)是近年来发展起来的一种快速(quick)、简单(easy)、廉价(cheap)、高效(effective)、耐用(rugged)、安全(safe)的多种类多残留检测前处理方法，简称为QuEChERS^[31-32]。理想的QuEChERS是分散于提取溶液中的净化吸附剂吸附干扰基质而不吸附待测目标化合物, 研究首先对QuEChERS盐析方法和不盐析萃取法的萃取效果进行了对比。样品上样到Captiva EMR-Lipid过滤柱时，采用乙腈/水(体积比80:20)溶液时，可以获得满意的基质去除效果，因此使用该混合溶液作为萃取剂。当采用溶剂萃取不盐析操作方法时，获得目标物的峰面积偏低，这是由于不加盐包导致水和乙腈混溶，导致实际取出上清液体积不到4 mL，若不使用内标校正，将无法获得准确的计算结果。当采用QuEChERS盐析萃取操作时，则明显改善了DMF、AMZ和DMPF的萃取效率，如图 4所示，故本实验选择QuEChERS盐析萃取方法。

  图 4

  

  图 4.  萃取类型对4种分析物响应的影响(n=6)

  Figure 4.  The effect of the extraction type on the response of four analyzes(n=6)

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  对于动物源性样品基质，考察了酸性、中性和碱性乙腈作为提取剂时对4种分析物响应的影响，如图 5所示，当2%甲酸/乙腈酸性作为提取剂时，AMZ发生了降解，响应值很低，与已有研究结果一致^[32-34]。当直接选用乙腈作为提取剂时，4种分析物均具有最大的响应，因此选用纯乙腈作为提取剂。

  图 5

  

  图 5.  提取溶剂对4种分析物响应的影响(n=6)

  Figure 5.  The effect of the extraction solvent on the response of four analyzes(n=6)

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  2.3   方法线性关系与定量限

  分别配制质量浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100和200 μg/kg的猪肉和猪肝基质匹配标准溶液，按本方法确定的条件分别进样分析，以目标物峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(X，μg/kg)为横坐标绘制标准曲线。由表 2可知，AMZ、DMA在1~200 μg/kg范围内以及DMF、DMPF在0.1~200 μg/kg范围内呈良好线性关系，相关系数(R²)均大于0.991。以10倍信噪比(S/N=10)计算方法定量下限，AMZ、DMA、DMF和DMPF在猪肉和猪肝基质中的定量限分别为0.6、0.6、0.05、0.05 μg/kg。DMPF及其代谢物DMF的定量限均低于0.1 μg/kg，而法规要求的AMZ及其代谢物DMA的定量限也远低于欧盟规定的最大限量标准值(猪肉0.4 mg/kg，猪肝0.2 mg/kg)，故该方法表现出较高的检测灵敏度。

  表 2

  

  表 2  AMZ及其3种代谢物在猪肉和猪肝基质中的线性范围、相关系数和定量限

  Table 2.  The linear range, correlation coefficient and LOQ of AMZ and three target metabolites in pork and liver matrix

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  Compound	Matrix	Linear equation	Linear range/(μg·kg-1)	Correlation coefficient, R2	LOQ/(μg·Kg-1)
  AMZ	Pork	y=22791x-139269	1~200	0.991	0.6
  	Liver	y=85392x+101205	1~ 200	0.991	0.6
  DMA	Pork	y=85618x-48943	1~200	0.995	0.6
  	Liver	y=53809x+3267	1~200	0.999	0.6
  DMPF	Pork	y=238051x-190781	0.1~200	0.998	0.05
  	Liver	y=16352x-8345	0.1~200	0.997	0.05
  DMF	Pork	y=46753x-27950	0.1~200	0.999	0.05
  	Liver	y=28073x-1238	0.1~200	0.995	0.05

  2.4   方法准确度与精密度

  在猪肉和猪肝中分别进行低浓度(0.1和1 μg/kg)、中等浓度(5 μg/kg)和高浓度(50 μg/kg)3个浓度水平的加标回收实验，每浓度做6个平行。结果如表 3所示，双甲脒及其3种代谢物的回收率在60.2%~127.4%之间，相对标准偏差(RSD)均小于12%。与猪肉基质相比，猪肝基质更加复杂，含水量更高，在萃取过程中部分AMZ和DMPF分配在水中未被完全萃取出来，导致回收率偏低，但方法的准确度和精密度均可满足实际样品检测需求。

  表 3

  

  表 3  双甲脒及其3种代谢物在猪肉和猪肝基质中准确性和精密度实验(n=6)

  Table 3.  The accuracy and precision of the amitraz and three target metabolites in pork and liver(n=6)

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  Spike level
  Compound	Matrix	0.1 μg/kg		1 μg/kg		5 μg/kg		50 μg/kg
  		Rec/%	RSD	Rec/%	RSD	Rec/%	RSD	Rec/%	RSD
  AMZ	Pork	-	-	127.4	1.9	118.7	4.7	79.1	5.4
  	Liver	-	-	60.9	2.7	69.2	6.7	74.8	11.1
  DMA	Pork	-	-	87.3	5.6	82.0	10.2	87.1	5.6
  	Liver	-	-	90.1	7.3	98.4	2.3	91.9	0.7
  DMPF	Pork	73.9	1.5	66.7	3.8	68.3	10.1	66.1	7.3
  	Liver	105.6	8.5	60.4	3.6	64.4	0.8	60.2	1.6
  DMF	Pork	76.6	10.4	87.1	6.8	89.8	5.3	95.2	4.6
  	Liver	86.5	7.9	97.2	7.3	97.3	1.3	91.7	1.9

  2.5   基质效应

  采用本方法分别测定基质匹配标准溶液和溶剂标准溶液考察基质效应情况，液相色谱质谱检测目标物通常表现出基质抑制效应。其中，抑制率(%)=[(溶剂标准溶液中目标物响应值-基质匹配标准溶液中目标物响应值)/溶剂标准溶液中目标物响应值]×100%。结果如图 6所示，在猪肝中DMA和DMPF的离子抑制率相对较大，分别为42%和35%，有较强基质抑制效应，由于猪肝基质复杂，基质抑制效应更明显，但本研究最终采用基质匹配标准溶液对目标物进行定量，可有效降低基质效应对定量结果造成的影响。

  图 6

  

  图 6.  AMZ及其3种代谢物在猪肉和猪肝中基质效应对比情况

  Figure 6.  The comparison of matrix effect of four analyzes in pork and liver

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  2.6   实际样品检测

  采用建立的方法对市场采购的8批不同猪肉样品和10批不同猪肝样品进行测定，其中2个猪肉样品检出AMZ，含量分别为5.2和7.8 μg/kg，均低于欧盟规定的最大残留限量值。

  3.   结论

  本研究采用EMR-Lipid小柱净化结合LC-MS/MS法建立了猪肉和猪肝中AMZ及其3种代谢物残留量的检验方法。猪肉和猪肝中的目标物经过QuEChERS盐析萃取，再经过Captiva EMR-Lipid小柱净化后，进行LC-MS/MS分析。该方法前处理过程简便快捷，准确性和精密度高，检测成本低，DMPF及其代谢物DMF的定量限均低于0.1 μg/kg，有法规要求的AMZ及其代谢物DMA的定量限远低于欧盟规定的最大残留限量值，该方法可实现对猪肉和猪肝中双甲脒及其代谢物残留情况的有效监控。

  
  
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  图 1  AMZ及其3种代谢物DMA、DMPF和DMF的化学结构式

  Figure 1  Chemical structures of AMZ and its metabolites DMA, DMPF and DMF

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  图 2  液相色谱-串联质谱采集猪肝基质中DMA不同离子的色谱图(1 μg /kg)

  Figure 2  LC-MS/MS chromatograms of different ions of DMA in matrix-matched standard solution with 1μg/kg

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  图 3  AMZ和3种代谢物(DMA、DMPF和DMF)定量离子的色谱图(10 μg/kg)

  Figure 3  LC-MS/MS chromatograms of the quantitative ions of AMZ and three metabolites (DMA, DMPF and DMF in methanol spiked at 10 μg/kg

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  图 4  萃取类型对4种分析物响应的影响(n=6)

  Figure 4  The effect of the extraction type on the response of four analyzes(n=6)

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  图 5  提取溶剂对4种分析物响应的影响(n=6)

  Figure 5  The effect of the extraction solvent on the response of four analyzes(n=6)

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  图 6  AMZ及其3种代谢物在猪肉和猪肝中基质效应对比情况

  Figure 6  The comparison of matrix effect of four analyzes in pork and liver

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  表 1  双甲脒及其代谢物的质谱参数

  Table 1.  MS parameters of AMZ and its target metabolites

  Compound	Retention time/min	Precursor ions	Product ion	Collision energy/eV
  AMZ	5.48	294.2	163.1a	9
  			122.0	32
  DMA	1.73	122.1	105.0a	17
  			103.0	25
  DMPF	2.29	163.2	122.2a	21
  			107.2	29
  DMF	3.06	150.1	107.1a	21
  			132.1	37
  a.quantitative ion.

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  表 2  AMZ及其3种代谢物在猪肉和猪肝基质中的线性范围、相关系数和定量限

  Table 2.  The linear range, correlation coefficient and LOQ of AMZ and three target metabolites in pork and liver matrix

  Compound	Matrix	Linear equation	Linear range/(μg·kg-1)	Correlation coefficient, R2	LOQ/(μg·Kg-1)
  AMZ	Pork	y=22791x-139269	1~200	0.991	0.6
  	Liver	y=85392x+101205	1~ 200	0.991	0.6
  DMA	Pork	y=85618x-48943	1~200	0.995	0.6
  	Liver	y=53809x+3267	1~200	0.999	0.6
  DMPF	Pork	y=238051x-190781	0.1~200	0.998	0.05
  	Liver	y=16352x-8345	0.1~200	0.997	0.05
  DMF	Pork	y=46753x-27950	0.1~200	0.999	0.05
  	Liver	y=28073x-1238	0.1~200	0.995	0.05

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  表 3  双甲脒及其3种代谢物在猪肉和猪肝基质中准确性和精密度实验(n=6)

  Table 3.  The accuracy and precision of the amitraz and three target metabolites in pork and liver(n=6)

  Spike level
  Compound	Matrix	0.1 μg/kg		1 μg/kg		5 μg/kg		50 μg/kg
  		Rec/%	RSD	Rec/%	RSD	Rec/%	RSD	Rec/%	RSD
  AMZ	Pork	-	-	127.4	1.9	118.7	4.7	79.1	5.4
  	Liver	-	-	60.9	2.7	69.2	6.7	74.8	11.1
  DMA	Pork	-	-	87.3	5.6	82.0	10.2	87.1	5.6
  	Liver	-	-	90.1	7.3	98.4	2.3	91.9	0.7
  DMPF	Pork	73.9	1.5	66.7	3.8	68.3	10.1	66.1	7.3
  	Liver	105.6	8.5	60.4	3.6	64.4	0.8	60.2	1.6
  DMF	Pork	76.6	10.4	87.1	6.8	89.8	5.3	95.2	4.6
  	Liver	86.5	7.9	97.2	7.3	97.3	1.3	91.7	1.9

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