English

• 硫醇主要包括脂肪硫醇和苯硫醇。半胱氨酸(cysteine，Cys)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)等脂肪硫醇在生理过程中起着非常重要的作用^[1-7]。作为硫醇的一种，苯硫酚被广泛用于农药生产、化学合成、制药工程和工业生产中的重要中间体，其使用不可避免地面临高毒性和高污染的重要问题^[8-9]。苯硫酚及其衍生物具有高毒性，苯硫酚对鱼类的半致死剂量(LC50)范围为0.01~0.4 mmol·L^{-1 [10]}，对小鼠的LC50为2.15~ 46.2 mg·kg^{-1 [11]}。生物体长期接触硫酚会严重损害中枢神经和其他神经系统，导致呼吸急促、肌肉无力、后肢麻痹、昏迷甚至死亡^[12-13]。因此，考虑到苯硫酚对生物和环境的不良影响，开发检测苯硫酚的简单、灵敏和具有选择性的方法是非常重要的。

  由于具有成本低、灵敏度高以及生物相容性好等优点，荧光方法已在检测和标记中得到广泛应用，是一种非常有前景的工具^[14]。由于异佛尔酮衍生物类荧光染料具有给体-π-受体(D-π-A)结构，其超快的分子内转移电荷(ICT)引起大的斯托克斯位移^[15]，该类染料已经开始应用于各类荧光探针的设计^[16-17]。

  到目前为止，许多苯硫酚荧光探针已经被设计、合成出来^[18-20]，但是大多数荧光探针仍是短波长发射。我们用2，4-硝基苯氟苯修饰了二氰基异佛尔酮衍生物，用作荧光开关，以获得用于检测苯硫酚的探针YC1。由于2，4-二硝基苯强的吸电子能力导致的部分的光致电子转移(PET)过程，探针YC1基本上具有较弱的荧光。苯硫酚通过芳香族亲核取代反应机理与探针YC1发生反应，2，4-二硝基苯作为离去基团离去，随后释放荧光化合物2(发射峰主要在594 nm处)，荧光响应信号增强(turn-on)，计算得到相应的检出限为0.65 μmol·L^-1。此外，探针被成功应用于HeLa细胞内4-甲基苯硫酚的成像。

  1.   实验部分

  1.1   仪器和试剂

  1.1.1   仪器

  所用仪器有ME204E电子天平、FE20-FIve Easy Plus^TM酸度计、Bruker AVANCE-600 MHz核磁共振仪、LTQ-MS(Thermo)电喷雾质谱、U-3900紫外-可见分光光度计、F-7000荧光分光光度计、TCS SP5激光扫描共聚焦显微镜。

  1.1.2   试剂

  异佛尔酮、丙二腈、哌啶、冰醋酸、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛(香草醛)、2，4-二硝基氟苯和4-甲基苯硫酚等均为分析纯，购自上海阿拉丁试剂有限公司。4-甲基苯硫酚以及探针YC1的储备溶液用二甲亚砜(DMSO)溶液作为溶剂配制得到。

  1.2   探针YC1的制备

  探针YC1的合成路线及响应机理如Scheme 1所示，探针YC1通过3步反应即可得到。

  图式 1

  

  Scheme 1.  Synthetic route of probe YC1

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  化合物1和化合物2根据文献报道的方法合成^[21]。

  探针YC1的合成：向化合物2(640 mg，2.0 mmol)与N，N-二甲基甲酰胺(DMF，10 mL)的混合溶液中加入1-氟-2，4-二硝基苯(391 mg，2.1 mmol)和K₂CO₃(548 mg，4 mmol)，室温搅拌2 h。反应过程通过TLC监测。待反应完成后，除去溶剂。所得粗产品通过硅胶柱色谱法(乙酸乙酯/石油醚，1∶3，V/V)纯化，得到深黄色固体YC1(613 mg，产率为63%)。

  结构表征：¹H NMR(600 MHz，DMSO-d₆)：δ 8.90 (d，J=13.2 Hz，1H)，8.41(d，J=9.2 Hz，1H)，7.67(d，J= 21.9 Hz，1H)，7.59~7.47(m，1H)，7.45~7.30(m，3H)，7.03(d，J=9.3 Hz，1H)，6.93(s，1H)，3.83(d，J=19.3 Hz，3H)，2.63(d，J=18.8 Hz，2H)，2.57(s，2H)，1.04(s，6H)。¹³C NMR(151 MHz，DMSO-d₆)：δ 170.8，156.1，155.4，151.4，142.2，141.6，138.8，137.0，136.4，130.8, 130.0, 123.6，123.1，122.5，122.3，118.1，114.3，113.5, 112.6, 77.2, 56.6，42.8，38.7，32.2，27.9。ESI-MS m/z：[YC1-H]^-即[C₂₆H₂₂N₄O₆-H]^-计算值485.146 1；实测值485.147 0。元素分析按C₂₆H₂₂N₄O₆的计算值(%)：C 64.19，H 4.56，N 11.52。实测值(%)：C 64.15，H 4.57，N 11.54。

  1.3   细胞成像

  将HeLa细胞接种在激光共聚焦培养皿中，并将细胞于37 ℃、CO₂体积分数5%的孵育箱中继续培养24 h以进行荧光成像实验。荧光成像通过共聚焦激光扫描显微镜进行。在种有HeLa细胞的激光共聚焦培养皿中用探针YC1(5 μmol·L^-1)预处理20 min。外源性4-甲基苯硫酚成像：再孵入20 μmol·L^-1 4-甲基苯硫酚孵育30 min，用458 nm激发获得在红色通道中的活细胞激光共聚焦成像。

  2.   结果与讨论

  2.1   探针YC1的设计以及响应机制

  考虑到二氰基异佛尔酮作为荧光母体是一种典型的基于ICT的荧光团，具有长波长荧光发射、大的斯托克斯位移和良好的光稳定性等优势，我们选择二氰基异佛尔酮作为设计探针的荧光团，通过一个醚键，将二氰基异佛尔酮荧光母体与2，4-二硝基苯基作为识别位点的两部分连接成一体。由于2, 4- 二硝基苯强的吸电子能力导致的部分的PET过程，探针YC1基本上是较弱的荧光。苯硫酚中的羟基具有强的亲核性，通过芳香族亲核取代反应机理与探针YC1发生反应，2，4-二硝基苯作为离去基团离去，随后释放荧光化合物2(主要是酚形式，发射峰主要在594 nm处)，荧光响应信号增强(turn - on)。Scheme 2显示了YC1探针对4-甲基苯硫酚的检测机理。通过质谱法验证了该机理。在图S4(Support- ing information)的核磁氢谱中，我们找到了反应后荧光母体上活泼氢的化学位移δ=9.60。核磁结果支持了Scheme 2中的反应机理。此外，由质谱(图S5)结果发现，[YC1+4-methylthiophenol-H] -(即[C₂₆H₂₂N₄O₆+C₇H₈S-H]^-)的m/z计算值319.145 2，与实测值(319.1450 7)吻合，这也支持了Scheme 2中的反应机理。

  图式 2

  

  Scheme 2.  Response mechanism of probe YC1 for detecting 4-methylthiophenol

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.2   探针YC1识别4-甲基苯硫酚的UV-Vis吸收光谱研究

  探针YC1检测4-甲基苯硫酚的UV-Vis吸收光谱如图 1所示。当200 μmol·L^-1的4-甲基苯硫酚加入到含有10 μmol·L^-1探针YC1的PBS(磷酸缓冲盐溶液)/DMSO(1∶1，V/V，pH=7.4)体系中，随着时间的增加，405 nm处的吸收峰值逐渐下降且红移至442 nm处，同时在598 nm处出现新的吸收峰且峰值逐渐升高，同时，溶液颜色由浅黄色变为深黄色。二氰基异佛尔酮类荧光团的pK_a较高(7.90)，在生理条件下会发生部分解离，从而生成2种荧光团：酚形式(主要形式)和酚盐形式(次要形式)。405 nm为探针自身的吸收峰。当与苯硫酚反应后，生成带有羟基的二氰基异佛尔酮类荧光团，部分解离生成2种形式的荧光团的酚形式(主要形式)和酚盐形式(次要形式)，UV-Vis光谱中442 nm为酚形式的吸收，598 nm为酚盐形式的吸收。这说明探针YC1与4-甲基苯硫酚反应生成了新的化合物，与前述核磁与质谱的结果一致。

  图 1

  

  图 1.  探针YC1检测4-甲基苯硫酚的UV-Vis吸收光谱

  Figure 1.  UV-Vis absorption spectra of YC1 probe for detecting 4-methylthiophenol

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.3   探针YC1识别4-甲基苯硫酚的荧光光谱研究

  探针YC1检测4-甲基苯硫酚的荧光光谱如图 2所示。探针YC1在该体系中有较弱的荧光。当30 μmol·L^-1的4-甲基苯硫酚加入到含有5 μmol·L^-1探针YC1的PBS/DMSO(1∶1，V/V，pH=7.4)体系中，随着时间的增加，594 nm处出现明显的荧光强度增强。这说明探针YC1能够用来识别4-甲基苯硫酚，且具有明显的荧光增强(turn-on)响应。

  图 2

  

  图 2.  探针YC1检测4-甲基苯硫酚的荧光光谱

  λ_ex=420 nm, concentration of 4-methylthiophenol=30 μmol·L^-1

  Figure 2.  Fluorescence spectra of YC1 probe for detecting 4-methylthiophenol

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.4   探针YC1识别4-甲基苯硫酚的动力学研究

  探针YC1检测4-甲基苯硫酚的动力学研究使用的是荧光光谱法，结果如图 3所示。对探针YC1持续光照1.5 h之后，荧光强度基本不变，说明探针YC1具有一定的光稳定性。当不同浓度的4-甲基苯硫酚(0、5、10、15、20、25和30 μmol·L^-1)加入到含有5 μmol·L^-1探针YC1的PBS/DMSO(1∶1，V/V，pH= 7.4)体系中，可以发现4-甲基苯硫酚的浓度为20 μmol·L^-1，时间约90 min时，荧光响应信号基本达到一个动态平衡状态(激发波长为420 nm，发射波长为594 nm，激发狭缝宽度/发射狭缝宽度：5 nm/5 nm)。

  图 3

  

  图 3.  探针YC1检测4-甲基苯硫酚的动力学

  Figure 3.  Kinetic of detecting 4-methylthiophenol by YC1 probe

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.5   探针YC1识别4-甲基苯硫酚的pH体系研究

  为了考察探针YC1识别4-甲基苯硫酚的有效pH范围，我们研究了不同pH值(2~10)对探针YC1 (5 μmol·L^-1)和YC1(5 μmol·L^-1)+4-甲基苯硫酚(20 μmol·L^-1)荧光性质的影响。从图 4中，我们可以发现强酸以及强碱条件对探针YC1本身的荧光强度没有影响。而探针YC1检测4-甲基苯硫酚时，在pH=6.0~8.0范围内荧光响应信号明显。这一结果表明，该探针能够应用于生理环境下检测苯硫酚。

  图 4

  

  图 4.  不同pH值下YC1 (5 μmol·L^-1)和YC1 (5 μmol·L^-1)+4-甲基苯硫酚(20 μmol·L^-1)的荧光强度

  Figure 4.  Fluorescence intensity of YC1 (5 μmol·L^-1) and YC1 (5 μmol·L^-1)+4-methylthiophenol (20 μmol·L^-1) under different pH values

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.6   探针YC1识别4-甲基苯硫酚的选择性研究

  为了研究探针YC1的选择性，采用荧光光谱考察了探针YC1对4-甲基苯硫酚的识别性能。在含有5 μmol·L^-1探针YC1的PBS/DMSO(1∶1，V/V，pH= 7.4)体系中，先后分别加入100 μmol·L^-1各种分析物与20 μmol·L^-1 4-甲基苯硫酚，分别进行检测。各种分析物分为2组，第1组如图 5a所示，第2组如图 5b所示。可以看出，探针与其他分析物不能引起YC1在594 nm处的荧光强度增强，而只有在4-甲基苯硫酚(20 μmol·L^-1)存在的情况下，YC1在594 nm处的荧光强度才能增强。这些结果表明，探针YC1可以较好地选择性识别4-甲基苯硫酚，其他分析物的存在不干扰探针YC1对4-甲基苯硫酚的检测。

  图 5

  

  图 5.  探针YC1对4-甲基苯硫酚的选择性及分析物竞争性

  (a) 1. Blank, 2. K⁺, 3. Ca²⁺, 4. Zn²⁺, 5. Ag⁺, 6. Mg²⁺, 7. Cl^-, 8. F^-, 9. Br^-, 10. S₂O₃^2-, 11. HSO₄^-, 12. SO₄^2-, 13. NO₂^-, 14. CO₃^2-, 15. HCO₃^-; (b) 1. Cys, 2. Hcy, 3. GSH, 4. H2S, 5. Blank

  Figure 5.  Selectivity and analyte competitive of YC1 probe to 4-methylthiophenol

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.7   探针YC1识别4-甲基苯硫酚的检测限研究

  为了研究探针YC1对4-甲基苯硫酚的灵敏度，我们将不同浓度的4-甲基苯硫酚(2~10 μmol·L^-1)分别加入到含有5 μmol·L^-1探针YC1的3种不同混合体系中，测试其相应的荧光强度。根据594 nm处的荧光强度变化值与对应的4-甲基苯硫酚浓度得到工作曲线(Y=Ac+B)，c的单位为μmol·L^-1，测量时的激发波长为420 nm，结果如图 6所示。根据IUPAC规定的检测限公式：LOD=kS_b/m^[22](其中k为与置信度有关的常数，IUPAC建议取k=3，S_b为空白标准偏差，m为分析标准曲线在低浓度范围内的斜率)，可以算出探针YC1在池塘水、自来水和PBS中对4-甲基苯硫酚的检测限分别为0.19、0.38和0.65 μmol·L^-1，。

  图 6

  

  图 6.  在不同水样中探针YC1荧光强度与4-甲基苯硫酚浓度的线性相关: (a) 池塘水、(b) 自来水和(c) PBS

  Figure 6.  Linear correlation between fluorescence intensity of probe YC1 and 4-methylthiophenol concentration in different water samples: (a) pond water, (b) tap water and (c) PBS

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.8   探针YC1识别4-甲基苯硫酚的细胞成像研究

  探针YC1在活细胞内对4-甲基苯硫酚的成像标记能力通过激光共聚焦显微镜来评估。图 7所示的是将5 μmol·L^-1探针孵育到HeLa细胞中，20 min后没有明显的荧光信号；接着将5 μmol·L^-1探针孵育到HeLa细胞中，再孵入20 μmol·L^-1的4-甲基苯硫酚，30 min后产生明显的红色荧光。细胞成像实验表明探针具有较好的细胞膜通透性，并且探针可以用来标记活细胞中外源性的4-甲基苯硫酚。

  图 7

  

  图 7.  探针YC1对4-甲基苯硫酚的激光共聚焦成像: 只有探针的荧光图(a1)和明场图(a2); 外源性4-甲基苯硫酚响应荧光图(b1)和明场图(b2)

  Figure 7.  Confocal laser imaging of probe YC1: fluorescence image (a1) and bright field image (a2) of the probe; fluorescence image (b1) and bright field image (b2) of exogenous 4-methylthiophenol response

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.   结论

  我们选择具有强吸电子基的2，4-二硝基苯与二氰基异佛尔酮衍生物连接，设计并合成了基于二氰基异佛尔酮的荧光探针YC1用于特异性检测苯硫酚。苯硫酚通过芳香族亲核取代机制与探针YC1发生反应，导致2，4-二硝基苯部分离去，随后释放具有明显荧光发射的化合物2，荧光响应信号(594 nm)增强。在PBS/DMSO的体系中，YC1对苯硫酚的检出限为0.65 μmol·L^-1。该方法是基于探针YC1对4-甲基苯硫酚的识别具有荧光增强(turn-on) 的性质。此外，探针还可以在HeLa细胞中实现对外源性4-甲基苯硫酚的荧光成像。该检测方法可以为今后的苯硫酚检测提供一个有用的工具与手段。

  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn

  
  
• 1. [1]

     Yue Y K, Yin C X, Huo F J, Chao J B, Zhang Y B. Sens. Actuators B, 2016, 223: 496-500 doi: 10.1016/j.snb.2015.09.127

  2. [2]

     Yin C X, Zhang W J, Liu T, Chao J B, Huo F J. Sens. Actuators B, 2017, 246: 988-993 doi: 10.1016/j.snb.2017.02.176

  3. [3]

     Liu T, Huo F J, Li J F, Chao J B, Zhang Y B, Yin C X. Sens. Actuators B, 2016, 232: 619-624 doi: 10.1016/j.snb.2016.04.014

  4. [4]

     Yue Y K, Huo F J, Ning P, Zhang Y B, Chao J B, Meng X M, Yin C X. J. Am. Chem. Soc. , 2017, 139: 3181-3185 doi: 10.1021/jacs.6b12845

  5. [5]

     Yang Y T, Huo F J, Yin C X, Zheng A M, Chao J B, Li Y Q, Nie Z X, Ramón M M, Liu D S. Biosens. Bioelectron. , 2013, 47: 300-306 doi: 10.1016/j.bios.2013.03.007

  6. [6]

     Yang X Z, Wei X R, Sun R, XuY J, Ge J F. Spectrochim. Acta A, 2020, 226: 117582 doi: 10.1016/j.saa.2019.117582

  7. [7]

     Liu X D, Sun R, Xu Y, Xu Y J, Ge J F, Lu J M. Sens. Actuators B, 2013, 178: 525-531 doi: 10.1016/j.snb.2012.12.108

  8. [8]

     Yu D H, Huang F H, Ding S S, Feng G Q. Anal. Chem. , 2014, 86: 8835-8841 doi: 10.1021/ac502227p

  9. [9]

     Sun Q, Yang S H, Wu L, Yang W C, Yang G F. Anal. Chem. , 2016, 88: 2266-2272 doi: 10.1021/acs.analchem.5b04029

  10. [10]

      Hell T P, Lindsay R C. J. Environ. Sci. Health. Part B, 2008, 21: 349-360

  11. [11]

      Wu F, Wang H Y, Xu J C, Yuan H Q, Zeng L T, Bao G M. Sens. Actuators B, 2018, 254: 21-29 doi: 10.1016/j.snb.2017.07.037

  12. [12]

      Xie X L, Li M M, Tang F Y, Li Y, Zhang L L, Jiao X Y, Wang X, Tang B. Anal. Chem. , 2017, 89: 3015-3020 doi: 10.1021/acs.analchem.6b04608

  13. [13]

      Feng W Y, Li M X, Sun Y, Feng G Q. Anal. Chem. , 2017, 89: 6106-6112 doi: 10.1021/acs.analchem.7b00824

  14. [14]

      Hua B, Shao L, Yu G C, Huang F H. Chem. Commun. , 2016, 52: 10016-10019 doi: 10.1039/C6CC04919B

  15. [15]

      Guo Z Q, Zhu W H, Tian H. Chem. Commun. , 2012, 48: 6073-6084 doi: 10.1039/c2cc31581e

  16. [16]

      Cheng Y, Ma F L, Gu X F, Liu Z, Zhang X X, Xue T Z, Zheng Y, Qi Z J. Spectrochim. Acta Part A, 2019, 210: 281-288 doi: 10.1016/j.saa.2018.11.030

  17. [17]

      Wang J P, Wen Y, Huo F J, Yin C X. Sens. Actuators B, 2019, 294: 141-147 doi: 10.1016/j.snb.2019.05.038

  18. [18]

      Liu Q M, Li A Y, Li X K, Li B, Zhang Y H, Li J, Guo Y. Sens. Actuators B, 2019, 283: 820-830 doi: 10.1016/j.snb.2018.12.090

  19. [19]

      Lv W J, Chen Y L, Bian L, Chen X G. Talanta, 2019, 197: 204-210 doi: 10.1016/j.talanta.2019.01.022

  20. [20]

      Liu H, Guo C L, Guo S J, Fan J T, Wang L J, Shi D Y. Talanta, 2019, 201: 301-308 doi: 10.1016/j.talanta.2019.03.112

  21. [21]

      Wu Q, Yin C X, Wen Y, Zhang Y B, Huo F J. Sens. Actuators B, 2019, 288: 507-511 doi: 10.1016/j.snb.2019.03.053

  22. [22]

      Goswami S, Das A K, Manna A, Maity A K, Saha P, Quah C K, Fun H K, Abdel-Aziz H A. Anal. Chem. , 2014, 86: 6315-6322 doi: 10.1021/ac500418k

• 

  Scheme 1  Synthetic route of probe YC1

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Scheme 2  Response mechanism of probe YC1 for detecting 4-methylthiophenol

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 1  探针YC1检测4-甲基苯硫酚的UV-Vis吸收光谱

  Figure 1  UV-Vis absorption spectra of YC1 probe for detecting 4-methylthiophenol

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 2  探针YC1检测4-甲基苯硫酚的荧光光谱

  Figure 2  Fluorescence spectra of YC1 probe for detecting 4-methylthiophenol

  λ_ex=420 nm, concentration of 4-methylthiophenol=30 μmol·L^-1

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 3  探针YC1检测4-甲基苯硫酚的动力学

  Figure 3  Kinetic of detecting 4-methylthiophenol by YC1 probe

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 4  不同pH值下YC1 (5 μmol·L^-1)和YC1 (5 μmol·L^-1)+4-甲基苯硫酚(20 μmol·L^-1)的荧光强度

  Figure 4  Fluorescence intensity of YC1 (5 μmol·L^-1) and YC1 (5 μmol·L^-1)+4-methylthiophenol (20 μmol·L^-1) under different pH values

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 5  探针YC1对4-甲基苯硫酚的选择性及分析物竞争性

  Figure 5  Selectivity and analyte competitive of YC1 probe to 4-methylthiophenol

  (a) 1. Blank, 2. K⁺, 3. Ca²⁺, 4. Zn²⁺, 5. Ag⁺, 6. Mg²⁺, 7. Cl^-, 8. F^-, 9. Br^-, 10. S₂O₃^2-, 11. HSO₄^-, 12. SO₄^2-, 13. NO₂^-, 14. CO₃^2-, 15. HCO₃^-; (b) 1. Cys, 2. Hcy, 3. GSH, 4. H2S, 5. Blank

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 6  在不同水样中探针YC1荧光强度与4-甲基苯硫酚浓度的线性相关: (a) 池塘水、(b) 自来水和(c) PBS

  Figure 6  Linear correlation between fluorescence intensity of probe YC1 and 4-methylthiophenol concentration in different water samples: (a) pond water, (b) tap water and (c) PBS

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 7  探针YC1对4-甲基苯硫酚的激光共聚焦成像: 只有探针的荧光图(a1)和明场图(a2); 外源性4-甲基苯硫酚响应荧光图(b1)和明场图(b2)

  Figure 7  Confocal laser imaging of probe YC1: fluorescence image (a1) and bright field image (a2) of the probe; fluorescence image (b1) and bright field image (b2) of exogenous 4-methylthiophenol response

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
•