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• 铁是人体必需的微量元素，铁离子与血红素、蛋白质等物质形成血红蛋白和肌红蛋白，在机体中起到运输和贮氧的作用^[1~3]。然而，人体中铁离子含量并非越多越好，过量的铁可引起呕吐、腹泻及肠损害等现象^[4]。目前，检测Fe³⁺的方法主要有原子吸收光谱法^[5]、高效液相色谱法^[6]和共振光散射法^[7]等。然而，上述方法均需要昂贵的大型分析仪器，样品需要经过复杂的前处理，检测过程也极为繁琐。因此，建立快速、高效、成本低廉的铁离子检测方法具有重要的理论和实际应用价值。

  与传统的仪器分析方法相比，离子荧光探针检测方法具有选择性好、灵敏度高、操作简单、成本低等显著优点^[8]，受到广大科研工作者的关注。近年来，高灵敏度、高选择性荧光探针分子的设计已经成为该类检测方法的关键。若丹明基荧光染料以氧杂蒽为母体，该类染料结构简单、易于修饰、灵敏度高，可用于金属离子的选择性识别，已被广泛用于化学分析和生命分析领域。基于特定金属离子与探针分子的配位作用，诱导若丹明内酰胺发生开环反应导致吸收和/或荧光光谱发生变化，而进行离子选择性检测的探针设计思路行之有效。基于若丹明开环机理的荧光增强型Hg²⁺、Cu²⁺检测探针已有报道^[9~12]。然而，Fe³⁺的顺磁效应通常会导致荧光猝灭^{[13, 14]}，造成探针分子检测灵敏度下降。因此，设计一种荧光增强型Fe³⁺检测探针具有重要的学术及实际应用价值。

  本文利用可再生生物质分子莽草酸的芳构化反应巧妙合成了一种Fe³⁺荧光检测探针RhM606。该探针分子在乙醇溶液中可与Fe³⁺特异性络合导致若丹明内酰胺开环^{[15, 16]}，溶液在553nm出现强的荧光发射峰，可用于水体中Fe³⁺离子的高效检测。

  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  G9800A荧光光谱仪(美国安捷伦)；UV-2550紫外-可见分光光度计(日本岛津)；Bruker DRX-400核磁共振波谱仪(德国布鲁克)；Affinity-1S红外光谱仪(日本岛津)。

  3-脱氢莽草酸甲酯(3-MDHS)参照文献方法合成^{[17, 18]}，若丹明6G乙二胺参照文献方法合成^[19~21]，其他所有试剂均为市售分析纯级。实验中所用金属离子(Fe³⁺、Cu²⁺、Al³⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、K⁺、Co²⁺)储备液分别由Fe₂(SO₄)₃、Cu(NO₃)₂·3H₂O、Al(NO₃)₃、AgNO₃、Zn(NO₃)₂、Mg(NO₃)₂、Hg(NO₃)₂·H₂O、Pb(NO₃)₂、NaNO₃、Ni(NO₃)₂·6H₂O、Cd(NO₃)₂、KNO₃和Co(NO₃)₂·6H₂O溶于去离子水配制而成。缓冲溶液由三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)溶于水和乙醇(体积比4/6)的混合液配制而成(Tris-HCl，10mmol/L)。

  1.2   探针RhM606的合成

  将0.186g(1mmol)3-脱氢莽草酸甲酯、0.547g(1.2mmol)若丹明6G乙二胺及催化量的对甲基苯磺酸(5%)置于50mL三颈烧瓶中，并加入15mL乙醇。上述体系于回流条件下反应8h，TLC检测反应进度，待3-脱氢莽草酸甲酯耗尽后停止反应。旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到白色化合物RhM606，反应式见图式 1。

  图式 1

  

  图式 1.  RhM606的合成路线

  Scheme 1.  Synthesis route of RhM606

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  1.3   探针RhM606的表征

  采用溴化钾压片法测得该探针分子的红外光谱如图 1所示。其中，3415cm^-1为羟基O-H伸缩振动，2973cm^-1处为-CH₃及-CH₂-的特征吸收峰；1698cm^-1处为羰基特征吸收峰；1617及1507 cm^-1为苯环特征吸收峰。

  图 1

  

  图 1.  RhM606的红外光谱

  Figure 1.  IR spectrum of RhM606

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  将所得探针分子溶于DMSO-d₆，测得¹H NMR谱如图 2所示。¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆) δ：10.15 (s，1H)，7.95 (s，2H)，7.80 (t，J=8.00Hz，1H)，7.49(s，2H)，7.10(d，J=8.00Hz，1H)，6.96(m，1H)，6.69(s，1H)，6.26(s，2H)，6.09(s，2H)，5.01(s，2H)，3.77(s，3H)，3.30(m，2H)，3.10(m，4H)，2.67(s，2H)，1.75(s，6H)，1.19(t，J=8.00Hz，6H)。综上可知，分离所得白色固体为目标探针分子。

  图 2

  

  图 2.  RhM606的核磁氢谱

  Figure 2.  ¹H NMR spectrum of RhM606

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  1.4   实验方法

  1.4.1   储备液的配制

  (1) 0.5mmol/L化合物RhM606的乙醇溶液的配制：称取0.0075g RhM606溶于乙醇中并定容到25mL。(2)金属离子储备液的配制：称取所需量金属离子所对应的无机盐，用蒸馏水溶解并定容到25mL，储备液浓度为10.0mmol/L。

  1.4.2   光谱测定

  准确移取20μL 0.5mmol/L RhM606储备液到5mL的离心管中，并加入2mL Tris-HCl缓冲溶液，测其紫外-可见吸收光谱及荧光发射光谱。移取相同体积的不同金属离子储备液，加入上述探针溶液中，得到不同金属离子与探针的混合液，测其紫外-可见吸收光谱和荧光光谱，进行离子选择性研究。移取不同体积的铁离子储备液，加入到2mL pH=6.0的Tris-HCl缓冲溶液中，并向上述溶液加入探针分子使其浓度为50μmol/L，测其荧光发射光谱，进行灵敏度研究。所有荧光测试激发波长为500nm，狭缝宽度为2.5nm/5nm。注意注入的金属离子水溶液体积不能太大，以保证溶液总体积变化微小，可忽略不计。

  2.   结果与讨论

  2.1   pH对探针荧光光谱的影响

  通常情况下，若丹明基探针分子对溶液pH响应灵敏^[22~24]，为研究探针分子与金属离子的络合作用，应先排除溶液pH对探针荧光光谱的影响。我们在不同pH的Tris-HCl缓冲溶液中测定RhM606及Fe³⁺存在下的荧光光谱。由图 3可知，在强酸性(pH 2~3)条件下，探针分子溶液发射强的荧光，这与文献报道相符^[25~27]。在pH为4~9的范围内，空白探针溶液基本没有荧光，说明探针分子主要以内酰胺形式存在。但是，在pH为4~6的空白探针溶液中加入Fe³⁺后溶液出现荧光发射，且荧光强度几乎不变。上述现象说明，可以在pH为4~6的范围内利用探针分子与Fe³⁺的络合作用导致的荧光变化进行Fe³⁺的检测。在pH为7~9时，探针溶液荧光强度随pH的增强而减小，这可能是由于碱性条件下，Fe³⁺会形成Fe(OH)₃，从而减少了其与探针RhM606的络合作用。结果表明，缓冲体系的pH=4~6时可用于离子的识别研究，因此，选取pH=6的缓冲体系进行以下光谱测试。

  图 3

  

  图 3.  不同pH的Tris-HCl缓冲溶液中探针分子与Fe³⁺作用前后553nm处的荧光强度

  Figure 3.  Fluorescence intensity of probe at 553 nm in Tris-HCl buffer solution at different pH in the absence (RhM606) and presence (RhM606+Fe³⁺) of Fe³⁺

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  2.2   探针RhM606的选择性研究

  为测定探针RhM606对金属离子的识别性能，在Tris-HCl (pH=6.0，10mmol/L)的缓冲溶液中，研究了探针RhM606对不同金属离子(Fe³⁺、Cu²⁺、Al³⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、K⁺和Co²⁺)的选择性响应。

  向探针溶液中加入等量的Fe³⁺、Cu²⁺、Al³⁺、Ag⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、K⁺和Co²⁺，测试体系的紫外-可见吸收光谱，结果如图 4(a)所示。由图可知，探针溶液中加入Al³⁺、Fe³⁺和Cu²⁺均会导致体系在530nm处产生吸收峰，其中加入Fe³⁺时体系吸收强度最大(图 4(b))。图 4(c)为探针溶液中加入离子后对应的光学照片，其中加入Ag⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Cd²⁺、K⁺和Co²⁺后液颜色无明显变化，加入等量的Al³⁺、Fe³⁺和Cu²⁺后，溶液颜色由无色变为粉红色，而加入Fe³⁺时体系颜色最深。上述实验证实该探针分子与Fe³⁺有明显的络合作用；加入Fe³⁺的探针溶液出现最强吸收峰，证明该探针分子对Fe³⁺具有明显的选择性。

  图 4

  

  图 4.  探针溶液中加入不同金属离子后的紫外-可见吸收光谱(a)、530nm处的吸收强度(b)及日光灯下的光学照片(c)

  Figure 4.  The probe solutions in the presence of different metal ions: (a) UV-visible absorption spectra, (b) absorption intensity at 530 nm and (c) the optical photographs

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  采用荧光光谱仪记录上述探针溶液的荧光发射，结果如图 5(a)所示。探针溶液中加入Al³⁺、Fe³⁺和Cu²⁺后均会在553nm处出现荧光发射峰。记录553nm处的荧光强度，如图 5(b)所示，可见加入Fe³⁺所导致的荧光增强明显强于加入其他离子。图 5(c)为探针溶液中加入不同离子后，在365nm紫外灯下的荧光照片。由图可知，探针溶液中加入Fe³⁺后出现明亮的黄色荧光，而加入其他离子时，没有明显的荧光发射。结果表明，探针分子对Fe³⁺具有显著的络合和识别作用，使若丹明6G内酰胺环开环，探针溶液出现若丹明6G的特征荧光发射。

  图 5

  

  图 5.  (a) 探针溶液中加入不同金属离子后的荧光光谱；(b) 553nm处的荧光强度；(c) 365nm紫外灯下的光学照片

  Figure 5.  The probe solutions in the presence of different metal ions (a) fluorescence spectra, (b) fluorescence intensity at 530 nm and (c) the optical photographs illuminated by 365 nm UV light

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  2.3   探针分子对Fe³⁺荧光响应时间测试

  向50μmol/L探针溶液中加入Fe³⁺(100μmol/L)，于40℃恒温反应，每5min记录反应液荧光光谱，得到不同时间探针溶液的荧光光谱(图 6(a))。由图可见，随着探针与Fe³⁺作用时间的延长，553nm处的荧光强度逐渐增大；反应30min，探针溶液荧光强度的增幅减小；反应40min后，体系荧光基本恒定(图 6(b))。因此，体系的荧光测试结果均采用加入Fe³⁺后40min的测试值。

  图 6

  

  图 6.  探针溶液中加入Fe³⁺后的荧光光谱(a)及553nm处的荧光强度随时间的变化(b)

  Figure 6.  Time dependence of (a) fluorescence spectra and (b) fluorescence intensity at 553 nm for the probe solution after addition of Fe³⁺ ions

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  2.4   Fe³⁺检测灵敏度

  在pH 6.0的Tris-HCl缓冲溶液中配置50μmol/L探针溶液，逐渐增加Fe³⁺浓度，并记录体系荧光变化(图 7)。由图 7(a)可知，RhM606溶液在553nm处的荧光强度随着Fe³⁺浓度的增加迅速增大，当Fe³⁺浓度为140μmol/L时荧光强度的增幅减缓。Fe³⁺浓度为140~170 μmol/L时，体系荧光强度几乎不再发生变化。线性拟合结果显示，在10~150 μmol/L范围内，Fe³⁺浓度与探针RhM606的荧光强度呈良好的线性关系，相关系数R² =0.9879 (图 7(b))，理论检测限为3.93 μmol/L^{[28, 29]}。

  图 7

  

  图 7.  50μmol/L RhM606溶液中逐渐加入不同浓度的Fe³⁺后的荧光光谱(a)及553nm处荧光强度随Fe³⁺浓度变化图(b)

  Figure 7.  (a) Fluorescence spectra of 50μmol/L of probe solution after addition of different concentrations of Fe³⁺ and (b) fluorescence intensity at 553 nm

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  2.5   水中Fe³⁺的荧光检测

  量取5份自来水并依次加入10~50 μmol/L的Fe³⁺和50μmol/L的探针RhM606。上述体系于365nm紫外灯下的光学照片如图 8所示。由图可知，随Fe³⁺浓度的增加，体系的荧光强度逐渐增强，肉眼可识别的Fe³⁺浓度为30μmol/L。上述实验证实探针RhM606可用于水体中Fe³⁺的荧光检测。

  图 8

  

  图 8.  50μmol/L探针RhM606与不同浓度Fe³⁺的水溶液于365nm紫外灯下的光学照片

  Figure 8.  Optical photograph of RhM606 solutions (50μmol/L) with different concentrations of Fe³⁺ ions in water (illuminated by 365 nm UV light)

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  3.   结论

  本文利用若丹明6G乙二胺与3-脱氢莽草酸甲酯间的缩合芳构化反应，合成了荧光探针分子RhM606。在Tris-HCl的缓冲溶液中研究了该探针分子对不同金属离子的检测性能，结果表明该探针可选择性识别Fe³⁺；荧光滴定实验证实，探针溶液的荧光强度和Fe³⁺浓度间具有良好的线性关系，理论检出限为3.93μmol/L。故本文所合成的荧光探针可用于水体中Fe³⁺的高效检测。

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  图式 1  RhM606的合成路线

  Scheme 1  Synthesis route of RhM606

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  图 1  RhM606的红外光谱

  Figure 1  IR spectrum of RhM606

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  图 2  RhM606的核磁氢谱

  Figure 2  ¹H NMR spectrum of RhM606

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  图 3  不同pH的Tris-HCl缓冲溶液中探针分子与Fe³⁺作用前后553nm处的荧光强度

  Figure 3  Fluorescence intensity of probe at 553 nm in Tris-HCl buffer solution at different pH in the absence (RhM606) and presence (RhM606+Fe³⁺) of Fe³⁺

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  图 4  探针溶液中加入不同金属离子后的紫外-可见吸收光谱(a)、530nm处的吸收强度(b)及日光灯下的光学照片(c)

  Figure 4  The probe solutions in the presence of different metal ions: (a) UV-visible absorption spectra, (b) absorption intensity at 530 nm and (c) the optical photographs

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  图 5  (a) 探针溶液中加入不同金属离子后的荧光光谱；(b) 553nm处的荧光强度；(c) 365nm紫外灯下的光学照片

  Figure 5  The probe solutions in the presence of different metal ions (a) fluorescence spectra, (b) fluorescence intensity at 530 nm and (c) the optical photographs illuminated by 365 nm UV light

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  图 6  探针溶液中加入Fe³⁺后的荧光光谱(a)及553nm处的荧光强度随时间的变化(b)

  Figure 6  Time dependence of (a) fluorescence spectra and (b) fluorescence intensity at 553 nm for the probe solution after addition of Fe³⁺ ions

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  图 7  50μmol/L RhM606溶液中逐渐加入不同浓度的Fe³⁺后的荧光光谱(a)及553nm处荧光强度随Fe³⁺浓度变化图(b)

  Figure 7  (a) Fluorescence spectra of 50μmol/L of probe solution after addition of different concentrations of Fe³⁺ and (b) fluorescence intensity at 553 nm

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  图 8  50μmol/L探针RhM606与不同浓度Fe³⁺的水溶液于365nm紫外灯下的光学照片

  Figure 8  Optical photograph of RhM606 solutions (50μmol/L) with different concentrations of Fe³⁺ ions in water (illuminated by 365 nm UV light)

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