应用化学   2016, Vol. 33 Issue (6): 727-732   PDF    
Article Options
  • PDF
    		•
  • Full Text HTML
    		•
  • Abstract
    		•
  • Figures
  • References
    • History
  • Received: 2015-09-06
  • Revised: 2015-12-11
  • Accepted: 2015-12-11
    • 扩展功能
    把本文推荐给朋友
    加入引用管理器
    Email Alert
    RSS
    本文作者相关文章
    田振华
    张昊
    于源华
    基于特异性蛋白Gαa的比浊法检测β-葡聚糖
    田振华, 张昊, 于源华     
    长春理工大学生命科学与技术学院 长春 130022
    2015-09-06收稿, 2015-12-11修订, 2015-12-11接受
    基金项目: 吉林省科技厅资助项目（20140309013YY）资助
    通讯联系人: 于源华, 教授; Tel:0431-85583404;E-mail:yuyuanhua8888@126.com; 研究方向:生物分析检测
    摘要: 通过基因重组技术，克隆表达了β-葡聚糖特异性结合美洲鲎G因子α亚基片段a（Gαa）蛋白，并建立了β-葡聚糖比浊检测方法。克隆的Gαa基因相对分子质量为40000（1251 bp），浓度为2 g/L，纯度达到98%以上。该蛋白能与βG特异性结合，紫外分光光度计在340 nm下检测的吸光度与βG含量呈正线性相关，线性范围3.125～200 mg/L，R2=0.997，检测限3.125 mg/L。结合力实验表明，该蛋白与βG具有良好的亲和性及特异性。该方法具有成本低、快速、专一性强等特点。
    关键词: 美洲鲎G因子α亚基片段a特异性蛋白     β-葡聚糖     比浊法    
    Turbidimetry Assay for Detection of beta-Glucan by Gαa Binding Protein
    TIAN Zhenhua, ZHANG Hao, YU Yuanhua     
    School of Life Science and Technology, Changchun University of Science and Technology, Changchun 130022, China
    Received: 2015-09-06; Revised: 2015-12-11; Accepted: 2015-12-11
    Corresponding author: YU Yuanhua, professor; Tel:0431-85583025; E-mail:yuyuanhua8888@126.com; Research interests:biological analysis and detect
    Abstract: In this paper, a beta-glucan binding protein of horseshoe crab(limulus polyphemus) factor G-subunit α fragment-a was cloned, expressed and purified. A turbidimetry assay for the detection of beta-glucan was established. The DNA fragment of the binding protein gene was cloned into an expressional plasmid pET-15b. The protein was expressed with 6x-Histag on N-terminal and purified with Ni-column. The purified protein has relative molecular mass of 40000(1251 bp) on SDS-PAGE and the concentration is 2 g/L with the purity of >98%. The highly purified protein can combine with beta-glucan specifically with an affinity constant KD of 3.14×10-9 mol/L. The absorbance measurement at 340 nm using the ultraviolet spectrophotometer shows that the absorbance is linearly correlated with the concentration of beta-glucan. The linear range is 3.125~200 mg/L, R2 is 0.997, and the detection limit is 3.125 mg/L. The novel turbidimetry assay for the detection of beta-glucan has low cost, rapid, and highly sensitive and specific.
    Key words: horseshoe crab factor G-subunit α fragment-a binding protein     beta-glucan     turbidimetry assay    

    β-葡聚糖(βG)来源于新鲜的食品啤酒酵母、燕麦、食用菌类等。根据糖键结构差异可分β-(1→3)-葡聚糖和β-(1→6)-葡聚糖，其中β-葡聚糖的活性结构是由葡萄糖单位组成的多聚糖，它能够活化巨噬细胞、嗜中性白血球，从而提高白细胞素、细胞分裂素和特殊抗体的含量，全面刺激机体的免疫系统。此外，β-葡聚糖还具有清除游离基、抗辐射、溶解胆固醇，预防高脂血症及抵抗滤过性病毒、真菌、细菌等感染的功能；在治疗肿瘤、肝炎、心血管、糖尿病和降血脂、抗衰老等方面也有独特的生物活性[1-5]。因此，β-葡聚糖含量的测定在现代生物检测具有很高的应用价值。

    从国内外的研究现状可以了解到，目前用于检测β-葡聚糖的方法可归纳为以下几种：1)粘度法测定结果误差很大[6]；2)沉淀法局限性在于抽提过程不能完全排除其它物质的干扰[7]；3)刚果红用于测定啤酒中βG含量，但不适用于测定固态供试品中βG含量[8-9]；4)双酶法有较高的专一性和准确性，是目前国际上较通用的测定方法，缺点是测定时间长，试剂盒单价高，试剂保存时间短[10]；5)荧光法常在一些啤酒企业中使用，但其荧光物质的荧光性在光照条件下不稳定，随光照时间的增加会迅速下降[11]；6)苯酚-硫酸法对βG无专一性[12]；7)鲎试剂法(鲎的血细胞提取物)主要应用于检测血液中βG含量。但是鲎属于天然材料，过度提取易造成资源枯竭，存在成本高、测定时间长的缺点[13-16]。

    目前对βG浓度的测定方法均不是很理想，存在灵敏度和专一性差，价格昂贵，检测时间长等缺点。因此迫切需求一种高稳定性，低成本，快速测定βG的方法。

    本研究利用基因重组技术，克隆表达了与β-葡聚糖特异性结合美洲鲎G因子α亚基片段a蛋白，并建立了一种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法，当样品中含有βG时，蛋白与βG特异性结合，在紫外可见分光光度计下，测得在340 nm下蛋白与βG复合物的吸光度值与βG含量呈正相关。随后对该方法进行了精确度和准确度的评估，为推进β-葡聚糖检测提供了新的可能性。

    1 实验部分
    1.1 仪器和试剂

    LifeTouch基因扩增仪TC-96/G/H(b)B(上海珂淮仪器有限公司)；UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；HZQ-F160型全温振荡培养箱(哈东联公司)；HPX-9162 MBE型电热恒温培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；SPH-211B型恒温培养摇床(上海世平实验设备有限公司)；生物分子相互作用系统(自制)；FYY25001-RO型基础应用型纯水机(青岛富勒姆科技有限公司)。

    表达宿主E.coli BL21和大肠杆菌E.coli DH5α(本实验室保存)；工程菌JM109-pMD19-T-Gαa(上海生物工程有限公司构建)；BamHⅠ、NdeⅠ酶、Taq聚合酶、dNTP和10×PCR buffer(长春宝泰克制药有限公司)；低相对分子质量标准蛋白质Marker(上海生物化学研究所)；DNA胶回收试剂盒(上海生物工程有限公司)；His-Binging-resin纯化柱(上海悦克生物科技有限公司)。

    1.2 实验方法
    1.2.1 目的基因的克隆

    根据GenBank:AB547712.1上登记的美洲鲎属G因子α亚基片段a(Gαa)的基因序列，大小是1251 bp，合成为JM109-pMD19-T-Gαa的工程菌。通过表达载体的多克隆位点设计特异性引物，分别引入BamHⅠ和NdeⅠ酶切位点(斜体带下划线)。引物序列F 5′-CATATGAATACACCTTCTCCTGTTGACG-3′，引物R 5′-GGATCCTGTAACCTTTGT-3′。

    用DNA提取试剂盒对工程菌进行目的基因片段的回收，采用PCR技术克隆Gαa片段，反应体系为：模版1μL，引物2μL，10×PCR buffer 5μL，Taq聚合酶2μL，dNTP 2μL，双蒸水26μL。反应条件为：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，50℃退火30 s，68℃延伸2 min，30个循环，68℃延伸5 min。PCR扩增产物采用DNA胶回收试剂盒回收。

    1.2.2 重组表达质粒pET-15b-Gαa的构建

    将回收的目的片段在T4DNA连接酶作用下与pUCm-T连接，构建克隆载体pUCm-T-Gαa。转化至E.coli DH5α, 蓝白斑筛选阳性转化子，提取质粒用BamHⅠ和NdeⅠ双酶切，鉴定正确后，回收Gαa后与经同样双酶切的pET-15b连接，构建重组表达质粒pET-15b-Gαa，转化到大肠杆菌E.coli DH5α中，小量提取质粒，质粒鉴定正确后，送到上海生工生物工程上海(股份)有限公司测序，测序结果无误，可以将质粒转化至表达宿主E.coli BL21中。

    1.2.3 重组菌的表达纯化

    将含有重组质粒的E.coli BL21阳性菌株按体积比1：50到LB(Amp 100 mg/L)液体培养液中活化37℃，180 r/min过夜，次日转接培养的菌液按体积比120到LB(Amp 100 mg/L)液体培养液中扩大，37℃，180 r/min培养至OD600约为0.8(约在4 h)，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养48 h，培养后，将培养液进行离心分离，回收所得的沉淀物(菌体)。将沉淀物用PBS洗涤2次，然后用NPI-1重悬菌体，放一定量的溶菌酶，通过反复冻融和超声破碎，工作参数：工作时间10 s，间歇时间9 s，功率200 W，循环30次。离心10000 r/min，4℃离心10 min取上清。过柱纯化前将样品溶液用0.22μm孔径滤膜过滤。过Ni柱时按照Qiagen公司的Ni-NTA亲和层析柱的说明书纯化目的蛋白，经过透析去除多余的咪唑，浓缩，收集每步样品进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。

    1.2.4 方法学建立

    实验原理：上述纯化蛋白与β-葡聚糖溶液能够发生特异性结合形成免疫复合物。该免疫复合物溶液的浊度随着βG浓度的变化而改变，这种变化可利用紫外可见分光光度计进行测定。当340 nm波长光线通过该反应溶液时，被免疫复合物吸收，导致复合物在该波段的吸光值增大。吸光值与免疫复合物含量呈正相关，即当蛋白质浓度固定时，免疫复合物的浊度与样品βG含量成正比。通过测得的吸光值绘制出标准曲线，从而达到对未知βG浓度的定量检测。

    本文比较不同浓度的蛋白质跟相同浓度的βG反应后，在340 nm波长下得到的吸光值，找到最适合反应的蛋白质浓度。在该蛋白质浓度下加入梯度稀释的βG，绘制出复合物吸光值的曲线，逐步找到最佳的线性范围。通过5组实验，算出精确度，根据结果绘制标准曲线。

    1.2.5 方法学回收率的评估

    根据林伟静等[17]在2011年在燕麦中提取了β-葡聚糖，参考她的方法在燕麦中提取了βG，燕麦籽粒→粉碎→用不同PH的缓冲溶液分散→搅拌提取→(→等电点除蛋白)→离心分离→收集上清，对上清样品进行加标回收，评估了实验方法的准确度。

    2 结果与讨论
    2.1 目的片段的PCR扩增

    采用PCR技术对pMD19-T-Gαa质粒中Gαa进行克隆扩增，产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳结果显示，扩增目的条带相对分子质量大小为1251 bp左右，与Genebank上相符，结果如图 1所示，表明目的基因已经大量获得。

    图 1 pMD19-T-Gαa质粒PCR产物的0.8%琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 1 0.8% Agarose gel electrophoresis of pMD19-T-Gαa PCR amplified products M:Maker-DL2000; lane A:blank control; lane B:pMD19-T-Gαa PCR amplified products
    2.2 质粒pET-15b-Gαa的鉴定

    用试剂盒提取pET-15b-Gαa及pET-15b质粒，带有Gαa目的片段的质粒明显比pET-15b多1251 bp，核酸电泳结果如图 2，说明pET-15b-Gαa质粒初步构建成功。

    图 2 重组质粒pET-15b-Gαa的0.8%琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 2 0.8% Agarose gel electrophoresis of pET-15b-Gαa M:Maker-DL15000; lane A and lane B:pET-15b-Gαa; lane C.pET-15b
    2.3 重组目的菌的表达及纯化

    对重组工程菌采用IPTG诱导表达Gαa蛋白，过Ni柱纯化蛋白，用NPI-1、NPI-20、NPI-30除去杂蛋白，最后用NPI-200洗脱纯净的目的蛋白，过镍柱每步流出样经过SDS-PAGE鉴定，蛋白电泳结果如图 3所示，在约40 kD处有一条明显表达带，与预期蛋白相对分子质量相符。

    图 3 Gαa蛋白诱导表达及纯化SDS-PAGE电泳 Fig. 3 12% SDS-PAGE analysis of purified Gαa protein M:Marker; lane A.BL21-pET-15b-Gαa; lane B.the out of sample; lane C.the out of NPI-1; lane D.the out of NPI-20; lane E.the out of NPI-30; lane F.the out of NPI-200
    2.4 实验方法的原理图

    目的氨基酸C末端侧具有被认为是βG结合结构域2聚体的木聚糖Z样结构域，相当于美洲鲎属G因子α亚基的氨基酸序列的从N末端起第189位~第280位的氨基酸和第326位~第417位的氨基酸序列部分。在溶液中有βG存在时，βG会与目的蛋白的特定结构域结合，形成复合物，这种复合物用紫外可见分光光度计在340 nm波长下，其吸光值比空白值大，而且随着βG浓度的增加呈正相关，原理如图 4所示。

    图 4 实验原理图 Fig. 4 Schematic diagram of experimental design
    2.5 标准曲线的获得

    配制βG标准品的浓度为200 mg/L，将βG按体积梯度稀释，用蒸馏水代替βG进行测定作为空白值。向比色皿内加入(0.3 mL)待测样品和100 mg/L(3 mL)的特异性蛋白质，在37℃混匀，反应5 min。用紫外-可见分光光度计，在340 nm波长下测定其吸光值，同一样品测5次，再做5组相同的实验。记录实验数据并计算均值，标准差和变异系数，根据所得数据绘制标准曲线。经实验测得该方法的批内和批间变异系数均小于5%，在允许的范围内。结果如图 5所示，Y轴为实际吸光度值减去空白值，X轴为不同βG的浓度，标准曲线检测下限为3.125 mg/L，线性范围是3.125~200 mg/L，R2=0.997。

    图 5 不同浓度βG对应的吸光值的标准曲线 Fig. 5 The standard curve of different concentrations of βG
    2.6 蛋白与βG的亲合力

    用生物分子相互作用系统测定目的蛋白与βG的结合/解离平衡常数。在SA传感器前端共价偶联50 mg/L βG标准品，与浓度分别为1000、500、250、125、72.5、36.25、18.125和0 mg/L的目的蛋白进行结合反应，反应时间300 s，然后将传感器置于PBS中进行解离反应，反应时间140 s，得到结合与解离曲线。结果如图 6所示，X轴为反应时间，Y轴为传感器响应值。反应曲线经数据分析，目的蛋白与βG的结合/解离平衡常数KD=3.14×10-9 mol/L时用上述方法分别对50 mg/L脂多糖、糖原和海藻糖与目的蛋白间的结合/解离平衡常数进行测定，结果表明，目的蛋白与脂多糖、糖原和海藻糖物无亲合力。因此，目的蛋白与βG的结合有高度专一性。

    图 6 βG与不同浓度蛋白的结合与解离曲线 Fig. 6 Combination and dissociation curves of different concentrations of Gαa protein with βG ρ(Gαa)/(mg·L-1):a.1000; b.500; c.250; d.125; e.72.5; f.36.25; g.18.125; h.0.0
    2.7 方法学回收率的评估

    对提取的上清样品进行βG的检测，在已知βG浓度的燕麦样品中进行加标回收实验，将配制好的4个已知不同浓度(在标准曲线范围上)的βG标准品0.3 mL加入2 mL的上清样品，与终浓度为100 mg/L特异性蛋白质混合，补充PBS使溶液体积达到3.3 mL，在37℃混匀，反应5 min，同一浓度的βG检测5次。用蒸馏水代替βG的样品进行测定作为空白值，使用紫外-可见分光光度计，在340 nm波长下进行测定，测得特定蛋白与βG复合物的吸光值的变化，将测得的吸光值与空白值做差，得到的结果与图 5标准曲线中相同浓度对应的吸光值进行对比，算出准确度(回收率)。结果如表 1所示，回收率在97%～101%之间，在允许范围内，准确度较好。

    表 1 回收率评估结果 Table 1 Recovery evaluation result
    3 结 论

    本文成功克隆了与β-葡聚糖特异性结合美洲鲎G因子α亚基片段a的基因，相对分子质量大小为40000(1251 bp)。表达并纯化了该基因，浓度为2 g/L，纯度高达98%以上。用该蛋白检测β-葡聚糖含量的标准曲线R2=0.997，检测下限为3.125 mg/L。蛋白与β-葡聚糖的结合有高度的专一性，结合/解离常数KD=3.14×10-9 mol/L。该方法的批间和批内变异系数均小于5%，准确度(回收率)在97%~101%之间，均在允许范围内。

    本文实验所用原料均为自己表达的蛋白，弥补了酶法试剂盒单价高, 试剂保存时间短的特点，无需利用天然珍稀材料鲎(现已列入二级保护动物)试剂，有效防止资源枯竭，成本变高带来的隐患。本文实验简洁，结果回报时间短，只需5 min，便于及时反馈信息，可节约大量的人力物力，有利于大批量样品的处理，在应用中有明显优势。蛋白与βG有高度专一的亲和性，结合解离常数小，干扰因素少，结果判断更加客观、准确。本文的实验方法和实验结果表明，这种特异性蛋白检测β-葡聚糖的比浊法具有低成本、快速、高灵敏等特点，弥补了现今国内外方法的不足。在食品检测、医药开发、化妆品检测和疾病检测等领域，具有较高的实用价值和广阔的市场前景。

    参考文献
    [1] SONG Liya, HE Congfen, Research and Development of Cosmetics Plant Efficacy Additive[M]. Beijing: China Light Industry Press, 2011 : 30 -31. (in Chinese) 宋丽雅, 何聪芬, 化妆品植物功效添加剂的研究与开发[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2011 :30 -31. ()
    [2] Tapola N, Karvonen H, Niskanen L, et al. Glycemic Responses of Oat Bran Products in Type 2 Diabetic Patients[J]. Nutr Metab Cardiovasc Dis , 2005, 15 (4) : 255–261. DOI:10.1016/j.numecd.2004.09.003 ()
    [3] ZHANG Qi, ZHONG Kui, ZHOU Sumei. Moisturizing Effect Evaluation about Schizophyllan[J]. J Food Sci Tech , 2015, 15 (3) : 223–228. (in Chinese) 张琪, 钟葵, 周素梅. 裂褶多糖保湿功效评价[J]. 中国食品学报 , 2015, 15 (3) : 223–228. ()
    [4] Wahida K, Maria M, Walter P, et al. Cholesterol-Lowering Benefits of Oat-Containing Cereal in Hispanic Americans[J]. J Am Diet Assoc , 2005, 105 (6) : 967–970. DOI:10.1016/j.jada.2005.03.006 ()
    [5] Julia J Volman, Julian Ramakers, Jogchum Plat. Dietary Modulation of Immune Function by beta-Glucans[J]. Physiol Behav , 2008, 94 (2) : 276–284. DOI:10.1016/j.physbeh.2007.11.045 ()
    [6] Izydorczyk M S, Storsley J, Labossiere D, et al. Variation in Total and Soluble β-Glucan Content in Hulless Barley:Effects of Thermal, Physical, and Enzymic Treatments[J]. J Agric Food Chem , 2000, 48 (4) : 982–989. DOI:10.1021/jf991102f ()
    [7] Beer M U, Arrigoni E, AmadòR, et al. Extraction of Oat Gum from Oat Bran:Effects of Process on Yield, MolecularWeight Distribution, Viscosity and (1→3)(1→4)-β-D-Glucan Content of the Gum[J]. Cereal Chem , 1996, 73 (1) : 58–62. ()
    [8] CHAI Jikuan, HU Kaijun, ZHAO Guiqin, et al. Progress in the Study of Oat β-Glucan[J]. Pratacultural Sci , 2009, 26 (11) : 57–63. (in Chinese) 柴继宽, 胡凯军, 赵桂琴, 等. 燕麦β-葡聚糖研究进展[J]. 草业科技 , 2009, 26 (11) : 57–63. ()
    [9] LI Yongxian, YIN Xiangsheng, GU Guoxian, et al. Measurement of β-Glucan in Wort and Beer by Congo Red[J]. J Wuxi Light Ind Univ , 1997, 16 (1) : 8–13. (in Chinese) 李永仙, 尹象胜, 顾国贤, 等. 刚果红法测定麦汁和啤酒中的β-葡聚糖[J]. 无锡轻工大学学报 , 1997, 16 (1) : 8–13. ()
    [10] Cart J M. Enzymic Determination of β-Glucan in Cereal-based Food Product[J]. Cereal Chem , 1990, 67 (3) : 226–229. ()
    [11] WANG Xueli, DU Xianfeng. Preparation of β-Glucan and Fluorimetric Method for Determination[J]. China Food Addit , 2007, 17 (6) : 158–160. (in Chinese) 汪雪丽, 杜先锋. 燕麦麸中β-葡聚糖的提取及荧光法测定[J]. 中国食品添加剂 , 2007, 17 (6) : 158–160. ()
    [12] LIAN Xijun, LU Xiaoxiang, LIN Xuhui. Study on Determination of Beta-Glucan by Phenol-Sulphuric Acid Method[J]. Cereals Oils , 2005, 18 (10) : 39–43. (in Chinese) 连喜军, 鲁晓翔, 林旭辉. 苯酚-硫酸法测定β-葡聚糖含量研究[J]. 粮食与油脂 , 2005, 18 (10) : 39–43. ()
    [13] Levin J, Poore T E, Zauber N P, et al. Detection of Endotoxin in the Blood of Patients with Sepsis due to Gram-negative Bacteria[J]. N Engl J Med , 1970, 283 (24) : 1313–1316. DOI:10.1056/NEJM197012102832404 ()
    [14] Shimizu A, Oka H, Matsuda T, et al. (1-3)-beta-D Glucan is a Diagnostic and Negative Prognostic Marker for Pneumocystis Carinii Pneumonia in Patients with Connective Tissue Disease[J]. Clin Exp Rheumatol , 2005, 23 (5) : 678–680. ()
    [15] Persat F, Ranque S, Derouin F, et al. Contribution of the (1-3)-beta-D Glucan Assay for Diagnosis of Invasive Fungal Infections[J]. J Clin Microbiol , 2008, 46 (3) : 1009–1013. DOI:10.1128/JCM.02091-07 ()
    [16] Pickering J W, Sant HW, Bowles CA, et al. Evaluation of a (1-3)-beta-D Glucan Assay for Diagnosis of Invasive Fungal Infections[J]. J Clin Microbiol , 2005, 43 (12) : 5957–5962. DOI:10.1128/JCM.43.12.5957-5962.2005 ()
    [17] LIN Weijing, WU Guangfeng, WANG Qiang, et al. Comparsion of Content Determination of β-Glucan from Oat and Its Products[J]. Sci Technol Food Ind , 2011, 6 (32) : 417–420. (in Chinese) 林伟静, 吴广枫, 王强, 等. 燕麦及其制品β-葡聚糖含量测定方法比较[J]. 食品工业科技 , 2011, 6 (32) : 417–420. ()
    X