新型香豆素类Zn<sup>2+</sup>荧光探针的合成及细胞成像研究

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新型香豆素类Zn²⁺荧光探针的合成及细胞成像研究

李长伟 , 杨栋 , 尹兵 , 郭媛

西北大学化学与材料科学学院西安 710127

国家自然科学基金(Nos.21472148, 21072158)、陕西省教育厅专项基金(No.12JK0580)和西北大学优秀青年学术骨干支持计划资助项目

^*通讯作者：郭媛, E-mail: guoyuan@nwu.edu.cn

摘要：设计、合成了一种光诱导电子转移(Photoinduced Electron Transfer, PET)型香豆素类水溶性Zn²⁺荧光探针1和2.通过荧光光谱分析实验发现, 该探针具有较好的选择性和灵敏度, 其荧光强度随着Zn²⁺的浓度增大而逐渐增强, 并可成功实现对人乳腺癌细胞(MCF-7)和枯草杆菌(B.subtilis)的标记.目标探针分子结构均经¹H NMR, ¹³C NMR, IR, HRMS及X单晶射线衍射进行了表征, 并且还获得了探针2与Zn²⁺络合物[Zn(2)]的单晶结构, X单晶衍射实验表明络合物[Zn(2)]中Zn²⁺为五配位, 其几何构型为双锥体.

关键词：香豆素 Zn²⁺荧光探针细胞成像

Novel Coumarin-Based Fluorescent Probes for Detecting Zn²⁺ in Living Cells

Li Changwei , Yang Dong , Yin Bing , Guo Yuan

College of Chemistry and Materials Science, Northwest University, Xi'an 710127

Received: November 10, 2015; published: December 8, 2015; published online: December 21, 2015

Project supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 21472148, 21072158), the Special Foundation of the Education Committee of Shaanxi Province (No. 12JK0580), and the Academic Back-bone of Northwest University Outstanding Youth Support Program

Abstract: Zinc ion (Zn²⁺) is one of the most important transition-metal ions in the human body which is involved in many important life activities and many diseases can be displayed by its situation. Thus, monitoring of Zn²⁺ is very meaningful to diagnosis of diseases. Compared to the traditional detection methods, fluorescence probe is safer and more practical. Because coumarin derivatives possess several advantages in optics, we choose them as key structures to prepare new fluorescent probes. Based on the mechaism of photoinduced electron transfer (PET), the water-soluble fluorescent probes 1 and 2that are coumarin-based derivatives were designed, which demonstrated sensitivity for Zn²⁺ and exhibited high selectivity to Zn²⁺ over other metal ions. The receptor unit serves as an electron donor in the absence of Zn²⁺, quenching the fluorophore excited state that makes the probe have no fluorescence. However, when Zn²⁺ binds to the receptor, photoinduced electron transfer is prevented and the quenching is blocked, resulting the fluorescence intensity significantly enhanced. There is a good correlation between fluorescence intensity and Zn²⁺ concentration. With the increase of Zn²⁺ concentration, fluorescence intensity becomes stronger. Furthermore, the two probes were successfully labelled on the MCF-7 cell and B. subtilis. The single crystals of the coumarin-based compounds 1~4 and zinc complex [Zn(2)] were also obtained. The X-ray crystal structure of the zinc complex [Zn(2)] reveals that the hydroxyl group and the 2, 2-dipicolylaminomethyl group participate in coordination. Zn²⁺ is five-coordinated with three nitrogen atoms from the pyridine rings, the substituted amino group and two oxygen atoms from the 7-site hydroxyl group, also coordinated with water molecule forming a pentacoordinated bipyramid geometry.

Key Words: coumarin Zn²⁺ fluorescent probe cell imaging

锌是人体内仅次于铁的第二大过渡金属元素, 也是人体必需的微量元素之一, 它积极地参与了多种生理过程并能促进人体生长发育和改善味觉^[1].由于Zn^2＋独特的化学性质^[2]以及它在基因表达^[3]、细胞凋亡^[4]、酶调控^[5]和神经传导^[6]中的重要作用, 使其能够作为重要的指标来反映和监测细胞内的新陈代谢情况^[7].在病理学上许多疾病, 如传染病^[8]、脑损伤性癫痫^[9]、抑郁^[10]、糖尿病^[11]、前列腺癌^[12]以及阿尔茨海默氏病^[13]等都与Zn^2＋的失衡有关.

目前检测Zn^2＋的方法主要有分光光度法、紫外光谱法、原子吸收光谱法等, 但这些传统的方法很难应用于生物体内Zn^2＋的检测.近年报道的荧光分析法具有选择性好、灵敏度高、生物适用性强等优点^[14], 因此开发Zn^2＋的荧光探针具有重要的意义.通常设计金属离子荧光探针的策略是在荧光团上连接一个螯合基团, 这个螯合基团与目标金属离子结合后将引起荧光强度的改变, 从而可以通过这种变化来检测金属离子^[15～17].又由于香豆素类衍生物具有Stokes位移大、荧光量子产率高、光稳定性好等优良的光学特性, 因此人们更青睐于把香豆素类衍生物设计成各种优良的荧光探针^[18～20].基于以上设计原理以及香豆素类衍生物的诸多优点, 本文设计、合成了一种络合型香豆素类水溶性Zn^2＋荧光探针1和2.荧光光谱实验表明, 该类探针具有较好的选择性和灵敏度, 其荧光强度随着Zn^2＋浓度的增大而逐渐增强, 并可成功实现对人乳腺癌细胞(MCF-7)和枯草杆菌(B. subtilis)的标记.

本文分别以7-羟基香豆素-3-甲酸乙酯(3)和3-氰基-7-羟基香豆素(4)为母体, 经Mannich反应合成了两个光诱导电子转移(PET)型Zn^2＋荧光探针8-(2, 2-二吡啶甲氨甲基)-7-羟基香豆素-3-甲酸乙酯(1)和8-(2, 2-二吡啶甲氨甲基)-3-氰基-7-羟基香豆素(2).该探针基于荧光团-桥连-螯合基团结构设计思想, 通过亚甲基把香豆素荧光团和二-(2-吡啶甲基)-胺[bis(2-picoly)amine, DPA]螯合基团连接在一起.螯合基团作为供电子体能猝灭分子的激发状态, 致使探针分子几乎不能发出荧光(PET效应); 当结合Zn^2＋以后, 光诱导电子转移被阻止, 猝灭效应受阻碍, 从而使探针分子表现出较强的荧光, 因此可以利用这个性质来识别Zn^2＋.化合物的合成路线如Scheme 1所示.

图式 1 1化合物1～4的合成路线 Scheme1 The synthetic route of compounds1～4

1 结果与讨论

1.1 探针1和2的荧光光谱学性质

本文对探针1和2进行了荧光光谱学研究, 结果表明:随着Zn^2＋浓度的增加, 两个探针的激发强度都发生了显著的增加, 并且其最大激发波长发生蓝移.探针1的最大激发波长(λ_em＝444 nm)从401 nm蓝移到394 nm(如图 1a所示), 探针2的最大激发波长(λ_em＝450 nm)从405 nm蓝移到400 nm(如图 1b所示).从荧光探针的发射光谱中可以看出, 探针1和探针2的最大发射波长皆不随Zn^2＋的浓度变化而移动. Zn^2＋在1.0×10^－7～1.0×10^－6 mol/L浓度范围以内, 随着Zn^2＋的浓度增大探针的荧光强度逐渐增强, 并且探针荧光强度的增加与Zn^2＋的浓度呈现出良好的线性关系(探针1荧光强度与Zn^2＋浓度的线性相关系数: R²＝0.9978;探针2荧光强度与Zn^2＋浓度的线性相关系数: R²＝0.9993)分别如图 1c和1d所示.根据这一良好的线性关系, 我们通过进一步做图计算得到了探针1和探针2对Zn^2＋的最低检出限, 探针1对Zn^2＋的检出限(S/N＝3)为94.23 nmol/L, 探针2对Zn^2＋的检出限(S/N＝3)为90.53 nmol/L.这表明探针1和探针2可以较灵敏地用来定量检测Zn^2＋的浓度.做图计算详见辅助材料.

图 1 在探针浓度为1 μmol/L, pH＝7.4的30 mmol/L HEPES的缓冲液中分别以0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9和1.0 equiv.的Zn^2＋来做探针1的激发光谱(a, λ_em＝444 nm)和探针2的激发光谱(b, λ_em＝450 nm)以及探针1的发射光谱(c, λ_ex＝397 nm)和探针2的发射光谱(d, λ_ex＝400 nm) Fig 1 Excitation spectra of 1 μmol/L 1(a, λ_em＝444 nm) and 1 μmol/L 2 (b, λ_em＝450 nm), and emission spectraof 1 μmol/L 1 (c, λ_ex＝397 nm) and 1 μmol/L 2 (d, λ_ex＝400 nm) in the presence of various concentrations of Zn^2＋ (0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 and 1.0 equiv. to the probe concentration) in 30 mmol/L HEPES buffer solution (pH 7.4). The inset shows the linear relationship between the emission intensity of probe and concentrations of Zn^2＋ (0.1～1.0 μmol/L). Arrows indicate the directions of the spectral changes as Zn^2＋ concentration increased

为了进一步研究PET效应对探针1和2的影响, 我们在pH＝7.4的条件下对比测定了化合物3和4的部分光谱数据(如表 1).

表 1 化合物1～4的光谱数据 Table 1 The spectral data of compounds 1～4

从表 1可以看出, 化合物1～4都有香豆素类衍生物的特征吸收(最大吸收范围集中在397～408 nm), 且探针与其对应前体都有相同的最大发射波长, 但是探针1和2的荧光量子产率较其前体化合物3和4低.由此说明, PET效应通过降低探针的荧光量子产率来影响其荧光特性, 因而可以通过Zn^2＋阻断PET效应来使探针分子的荧光得到恢复.量子产率计算见辅助材料.

鉴于络合型的荧光探针容易受到其它金属离子的干扰, 本文又用荧光光谱法对探针1和2做了选择性实验.在pH＝7.4 (以30 mmol/L HEPES作为缓冲液)的条件下, 分别以397和400 nm作为探针1和探针2的激发波长, 以444和450 nm作为其最大发射波长, 来检测探针对金属离子的选择性, 其中锌离子浓度为1 μmol/L, 其他金属离子浓度为10 μmol/L.实验结果表明, 当向探针中分别加入Na^＋, Mg^2＋, Al^3＋, K^＋, Ca^2＋, Cd^2＋, Ag^＋, Pb^2＋时体系几乎没有荧光强度的改变, 当分别向探针中加入Cr^3＋, Fe^3＋, Co^2＋, Ni^2＋, Cu^2＋, Hg^2＋时荧光强度减弱, 然而在相同的条件下只有Zn^2＋能够引起体系荧光强度的显著增加(如图 2).为了更直接地观察其荧光变化, 我们又做了探针及其与各种金属离子配位后的明场和荧光照片实验(照片见辅助材料).从照片上可以看出:在自然光下探针1和探针2的体系皆为浅棕色, 加入Zn^2＋后体系变为无色, 而同样条件下的其它金属离子则不能引起类似的变化; 在365 nm紫外光照射下, 探针1和探针2的体系仅表现出很弱的蓝色荧光, 但在加入Zn^2＋后探针体系的荧光强度显著增加, 而其它金属离子则不能达到同样的效果.这表明探针1和探针2可以应用于对Zn^2＋的可视化检测.

图 2 探针1(a)和2(b)对金属离子的选择性 Fig 2 Metal ion selectivity of 1 (a) and 2(b)

1.2 探针的检测机理及结构分析

将等物质的量的Zn(NO₃)₂与探针2混合, 得到了2与Zn^2＋的络合物[Zn(2)], 并培养获得了[Zn(2)]单晶, 数据表明, Zn^2＋是与三个氮原子和两个氧原子五配位的, 其中三个氮原子均为DPA中的氮, 两个氧原子分别为香豆素母体7-位上的氧和溶剂分子中的氧, 其几何构型为双锥型(如图 3).在没有结合Zn^2＋的情况下, 螯合基团作为供电子体能猝灭探针分子的激发态, 使其几乎没有荧光产生(PET效应); 而当螯合基团与Zn^2＋络合以后, 光诱导供电子转移被阻止, 猝灭效应受到阻碍, 从而使探针分子释放出较强的荧光(机理如图 4).另外我们继续通过室温下蒸发溶剂的方法获得了化合物1～4的单晶, 各个物质的单晶结构和数据见辅助材料.

图 3 [Zn(2)]的单晶结构图 Fig 3 Thecrystal structure of the zinc complex [Zn(2)]

图 4 Zn^2＋使荧光探针2荧光强度增强的机理 Fig 4 Fluorescence enhancement mechanism of 2 in response to Zn^2＋

为了从理论上说明结构对前线分子轨道能量、电子吸收和发射光谱等性质的影响, 我们在优化的基态S₀和激发态S₁几何结构基础上, 用含时密度泛函理论^[21]构建模型来研究化合物[Zn(2)]的电子结构和光谱性质.如图 5所示, 由于化合物[Zn(2)]有较高的振动强度(0.7097), 说明该结构有很强的吸收.当激发态的分子经分子几何构型松弛后再次返回基态时, 其振动强度更是高达0.9037, 所以理论上化合物[Zn(2)]应该有强的荧光发射, 这和实验观察到的加入Zn^2＋后荧光强度显著增强的结果一致.化合物[Zn(2)]的吸收光谱主要对应于分子轨道HOMO和LUMO间的跃迁, 由于前沿场效应同样地影响香豆素部分, 所以相应的偶极子积分应该很大, 对应的激发发射偶极化也非常大.经计算, 最大吸收波长和最大发射波长的理论斯托克位移为48 nm, 这与实验值45 nm非常接近.

图 5 络合物[Zn(2)]在水体系中的数据模型[包括理论波长(λ)、激发能量、振动强度(f)、分子前沿轨道(三维分布和轨道能量)和相应的吸收与发射CI系数] Fig 5 The data model of complex [Zn(2)] in water includes the the oretical wavelength (λ), excitation energy, oscillator strength (f), relevant frontier MOs (3D distribution and orbital energy) and corresponding CI coefficient of the absorption and emission

1.3 荧光探针在活体细胞中的成像研究

为了进一步确定探针分子在生物体内的应用潜质, 我们测试了探针1和探针2对MCF-7细胞的毒性.实验结果表明, 在探针浓度为25 μmol/L以下时细胞成活率都在80%以上, 探针分子可以实现在活细胞内的应用.

基于以上实验结果, 我们又进行了探针1和2在人乳腺癌细胞(MCF-7)中的成像研究(如图 6).实验结果表明, 探针1和探针2都能很好的标记MCF-7细胞, 当外部的Zn^2＋进入被探针标记的细胞以后其荧光强度都得到了显著地增强, 因此可用该探针荧光强度信号的变化来反映出细胞内Zn^2＋状况.这两个探针也成功地标记了枯草杆菌(B. subtilis), 其荧光图像见辅助材料.

图 6 探针1与探针2在MCF-7细胞中对Zn^2＋的成像分析 Fig 6 Confocal fluorescent imaging of Zn^2＋ in MCF-7 cell with 1 and 2 (a) Brightfield transmission images; (b) images of cells incubated with the probes (20 μmol/L); (c) images following a 10 min treatment with Zn^2＋ (100 μmol/L). Scale bar: 30 μm

2 结论

本文基于7-羟基香豆素-3-甲酸乙酯(3)和3-氰基-7-羟基香豆素(4), 合成出了两个PET型香豆素类水溶性Zn^2＋荧光探针8-(2, 2-二吡啶甲氨甲基)-7-羟基香豆素-3-甲酸乙酯(1)和8-(2, 2-二吡啶甲氨甲基)-3-氰基-7-羟基香豆素(2).该探针对Zn^2＋有很好的专一选择性和灵敏度, 更重要的是它成功地标记了MCF-7细胞和B. subtilis.以上研究为进一步的生物应用和疾病监测奠定了实验基础, 也为生物体内Zn^2＋的检测提供了一种有效的方法.

3 实验部分

3.1 试剂与仪器

2, 4-二羟基苯甲醛购于上海达瑞精细化学品有限公司(使用前进行了重结晶), 丙二酸二乙酯、丙二腈和二-(2-吡啶甲基)-胺(DPA)购于阿拉丁试剂有限公司.所有初级原料以及试剂均为市售分析纯或化学纯, 如无特殊说明则没有进一步提纯.使用二氯甲烷和甲醇以合适比例作为洗脱剂, 以硅胶为填料进行柱层析提纯(硅胶为200～300目, 购于青岛海洋化工).

熔点在X-4型熔点仪(北京泰克仪器有限公司)上测试.核磁共振氢谱在Varian核磁共振氢谱仪(INOVA-400 400 MHz)(美国)上测定(碳谱为100 MHz), 溶剂为DMSO-d₆, 四甲基硅为内标.质谱在Bruker micro TOF-Q II(德国)上测定.单晶结构在Bruker SMART APEXCCD X-Ray单晶衍射仪(德国)上测定.所有的荧光数据皆在Hitachi F-4500荧光光谱仪(日本)上测定, 其激发狭缝为5 nm、发射狭缝为5 nm, 石英比色皿规格为1 cm×1 cm.紫外可见吸收光谱用Shimadzu UV-1700紫外可见分光光度计(日本)测定.细胞成像实验所用仪器为Olympus FV1000共聚焦显微镜(美国).

3.2 7-羟基香豆素-3-甲酸乙酯(3)和3-氰基-7-羟基香豆素(4)的合成

向干燥的50 mL圆底烧瓶中加入1.38 g (10.0 mmol)2, 4-二羟基苯甲醛、1.6 mL (10.0 mmol)丙二酸二乙酯, 用10 mL无水乙醇使其溶解, 然后再向其滴加0.1 mL乙酸和0.1 mL哌啶; 回流搅拌4 h, 冷却后抽滤并用冷的乙醇洗涤2～3次, 抽干后得到黄色粗品.乙醇重结晶后, 得到1.11 g浅黄色棒状结晶3, 产率72.6%. m.p. 172～173 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)δ: 11.10 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 7.76 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 6.84 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 6.73 (s, 1H), 4.26 (q, J＝7.0 Hz, 2H), 1.29 (t, J＝7.0 Hz, 3H); IR (KBr) v: 3060, 2984, 1741, 1627, 1565, 1520, 1430, 1237 cm^－1; MS m/z: 234 (M^＋). Anal. calcd for C₁₂H₁₀O₅: C 61.54, H 4.30, found C 61.42, H 4.29.

向干燥的100 mL圆底烧瓶中加入1.38 g (10.0 mmol) 2, 4-二羟基苯甲醛、0.825 g (12.5 mmol)丙二腈和15.0 mL饱和碳酸氢钠溶液, 室温搅拌5 h后加入2.0 mL浓盐酸并在90 ℃条件下搅拌2 h, 冷却后抽滤得到黄色粗品, 纯化后得到1.49 g黄色固体4, 产率79%. m.p. 275～277 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 11.35 (s, 1H), 8.80 (s, 1H), 7.65 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 6.90 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 6.79 (s, 1H); IR (KBr) v: 3232, 3044, 2232, 1710, 1614, 1565, 1499, 1317, 1274, 879 cm^－1. Anal. calcd for C₁₀H₅O₃N: C 64.18, H 2.69, N 7.48; found C 64.22, H 2.70, N 7.45.

3.3 8-(2, 2-二吡啶甲氨甲基)-7-羟基香豆素-3-甲酸乙酯(1)和8-(2, 2-二吡啶甲氨甲基)-3-氰基-7-羟基香豆素(2)的合成

将2, 2-DPA (1.1 mmol, 0.22 g)和甲醛(1.1 mmol, 0.033 g)溶于5.0 mL乙腈中, 在65 ℃的条件下搅拌30 min; 另外把化合物3 (1.0 mmol, 0.234 g)溶于5.0 mL CH₃CN/H₂O (5:1)中得到溶液a, 接着把溶液a滴加到上述体系中在85 ℃条件下搅拌12 h.反应结束后除去溶剂, 柱层析提纯得到淡黄色粉末状固体1 (0.134 g, 产率30.1%). m.p. 154.1～155.0 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.65 (s, 1H), 8.51 (d, J＝4.4 Hz, 2H), 7.74～7.77 (m, 2H), 7.69 (d, J＝8.6 Hz, 1H), 7.44 (d, J＝7.8 Hz, 2H), 7.27～7.30 (m, 2H), 6.86 (d, J＝8.6 Hz, 1H), 4.25～4.30 (m, 2H), 3.96 (s, 2H), 3.88 (s, 4H), 1.31 (t, J＝7.1 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 164.424, 163.021, 157.881, 156.393, 155.235, 149.892, 148.492, 137.080, 131.019, 122.881, 122.475, 114.455, 111.410, 110.168, 109.944, 60.792, 58.631, 46.987, 14.215; IR (KBr) v: 3459.88, 3061.65, 2978.14, 2931.22, 1750.16, 1591.66, 1377.06, 1315.01, 1230.01, 822.90 cm^－1. HRMS calcd for C₂₅H₂₃N₃O₅[M＋H]^＋ 446.1728, found 446.1725.

其制备方法与探针1类似, 只是反应时间缩短为10 h, 提纯后得淡黄色粉末状固体2 (0.141 g, 产率35.4%). m.p. 187.0～187.3 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.84 (s, 1H), 8.60 (d, J＝4.4 Hz, 2H), 7.79～7.86 (m, 2H), 7.66 (d, J＝8.6 Hz, 1H), 7.51 (d, J＝7.8 Hz, 2H), 7.36～7.39 (m, 2H), 7.00 (d, J＝8.6 Hz, 1H), 4.06 (s, 2H), 3.98 (s, 4H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 157.843, 154.963, 153.311, 148.946, 148.496, 137.187, 136.982, 130.726, 122.900, 122.645, 122.507, 115.595, 115.427, 110.673, 109.757, 58.697, 46.895; IR (KBr) v: 3421.28, 3047.53, 2920.24, 2855.54, 2225.72, 1724.12, 1588.43, 1437.19, 1372.61, 1268.50, 819.64 cm^－1. HRMS calcd for C₂₃H₁₈N₄O₃ [M＋H]^＋ 399.1452, found 399.1455.

3.4 MCF-7细胞的培养及实验

细胞毒性实验:选用融合度90%以上的MCF-7细胞, 使用0.25%的胰蛋白酶酶解, 转移酶解后的细胞到96孔板中, 在5% CO₂、37 ℃环境中培养过夜.接着分别向96孔板中加入不同浓度的探针1和探针2, 同样的条件下再培养24 h.然后, 再向每一孔板滴加10 μL MTT, 并继续培养4 h.培养结束后使用0.01 mol/L PBS缓冲液冲洗细胞两次, 并向其中加入1 mL DMSO进行溶解.最后使用酶标仪在490 nm光照下测定其吸收, 处理数据, 分析实验结果.

细胞成像实验:将MCF-7细胞经0.25%的胰蛋白酶消化5 min后置于培养皿中, 加入含10%胎牛血清的DMEM培养基, 在5% CO₂、37 ℃的培养箱中过夜培养.随后, 将细胞接种到激光共聚焦皿中, 在5% CO₂、37 ℃条件下培养12 h, 待其贴壁后方可进行实验.另外分别配制2.0 mmol/L探针1和2的乙醇溶液, 并用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释至20 μmol/L.将贴壁后的细胞分别用所配探针溶液培养30 min, 接着用0.01 mol/L PBS缓冲液洗涤细胞三次, 再用Olympus FV1000共聚焦荧光成像显微镜进行观察和实验.接着将上述细胞分别用Zn^2＋ (100 μmol/L)培养10 min, PBS缓冲液洗涤后再次成像.

辅助材料(Supporting Information)所合成化合物的表征谱图以及荧光照片等数据.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

参考文献

[1]	Xu Z. C.; Yoon J.; Spring D. R. Chem. Soc. Rev. , 2010, 39 : 1996. DOI:10.1039/b916287a
[2]	Prasad, A. S., Biochemistry of Zinc, Plenum Press, New York, 1993.
[3]	Geiser J.; Venken K. J. T.; De Lisle R. C.; Andrews G. K. PLoS Genet. , 2012, 8 : e1002766. DOI:10.1371/journal.pgen.1002766
[4]	Thambiayya K.; Wasserloos K.; Kagan V. E.; Stoyanovsky D.; Pitt B. R. Am. J. Physiol. , 2012, 302 : 1351.
[5]	Maret W.; Jacob C.; Vallee B. L.; Fischer E. H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 1999, 96 : 1936. DOI:10.1073/pnas.96.5.1936
[6]	(a)Nikseresht, S.; Etebary, S.; Karimian, M.; Nabavizadeh, F.; Zarrindast, M. R.; Sadeghipour, H. R. Arch. Iran. Med. 2012, 15, 306. (b) Morris, D. R.; Levenson, C. W. J. Toxicol. 2012, 785647.
[7]	Fraustoda Silva, J. J. R.; Williams, R. J. P. The Biological Chemistry of the Elements, Oxford University Press, Oxford, 1991, p. 561.
[8]	Fischer Walker C. L.; Lamberti L.; Roth D.; Black R. E. Biomed. Health Res. , 2011, 76 : 234.
[9]	Grabrucker A. M.; Rowan M.; Garner C. C. Drug Delivery Lett. , 2011, 1 : 13.
[10]	Gower-Winter S. D.; Levenson C. W. BioFactors , 2012, 38 : 186. DOI:10.1002/biof.1012
[11]	Bicer M.; Gunay M.; Baltaci A. K.; Uney K.; Mogulkoc R.; Akil M. Br. Med. J. , 2012, 113 : 199.
[12]	Chen X.; Yu H. N.; Shen S. R.; Yin J. J. J. Trace Elem. Med. Biol. , 2007, 21 : 125. DOI:10.1016/j.jtemb.2006.12.007
[13]	(a) Srichaikul, B. Adv. Nat. Sci. 2012, 5, 1. (b) Lee, J. Y.; Cho, E.; Seo, J. W.; Hwang, J. J.; Koh, J. Y. J. Neuropath. Exp. Neur. 2012, 71, 211.
[14]	(a) Jayabharathi, J.; Thanikachalam, V.; Jayamoorthy, K. Spectrochim. Acta, Part A 2012, 95, 143. (b) Liu, Z. P.; Zhang, C. L.; Chen, Y. C.; He, W. J.; Guo, Z. J. Chem. Commun. 2012, 48, 8365. (c) Mandal, A. K.; He, T. C.; Maji, S. K.; Sun, H. D.; Zhao, Y. L. Chem. Commun. 2014, 50, 14378. (d) Tang, L. J.; Zheng, Z. X.; Bian, Y. J. Chem. Online 2015, 78, 388 (in Chinese). (汤立军, 郑竹轩, 边延江, 化学通报, 2015, 78, 388.)
[15]	(a) Tsien, R. W.; Tsien, R. Y. Rev. Cell Biol. 1990, 6, 715. (b) Jitendra, B.; Umesh, F.; Banashree, B.; Simanpreet, K.; Narin-der, S.; Anupam, B.; Rajesh, D.; Ratnamala, B.; Anil, K. J. Mol. Recognit. 2015, 28, 369. (c) Liu, M.; Tan, H. L.; Liu, Z. G.; Wang, W.; Zeng, W. B. Chin. J. Org. Chem. 2013, 33, 1655 (in Chinese). (刘敏, 谭慧龙, 刘治国, 王维, 曾文彬, 有机化学, 2013, 33, 1655.)
[16]	(a) Priya, C.; Sivaramapanicker, S.; Ayyappanpillai, A. Chem. Asian J. 2007, 2, 338. (b) Nolan, E. M.; Lippard, S. J. Acc. Chem. Res. 2009, 42, 193. (c) Wong, B. A.; Friedle, S.; Lippard, S. J. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 7142. (d) Walkup, G. K.; Burdette, S. C.; Lippard, S. J.; Tsien, R. Y. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 5644. (e) Mizukami, S.; Okada, S.; Kimura, S.; Kikuchi, K. Inorg. Chem. 2009, 48, 7630. (f) Song, Z. K.; Dong, B.; Lei, G. J.; Peng, M. J.; Guo, Y. Tetrahedron Lett. 2013, 54, 4945.
[17]	(a) Domaille, D. W.; Zeng, L.; Chang, C. J. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 1194. (b) Yang, Z.; She, M. Y.; Yin, B.; Hao, L. K.; Obst, M.; Liu, P.; Li, J. L. Anal. Chim. Acta 2015, 868, 53. (c) Fan, J. L.; Xu, Q. L.; Zhu, H.; Peng, X. J. Chin. J. Org. Chem. 2014, 34, 1623 (in Chinese). (樊江莉, 徐群利, 朱浩, 彭孝军, 有机化学, 2014, 34, 1623.)
[18]	(a) Yuan, L.; Lin, W. Y.; Yang, Y. T.; Song, J. Z.; Wang, J. L. Org. Lett. 2011, 13, 3730. (b) Jung, H. S.; Han, J. H.; Kim, Z. H.; Kang, C. H.; Kim, J. S. Org. Lett. 2011, 13, 5056. (c) Perry, C. C.; Tang, V. J.; Konigsfeld, K. M.; Aguilera, J. A.; Milligan, J. R. J. Phys. Chem. B 2011, 115, 9889. (d) Huo, F. J.; Sun, Y. Q.; Su, J.; Chao, J. B.; Zhi, H. J.; Yin, C. X. Org. Lett. 2009, 11, 4918. (e) Peng, M. J.; Yang, X. F; Yin, B; Guo, Y.; Suzenet, F.; En, D.; Li, J.; Li, C. W.; Duan, Y. W. Chem. Asian J. 2014, 9, 1817.
[19]	(a) Ciesienski, K. L.; Hyman, L. M.; Derisavifard, S.; Franz, K. J. Inorg. Chem. 2010, 49, 6808. (b) Park, J. E.; Choi, M. G.; Chang, S. K. Inorg. Chem. 2012, 51, 2880. (c) Ezeh, V. C.; Harrop, T. C. Inorg. Chem. 2012, 51, 1213. (d) En, D.; Guo, Y.; Chen, B. T.; Dong, B.; Peng, M. J. RSC Adv. 2014, 4, 248. (e) Hong, T.; Song, H. L.; Li, X.; Zhang, W. B.; Xie, Y. S. RSC Adv. 2014, 4, 6133.
[20]	(a) Wu, J. S.; Sheng, R. L.; Liu, W. M.; Wang, P. F.; Ma, J. J.; Zhang, H. Y.; Zhuang, X. Q. Inorg. Chem. 2011, 50, 6543. (b) Yuan, L.; Lin, W. Y.; Xie, Y. N.; Chen, B.; Zhu, S. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 1305. (c) Zhou, Y.; Liu, K.; Li, J. Y.; Fang, Y.; Zhao, T. C.; Yao, C. Org. Lett. 2011, 13, 1290. (d) Choi, M. G.; Hwang, J. Y.; Moon, J. O.; Sung, J. Y.; Chang, S. K. Org. Lett. 2011, 13, 5260. (e) Reddie, K. G.; Humphries, W. H.; Bain, C. P.; Payne, C. K.; Kemp, M. L.; Murthy, N. Org. Lett. 2012, 14, 680.
[21]	(a) Runge, E.; Gross, E. K. U. Phys. Rev. Lett. 1984, 52, 997. (b) Dreuw, A.; Head-Gordon, M. Chem. Rev. 2005, 105, 4009. (c) Becke, A. D. J. Chem. Phys. 1993, 98, 5648. (d) Lee, C.; Yang, W.; Parr, R. G. Phys. Rev. B 1988, 37, 785.