天然骨具有非常精妙的从微观到宏观的复杂多级结构(图 1)，从而使之兼具高强度和高韧性的优异性能，其主要原因在于天然骨形成过程中的生物矿化过程[1]。生物矿化是指由生物体通过生物大分子的调控而生成生物矿物的过程，其本质为由有机分子模板介导无机成分的矿化沉积[2]。与无机成矿相比，生物矿物具有以下3个显著的优点：(1)矿化结构高度有序：其强度和韧性明显提高；(2)生物矿化一般具有择优的晶体生长取向；(3)有机质与矿物质具有明显相互作用；矿物质是基于整个生物代谢过程中形成，并参与代谢[3-5]。因此，基于生物矿化的明显优势以及在结构和成分上双重仿生的目标，对有机模板介导合成类骨磷灰石材料的研究一直是生物材料领域的一大热点。
在生物矿化过程中，作为模板的有机大分子为磷酸钙晶体提供成核位点，并且调控晶体的生长取向、晶体大小以及晶体形态等，因此有机模板的运用对晶体生长有着至关重要的影响[6]。目前模板介导合成纳米钙磷自组装模型可以分为单模板自组装、双模板自组装以及多模板自组装。单模板自组装是指在分子自组装过程中，以某一种模板分子来诱导纳米晶体成核生长；双模板自组装是由两种结构和功能上相互匹配的模板分子在反应体系中共轭自组装，并在空间、结构以及化学上调控纳米晶体的生长；而多模板自组装则是由3种及以上的模板分子共同诱导形成纳米磷酸钙晶体的生长[7]。本文将结合本课题组目前的相关工作以及国内外研究动态，对双模板介导类骨磷灰石材料的研究进展进行总结。
天然骨主要是由无机成分和有机成分构成，其中无机成份主要是低结晶的羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)，而有机成分则主要由蛋白质和多糖类物质构成，其中蛋白质的主要成分是I型胶原，占总蛋白的85%~90%[8]。因此I型胶原被认为是天然骨组装过程中的主要蛋白模板，目前已被作为模板广泛应用于生物矿化的研究中[9-12]。但是与此同时，天然骨中除I型胶原蛋白以外的其它有机物也在矿化过程中起到了重要的调控作用[13]。因此以这些蛋白和多糖类物质为模板，通过逐层自组装最终形成性能优异的天然生物材料，为生物材料的仿生制备提供了灵感。目前已有大量使用蛋白模板和多糖模板等介导合成纳米磷酸钙的研究，其中蛋白模板包括胶原蛋白[14]、丝素蛋白[15]、纤连蛋白[16]、牙釉蛋白[17]和血清蛋白[18]等；多糖类模板包括透明质酸[19]、硫酸软骨素[20-21]、壳聚糖[22-24]、海藻酸钠[25]和细菌纤维素[26]等。除此之外还有一些合成类分子被应用为模板，包括合成两亲肽(PAN)[27-28]、聚乙二醇辛基苯基(Triton X-100)[29]、聚丙烯酸(PAA)[30-31]、乙二胺四乙酸(EDTA)[32]、生物活性玻璃纤维[33]等。
研究表明，生物体器官能够控制晶体成核的位点、晶体学取向、生长中的晶体形状以及最终生成的物相，而这些功能的实现都依赖于矿化过程中存在的有机成分及其在矿物生长阶段起到的调节作用。具体而言，由于模板链上存在促进或者抑制晶体成核的位点，从而对钙磷材料矿化沉积的过程起到了各不相同的调控作用，如图 2所示。例如，模板分子链上的酰胺基团、侧链上的氨基以及羧基使其具有较强的吸引结合钙离子的能力，从而使得磷酸根聚集与之结合生成磷酸钙晶体[11]。酸性基团对钙离子的吸引力导致反应体系中钙离子在其周围的聚集，进而磷酸根离子又被聚集的钙离子吸引。除了羧基之外，胶原蛋白链上的羰基也被提出是一个重要的成核位点[34]。Wang等发现，在丝素蛋白上除了羰基和羟基，羧基和氨基也是成核位点。这些成核位点在模板链段上的分布对晶体的生长也有极大的影响[35]。为了排除这些基团之间的相互影响，Liu等将载有羧基、氨基和甲基等功能基团的金基底浸泡于模拟体液(SBF)中以分别检测它们的促晶体生长能力，结果显示，在羧基表面的HA层是氨基表面HA层的3倍厚度，而甲基表面则几乎没有发现HA晶体生长[36]。与之相反，有些分子模板则由于其侧链上大量的羧基与磷灰石晶体强烈结合，从而抑制磷酸钙晶体生长。例如聚天冬氨酸，聚丙烯酸，聚丙烯酸铵，柠檬酸等，这些模板均被证实能有效抑制HA晶体成核，如图 2(c)所示。
因此双模板自组装系统存在3种不同的情况：2个促进类模板、1个促进1个抑制类模板以及2个抑制类模板。2种模板的选择性结合将直接影响终产物的形貌、粒径等。本课题组的Wang等利用胶原和丝素蛋白这两种对晶体生长有促进作用的分子模板协同共组装制备出仿生骨修复材料，同时以胶原和丝素蛋白为单模板诱导矿化作为对照组。由粒径分析图谱和高分辨透射电镜结果显示，普通的单模板法制备的羟基磷灰石晶体粒径均在100 nm以上，而双模板法制备的晶体粒径小于100 nm，且晶体结晶度更高，如图 3(a)和(b)所示[37]。细胞与材料共培养实验证明，双模板材料具有更好的促骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力。由免疫荧光染色和RT-PCR分析结果可见，在骨髓间充质干细胞分化第21天时，双模板组在相关蛋白以及基因的表达量上明显高于对照组，如图 3(c)和(d)所示[38]。
此后，Wang等将促进类的纤维状丝素蛋白模板与抑制类的球形牛血清白蛋白相结合作为嵌合体复合双模板，同时以丝素蛋白作为单模板对照组分别矿化自组装。结果显示双模板组制备出结晶程度较低的球形HA晶体，且沿着蛋白模板C轴方向串成链珠状，图 4(b)；而丝素蛋白单模板诱导合成的HA则成棒状，沿蛋白模板C轴方向定向生长，如图 4(a)所示[39]。Ba等发现当纤连蛋白(Fibronectin, Fn)和弹性蛋白(Elastin)分别作为单模板时，无法诱导HA生成，但是当把FN和elastin协同共组装作为双模板则成功诱导HA晶体成核[40]。因此在双模板的分子设计中，须充分考虑模板分子间的匹配和共轭，以便制备出性能优异的骨修复替代材料。
生物矿化是一个非常复杂且精细的多级调控晶体生长过程，是一门仍在发展中的学科，由于它的研究对象一般是非平衡态过程，所以理论发展比较缓慢。众所周知，在分子自组装过程中，当以单一模板来诱导HAP成核生长时，由于模板成分单一、结构简单、便于控制，能够较为简便地使有机模板自组装成超分子结构的预组装体，进而利用此超分子结构来调控生物矿化过程。然而当使用2个以上的模板来诱导和调控微晶沉积和生长时，由于复合模板可能存在多个活性中心，这些活性中心的匹配情况对晶体生长将产生影响。因此在多模板的分子设计过程中，要充分考虑模板间的分子匹配和共轭，包括分子链的长短、二级结构的互补、空间立体化学以及偶极-偶极相互作用和电荷匹配等。在模板设计时充分考虑上述因素将有利于我们通过复合模板组装策略获得性能优异、结构层次合理、更接近自然骨结构的仿生骨矿化材料。
目前，在有机模板分子匹配设计上有2种方式：一是非共价键组装，即采用梯度浓度法，在一种模板溶液中加入另一种模板溶液的稀溶液，然后浓度逐渐增加，先让2种模板协同组装，在弱相互作用下(氢键、疏水作用力等)形成稳定的多聚体结构，直至双模板获得最佳的组装结构，然后在协同组装好的模板上原位沉积HAP，这样可以避免多活性中心可能带来的影响[41]。二是共价组装，采用缩肽剂或者交联剂将2种模板先共组装形成纳米纤维网状结构，然后通过这种组装后形成的活性中心来调控HAP晶体的成核位点和晶体生长。
与单模板自组装相比，双模板调控晶体生长的一个重要特点是模板的空间结构发生了变化。众所周知，蛋白质模板是由各种带有成核位点的氨基酸通过肽键连接而成的多肽链，再由一条或者多条多肽链按各自特殊的方式折叠盘绕，组合成具有完整生物活性的大分子。每一种蛋白质模板在生理条件下，都呈现出称为天然构象的单一稳定形状。而蛋白质的天然三维构象是依靠非共价相互作用(静电力、氢键、疏水力)、共价相互作用(二硫键)及单个氨基酸间的肽键来维持的。因此双模板的存在势必会对双方的稳定性存在影响，从而改变蛋白模板的空间构象。蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关，蛋白质的空间构象是其功能活性的基础，构象发成变化，其功能活性也随之改变。而蛋白模板的空间构型会对晶体的成核和生长带来直接影响[42]。Wang等采用非共价结合的方法将分子结构相似的丝素蛋白和胶原蛋白模板协同共组装成复合双模板，利用圆二色谱对模板蛋白结构进行表征，如图 5所示。结果证明，胶原蛋白和丝素蛋白作为两种纤维状分子具有很好的协同效应，与单分子模板相比，复合模板形成了更加稳定的二级结构[37]。
除了复合分子模板的结构变化之外，体系的电荷、成核位点等均会受到相应改变。Phadke等采用各种不同长度的末端为羧基的侧链修饰疏水的聚乙二醇水凝胶，成功改变基底的亲水性并为基底提供了成核位点，从而合成了仿生骨替代材料[43]。如图 6所示，侧链越长(n值越大)，改性后的基底亲水性就越强，在模拟体液中矿化产生的类骨磷灰石层就越致密。细菌纤维素是一种常用的矿化模版，并已取得很多优秀的研究成果[44-45]。为了进一步在分子结构上向天然胶原靠拢，Gao等采用原花青素为交联剂，将聚赖氨酸与细菌纤维素纤维交联获得分子模版，并将该模板置于1.5倍的模拟体液(SBF)中矿化，最终获得了与天然骨微观结构非常相似的仿生骨替代材料[46]。
生物矿化的实质是在生物体内进行的晶体生长过程，其中包含了各种层次的多级调控因素。生物矿化除传统的结晶学所研究的晶体生长因素之外，还带来了更多并且更加复杂的化学以及生物过程，比如结构互补、空间匹配和静电协同等，其中的详细机制尚未研究透彻。在生物体系中，蛋白质、细胞甚至基因共同参与实现晶体生长成核的调控作用[6]。而在实验研究体系中，有机分子模板、各种阴/阳离子、电荷、pH值，温度等与晶体的生长都有着不可分割的密切关系。其中有机分子模板往往是调控晶体成核过程中最关键的调控因素。在晶体生长过程中，模板对晶体结构、形貌、粒径大小以及生长速度等有着非常重要的影响。
由第二部分叙述可知，模板的相互作用可引起蛋白质二级结构的改变，同时蛋白质二级结构的变化最终对晶体成核有着重要的影响。研究显示在大部分情况下，在蛋白质或者多肽分子模板的官能团、空间结构等的调控作用下，通过模板自组装制备的羟基磷灰石晶体的c轴与模板主链的长轴相平行，即HA晶体沿着模板的长轴方向生长[11, 37-38, 47]。蛋白质的结构和功能之间的关系非常密切，蛋白质的二级结构中多肽链主链中各原子在各局部的空间排布对其功能结构域产生重要影响。本课题组的Wang等研究显示，胶原/丝素双模板由于二级结构的改变，介导生成了比胶原和丝素蛋白单模板组晶体粒径更小、结晶度更高的类骨磷灰石晶体[37]。并提出了一个双模板介导合成类骨磷灰石生长机制：(1)两种结构相似，性能互补，介导功能相同的纤维状模板分子通过构型匹配和表面最低自由能形成一个协同共组装的组合模板(co-assembly template)。(2)钙离子首先与模板蛋白的酰胺键发生相互作用，启动初始成核(initial nucleation)。(3)磷酸根离子再与模板蛋白结合的钙离子形成磷酸钙的种晶(seed crystal)。(4)磷酸钙的种晶在模板结构的介导下，进一步定向生长，最终形成引着模板C轴方向的纳米针状羟基磷灰石，如图 7所示。Xu等利用噬菌体M13的展示功能，将牙本质蛋白展示在噬菌体M13表面，形成具有β-折叠结构的复合模板(如图 8所示)，实验发现具有β-折叠结构的复合模板能够促进晶体成核并且调控HA晶体沿模板长轴方向定向生长，为制备有序的定向生长的HA晶体提供了有效的方法[48]。
除了有机模板分子对矿化过程有着重要的调控作用之外，反应体系中存在的各种离子、电荷、pH值，温度等，都对自组装过程有一定的调控作用[49-50]。在生物矿化的过程中，环境中的杂质离子很容易进入羟基磷灰石晶体的晶格中，从而形成各种元素掺杂的晶体。在合成材料的过程中，为了给材料赋予各种功能化的属性，相关研究者往往会在反应体系中加入各种特殊的离子。例如硒、硅、氟、镁等元素掺杂的羟基磷灰石材料的成功合成，赋予了纯羟基磷灰石材料各种特殊的功能[51-53]。因此在使用模板介导合成纳米羟基磷灰石材料时，研究人员将各种元素引入到反应体系中，合成不同的功能化的材料。而在这个反应过程中，外来离子的引入则很可能对纳米晶体的成核生长及其性能存在影响。
锌元素在材料中具有显著的抗菌性能，因此广泛应用在生物材料领域[55]。Ma等在丝素蛋白/海藻酸钠双模板矿化系统中引入了锌离子，成功制备出厚度约3 nm，粒径大于100 nm的片层状锌掺杂的纳米羟基磷灰石晶体(图 9)。该研究指出，反应体系中的丝素蛋白和海藻酸钠分子链上的亲水基团间产生强氢键作用，并且体系中的钙、锌离子对海藻酸钠也有交联作用，从而促使了体系中的纳米晶体出现了上述的特殊结构[54]。而镁元素和锶元素掺杂的羟基磷灰石则显示出明显的促细胞增殖效果[56]。Wu等提出Cr3+将引起胶原蛋白的交联从而获得胶原蛋白的三股螺旋结构[57]。Zhang等在多孔钛合金表面制备出硅元素掺杂的羟基磷灰石涂层，并通过材料的动物缺损修复实验结果证明，硅元素显著提高了该多孔钛合金材料的骨修复能力[58]。碳酸根也是一个非常常见的掺杂在羟基磷灰石晶体中的基团，在特定的条件下，它可以取代羟基磷灰石中氢氧根或者磷酸根而存在于晶体晶格中。在天然骨组织中，碳酸根掺杂的羟基磷灰石约占总羟基磷灰石的7%，并且在模板介导合成羟基磷灰石晶体时，空气中的二氧化碳也无法避免的会以碳酸根的形式进入材料中生成碳酸化的羟基磷灰石[59-61]。
生物大分子往往携带着随环境pH值的变化而变化的电荷，Junginger等研究了在不同pH值条件下，两亲性的高分子嵌段共聚物单层模板分子介导下生长的磷酸钙晶体的差异，发现由于pH值的改变引起的电荷值变化导致了产物的转化现象[62]。Lobbicke等采用原位聚合法制备聚合物分子刷涂层，在不同pH值下涂层表面生长出均匀的磷酸钙晶体涂层，并优选出促成骨前体细胞分化的材料[63]。Wei等以原子力显微镜为手段，对云母基地表面吸附的模式模板分子涂层在模拟体液(SBF)中的矿化过程进行了分析，提出离子浓度、pH值、离子强度等参数对矿化产物有着不同的影响[64]。
在25~60 ℃条件下，聚环氧乙烷-亚磷酰胺水凝胶内部羟基磷灰石纳米粒子的矿化过程，结果显示在较高的温度下生成的纳米粒子具有更好的结晶性[65]。但是过高的矿化温度将引起晶体的形貌变化或者是模板的变性，因此模板介导的生物矿化过程一般都应将温度控制在室温或者生理温度下进行[66]。除了上述因素之外，还有其它的一些条件也会调控晶体的生长，例如模板的分子量、离子浓度、反应时间等[67-68]。
因此模板介导的晶体生长是一个受各种因素调节的复杂反应过程，为生物矿化领域的研究者制备出具有形态、结构、性能各异的仿生结构生物材料提供了思路，也为相关研究者带来了更为广阔的探索空间。
随着双模板诱导合成材料研究的不断深入，人们在对模板诱导合成的机理持续探索的同时，双模板诱导合成的类骨磷灰石的应用也取得了快速的发展，其应用范围主要涵盖了骨修复、齿科修复等硬组织修复领域。另外，鉴于材料的独特性质，双模板诱导合成材料在表面涂层、基因及药物载体领域也具有较大的应用潜力。
通过双模板介导自组装生成的类骨磷灰石具有与天然骨相似的多级结构以及更好的骨传导性，甚至更好的骨诱导效果，因此在骨缺损的修复领域具有广阔的应用前景[38, 69]。Anderson等将RGD序列接枝到两亲肽纳米纤维上生成复合模板，并以此复合模板诱导生成了具有更好的骨诱导性的复合材料[70]。合成类聚合物高分子通常具有优异的机械性能以及可塑性，在生物材料领域特别是骨修复领域具有非常广泛的应用，常与羟基磷灰石材料以机械混合等方法制备成具有高强度的骨组织工程支架材料[71-72]。由于合成类高分子缺乏生物活性限制了它们在生物矿化领域的发展，但是通过对合成高分子材料进行适当的修饰或者与其他模板混合后后生成复合模板可明显提高其生物活性，并作为模版介导合成类骨羟基磷灰石，从而将高分子材料与生物矿物的优良属性完美的结合起来应用于骨缺损修复领域[73]。将模板诱导合成的类骨磷灰石与合成高分子材料复合，制备骨缺损修复支架或填充材料，可在保持材料的骨传导性和骨诱导性的同时，提高支架的力学强度，用于承重部位骨缺损的修复[74-75]。
在牙体组织修复方面，目前仍广泛采用金属、复合树脂及陶瓷等结构和性质与牙体组织相差较远的材料，容易引发各类界面问题[76]。牙釉质发生过程中，釉原蛋白作为主要有机质，通过亲水端残基参与磷灰石的成核取向，通过疏水端调控晶体的形态、大小，与牙釉质中的其他蛋白一起形成了釉质磷灰石的结构。模板诱导合成的钙磷材料具有与牙体组织相似的结构，能够在一定程度上诱导牙体组织损伤的自愈性修复，从而在口腔医学中得到了广泛的应用与发展，如牙本体仿生合成、原位仿生再矿化牙体组织、体外仿生构建牙体组织等[77]。Chen等在钛片表面构建载生长因子的复合多功能类骨磷灰石涂层，显著提高了钛金属的细胞相容性以及促细胞成骨分化能力，是一种潜力极大的制备骨修复材料和齿科材料的方法[78]。
通过构建功能性元素掺杂的双模板诱导合成的钙磷材料，赋予材料更优异的性能，可进一步提高双模板合成材料的应用潜力。例如，硅元素是动物体内天然拥有的一种微量元素，存在于众多组织器官中。并且硅元素已经被证实是新骨生长和软骨发育必需的一种微量元素，而在骨缺损的修复研究方面，含硅生物材料表现出明显优于传统钙磷材料的诸多优势[79]。因此，将Si元素引入骨修复材料中将能够赋予这类传统生物医用材料更优异的生物学特性，在骨缺损修复中将更好地发挥硅元素的功能性[80]。本课题组在Si元素掺杂双模板合成材料研究方面已取得较大进展，对于提高双模板诱导材料在骨修复领域的应用潜力具有重要意义。羟基磷灰石纳米离子与蛋白和基因材料具有很强的相互作用，是一个非常有效的药物和基因的载体[81]。Nardecchia等以共沉积法将抗生素与钙磷材料共固定在壳聚糖基支架材料表面，并发现钙磷材料的存在对药物的释放有明显的调控作用[82]。
模板介导的仿生自组装是一种非常有效的制备具有多级结构且形貌可控的类骨磷灰石的方法。基于上述讨论可知，双模板介导生成的类骨磷灰石具有与天然骨更相似的多级结构，甚至更强的促细胞成骨分化和促新骨生成能力。成功制备双模板介导合成的仿生材料的关键是利用模板间的结构匹配与功能互补。对于模板之间相互作用的方式，以及调节生物矿物生长的作用原理仍然有待深入研究。但可以肯定的是，在仿生修复材料领域，双模板协同共组装策略具有十分广阔的研究前景和应用潜力。
2016, Vol. 32 Issue (11): 1885-1895
PDF
2016, Vol. 32 Issue (11): 1885-1895 PDF