1 东南大学化学化工学院 南京 211189;
2 中国药科大学理学院 南京 211198;
3 安徽省食品药品检验研究院 合肥 230051
2016-04-08 收稿, 2016-07-30 接受
作者简介:
徐之冀, 男, 执业药师, 30岁, 主要从事光谱色谱分析及药物分析
Research on Fluorescence Resonance Energy Transfer between CdS Quantum Dots and Eosin Y
1 School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, Nanjing 211189;
2 School of Science, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198;
3 Anhui Institute for Food and Drug Control, Hefei 230051
荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)是一种非辐射的能量跃迁方式[1~3]，通过分子间的电偶极相互作用，将供体(Donor，D)激发态能量转移到受体(Acceptor，A)激发态的过程。这个过程表现为供体荧光强度降低而受体荧光强度增强或猝灭[4]。与原有的分子荧光分析相比，FRET光谱法给出了更为丰富的光谱信息，这使得FRET的应用十分广泛。例如，Mergny[5]用FRET来研究DNA的高级结构，推测FRET可用于揭示多链DNA的结构的形成。
量子点(Quantum dots，QDs)是一种主要由ⅡB-ⅥA族或ⅢA-ⅤA族元素组成的直径在1~100 nm之间的无机半导体纳米荧光颗粒。由于量子点具有传统荧光物质无法比拟的光学特性[6~12]，其在多个领域都具有广泛的应用前景，近年来一直是纳米科技研究的热点。例如，高雪等[13]利用CdTe QDs和乙二胺四乙酸构建的纳米探针，建立了一种能快速灵敏检测Cd2+的新方法。
近年来，以QDs为代表的新型荧光材料不断被应用于FRET体系的构建，使得FRET在化学、医药、生物等领域的研究越来越受到重视，应用范围不断扩展，相关技术不断发展，显示出广阔的前景。例如，以QDs为基础，建立基于FRET的高灵敏、高选择性分析方法已成为研究热点，在药物分析、环境污染物检测、生物传感器等方面的研究中得到了广泛的应用，并已成为FRET领域发展的一个新方向[14~16]。
CdS QDs的制备方法[17]简便高效，光学性质稳定，是研究中最为典型和常用的一种QD。曙红Y (图式1)是一种水溶性有机荧光染料，可用作生物染色剂、吸附指示剂、显色剂，在生物分析、化学分析等研究工作中有广泛用途。选择CdS QDs和曙红Y作为FRET研究对象具有典型示范意义，可作为后续改进及应用研究的基础。
本文研究了CdS QDs与曙红Y间的FRET，建立了一个基于新型无机荧光材料和有机荧光物质的FRET体系。此体系构建过程快速简便，且采用较为稳定的构成组分，荧光变化响应灵敏，可进一步探索其在药物、污染物分析方面的应用。
RF-5301PC型荧光分光光度计、UV 2100紫外分光光度计(日本岛津公司)；UPHW-Ⅰ-90T型超纯水器(成都超纯科技公司)；5418型离心机(德国Eppendorf公司)。
CdS QDs母液(2.1×10-5mol/L)按文献[17]的方法制备，曙红Y、乙醇、异丙醇等均为市售分析纯级试剂。实验用水为超纯水。
取1.0mL CdS QDs母液，加入0.7mL异丙醇，振摇3min混合均匀，12000r/min离心10min，取上清液，加入等体积异丙醇，使之完全沉淀，沉淀干燥后加2.0mL超纯水溶解，得到上清液提取溶液，因该溶液最大发射波长为470nm，称为CdS (470) QDs溶液，待用。按文献[18]方法测定CdS (470) QDs溶液工作浓度为4.5×10-7mol/L，荧光量子产率为12.3%。
先配制浓度为0.01mg/mL (1.4×10-5mol/L)的曙红Y储备液，取50μL储备液，用超纯水稀释至2.0mL，作为曙红Y对照溶液；取200μL CdS (470) QDs溶液，用超纯水稀释至2.0mL，作为QDs对照溶液；取200μL CdS (470) QDs溶液，加入50μL曙红Y储备液，用超纯水稀释至2.0mL，同时调节pH为5.0，作为待测溶液。其中，曙红Y与CdS (470) QDs的浓度比为7.8。以365nm为激发波长，狭缝宽度5nm，测定以上3种溶液的荧光发射光谱，研究FRET体系的构建。
图 1为CdS QDs与曙红Y的荧光激发与发射光谱。其中曙红Y的最大激发波长为518nm，最大发射波长为539nm。CdS (470) QDs溶液发射光谱与曙红Y的激发光谱有较大程度的重叠，且对曙红Y的发射光谱影响较小。即CdS (470) QDs作为能量供体与曙红Y构建的FRET体系可以用荧光发射光谱进行表征。
分别取曙红Y储备液、CdS (470) QDs溶液适量，按实验方法1.2.2构建FRET体系，其中，使曙红Y与CdS (470) QDs的浓度比为6.4，其荧光发射图谱如图 2所示。检测参数为激发波长365nm、狭缝宽度5nm时，CdS (470) QDs对照溶液有比较强的荧光发射，在曙红Y的特征发射峰位处无荧光发射峰；曙红Y对照溶液在CdS (470) QDs发射峰位处无荧光发射峰，在曙红Y的特征发射峰位处有较弱的荧光峰。而同时含有CdS (470) QDs和曙红Y的待测溶液的荧光发射光谱则显示，CdS (470) QDs的荧光发射峰强度明显下降，而曙红Y的荧光发射峰强度明显上升。说明在此体系中，CdS (470) QDs与曙红Y分子之间的距离已经足够近，可以发生共振能量转移，即溶液中可能存在以CdS (470) QDs为能量供体、曙红Y为能量受体的FRET体系。
体系pH变化时，QDs表面的羧基电离程度随之发生变化，对QDs的团聚产生影响[19]，从而对以巯基化合物为稳定剂的QDs的荧光性质有巨大影响，而在本体系中使用的QDs正是以巯基乙酸为稳定剂的CdS QDs。因此，CdS (470) QDs的荧光性质会随着pH的变化而变化。在FRET体系中，CdS (470) QDs是能量供体，pH改变会对供体产生影响，进而影响到作为受体的曙红Y，最终引起供体与受体相对荧光强度的变化。本文在pH 3.0~10.1范围内，考察了pH对Fa/Fd的影响(Fa，Fd分别表示受体和供体的荧光强度)。由图 3表明，当体系的pH约为5.0时，Fa/Fd的值最大，因此，研究CdS (470) QDs与曙红Y之间的FRET时，体系的pH应调节为约5.0。
参照实验方法1.2.2，配制一系列的CdS (470) QDs-曙红Y FRET体系，其中加入曙红Y储备液的体积固定，而加入的CdS (470) QDs溶液的体积从100μL逐渐增加到500μL，最后加超纯水稀释到2.0mL。采用激发波长365nm、狭缝宽度5nm，测定一系列FRET体系的荧光发射光谱。如图 4所示，随着体系中CdS (470) QDs浓度的增加，曙红Y的荧光强度也逐渐增强，进一步表明CdS (470) QDs与曙红Y之间发生了共振能量转移。由文献[20]报道可知，在FRET体系中，不断增加供体浓度，受体的荧光强度会不断增加，最终达到饱和状态。
参照实验方法1.2.2，配制一系列的CdS (470) QDs-曙红Y FRET体系，其中加入CdS (470) QDs溶液的体积固定，而加入的曙红Y储备液的体积从20μL逐渐增加到100μL，最后加超纯水稀释到2.0mL。采用激发波长365nm、狭缝宽度5nm，测定一系列FRET体系的荧光发射光谱。如图 5所示，随着体系中曙红Y浓度的增加，CdS (470) QDs的荧光强度逐渐减弱，而曙红Y的荧光增强，说明随着曙红Y浓度的增大，供体和受体间的能量转移效率不断提高，且由于饱和作用，CdS (470) QDs的荧光强度下降程度减少，此现象符合FRET的特征。
从CdS (470) QDs和曙红Y浓度对FRET的影响的研究中可以看出，分别增加CdS (470) QDs和曙红Y浓度，都会发生饱和的情况，相应的荧光发射峰变化减小，这说明FRET体系中，受体供体数目比有一定关系。
参考文献[3]的方法，设1个CdS (470) QDs (供体)可同时与n个曙红Y (受体)分子发生有效的FRET，则它们之间的关系可表示为：
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{\rm{D + }}n{\rm{A = DA}}n
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(1)
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其中，D代表供体，A代表受体。以荧光强度为纵坐标，曙红Y与CdS (470) QDs的浓度比为横坐标，作图，采用两边切线外推，交点的横坐标即为n值。
由图 6中可以看出，切线外推交点横坐标A和B的横坐标分别为8.5和8.1，即n值约为8，说明在这个FRET体系中，1个CdS (470) QDs (供体)可能最多能与8个曙红Y (受体)分子之间进行有效的能量转移。
根据文献[21]，FRET效率可分为猝灭效率和增强效率两种。能量转移效率用公式可以表示为：
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E = \Delta F/{F_0}
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(2)
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式中，F0为受体或供体单独存在时的荧光强度，ΔF为构建FERT体系后受体或供体的荧光强度变化值。
根据CdS (470) QDs和曙红Y浓度对FRET的影响的研究，当用500μL的CdS (470) QDs溶液和100μL曙红Y储备液，用超纯水稀释至2mL构建FRET体系时，受体或供体的ΔF值改变幅度最大，因而选择在此条件下测定FRET效率。
猝灭效率表示为：
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Q = 1 - {F_{{\rm{DA}}}}/{F_0}
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(3)
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式中，FDA为有受体存在时供体的荧光强度，FD为没有受体存在时供体的荧光强度。
增强效率表示为：
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Y = {I_{{\rm{AD}}}}/{I_{\rm{A}}} - 1
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(4)
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式中，IAD为有供体存在时受体的荧光强度，IA为没有供体存在时受体的荧光强度。
经过计算，猝灭效率为45.6%，而增强效率则为20.1%，说明此FRET体系之间除能量转移外，还有其他过程导致能量的损失。因此在本文所建立的FRET体系中有效的能量转移效率应为增强效率，取20.1%。
根据Forster能量转移理论，能量转移效率E与供体-受体间的距离r以及临界能量转移距离R0有如下关系[22]：
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E = \frac{{nR_0^6}}{{nR_0^6 + {r^6}}}
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(5)
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式中，n为受体供体数目比，R0为E=50%时临界距离，表达式为：
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R_0^6 = 8.79 \times {10^{ - 25}}{K^2}n_0^{ - 4}{\phi _{\rm{D}}}J\left( \lambda \right)
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(6)
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式中，K为偶极空间取向因子，n0为介质的折射系数，ϕD为供体的荧光量子产率，J(λ)为供体荧光光谱与受体吸收光谱的重叠积分，表达式为：
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J\left( \lambda \right) = \frac{{\int {F\left( \lambda \right)\varepsilon \left( \lambda \right){\lambda ^4}{\rm{d}}\lambda } }}{{\int {F\left( \lambda \right){\rm{d}}\lambda } }}
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(7)
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式中，F(λ)为供体在波长λ处的荧光强度，ε(λ)为受体在波长λ处的摩尔吸光系数。
经过计算，本论文中J(λ)=9.69×10-15 cm3·L/mol，在能量供体与受体间的相互取向无规则时，取向因子取供体-受体各项随机分布的平均值，即K2=2/3；CdS (470) QDs的荧光量子产率ΦD为12.3%，折射指数n0取1.34，将上述数值代入以上公式可得：供体-受体间的距离r=4.4nm；临界能量转移距离R0=2.4nm。
本文通过观察CdS (470) QDs和曙红Y的荧光光谱，发现两者具有分别作为FRET体系的供体和受体的潜力。研究了pH、CdS (470) QDs和曙红Y浓度对FRET的影响，发现在体系pH 5.0时，CdS (470) QDs和曙红Y浓度的变化符合FRET现象的特征，证实了两者可以建立FRET体系，且构建过程快速简便。随后又进行了一系列的研究测算，获得了这个新的FRET体系的能量转移参数：受体供体数目比n=8；猝灭效率为45.6%，增强效率为20.1%；供体-受体间的距离r=4.4nm；临界能量转移距离R0=2.4nm。近年来，有诸多研究皆基于高效的FRET体系实现，如对铜离子、三聚氰胺的检测等[23, 24]，因此可以预见，继续深入本文FRET体系的研究，可为分析检测增添新的工具。
2016,
Vol. 79
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