电化学生物传感器是化学传感器的一种，它是一种将生物活性材料作为传感器的敏感元件，通过电极将物质信息实时转化为电信号或光信号的小型化装置。其工作原理是把传感器的敏感膜与复杂样品中的特定目标分析物之间(如酶与底物、抗体与抗原、核酸与互补链等)的识别反应所产生的信号，以电阻、电流或电容等物理量形式作为特征检测信号输出，这些信号与待测物质的浓度呈线性关系，从而达到定量检测待定目标分析物含量的目的。与传统检测方法相比较，电化学生物传感器具有检测速度快、灵敏度高、操作简单、成本低等优势。因此，其在核酸分子检测领域中的应用也日趋广泛，成为检测生物分子的一种重要手段。

随着科学研究的不断深入，对低浓度生物分子的检测变得日益重要，因此，提高检测的灵敏度成为生物分子检测领域的研究重点。聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)技术作为一种体外核酸扩增技术，是用来识别和定量检测DNA的传统方法。PCR技术具有很高的灵敏度，然而，它仍然存在复杂的温度循环、设备昂贵、耗时长以及非特异性的结合等缺点。随着生物化学和分子生物学的结合，核酸等温扩增技术被研究发现并不断发展，这种技术可以在某一特定温度下对特定的DNA或RNA进行扩增，在反应过程中不需特殊的仪器和温度循环，并且具有很高的特异性。在一定程度上克服了PCR的缺点。

近些年，核酸等温技术成功应用于电化学生物传感器的文章已得到广泛报道，所构建的生物传感器的灵敏度不断提高，甚至达到单分子检测水平。为了更好的开发利用核酸等温扩增技术，本文对几种主要的核酸等温扩增技术的原理及其在电化学生物传感器中的应用进行重点阐述。

Walker等^[1]在1991年首次提出了链置换等温扩增(Strand displacement amplification，SDA)技术，它是一种基于DNA聚合酶的等温扩增方法。其基本原理是通过某种方法，如限制性内切酶，在DNA链上产生缺口，在无5’-3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶的作用下，在缺口处沿着3‘端向5’端开始聚合延伸，同时剥离出下游的旧链，由于被置换下来的序列再次形成可识别的切割位点，使得“切刻-聚合-置换”的反应循环不断进行，从而实现DNA的扩增。2010年，He等^[2]设计了一种基于SDA的适体传感器用于检测可卡因，该传感器SDA形成大量的可嵌入荧光染料的双链DNA，进而可被检测到。与传统检测可卡因的方法相比较，该检测方法灵敏度更高，最低检测限可达的2nmol/L，并且该方法不用在探针上标记荧光素，降低了检测成本。Chen等^[3]设计了一种新的SDA-电化学压力DNA传感器，可对人巨细胞病毒进行实时检测，该方法灵敏度高、效率高，并且具有实时动态监测功能。

为了提高灵敏度，Yang等^[4]将SDA与杂交链式反应(hybridization chain reaction，HCR)结合，利用双重信号放大技术对microRNA定量分析，最低检测限达到0.64fmol/L。2015年，Ma等^[5]将SDA与多酶功能化的磁性微载体以及生物素-链霉亲和素体系相结合对microRNAs进行电化学检测。设计原理如图 1所示，修饰在多酶功能化的磁珠微载体上的分子信标作为SDA的聚合模板，在phi29 DNA聚合酶和dNTPs的作用下进行聚合反应，形成大量标记有生物素的双链DNA，通过生物素-链霉亲和素体系螯合在多酶功能化的磁珠微载体上。最后，在2-磷酸-L-抗坏血酸存在下，通过丝网印刷电极上酶催化的产物进行电化学检测。该方法可对microRNA进行高特异性的检测，另外，SDA的应用提高了检测的灵敏度，最低可检测到9fmol/L的靶物质。

1998年出现的滚环扩增(Rolling circle amplification，RCA)技术是核酸等温扩增技术中的典型代表。该技术实现了恒温条件下以环状DNA为模板、短单链DNA为引物的核酸快速复制，形成一条与模板链完全互补的长的含有重复序列的单链DNA^{[6, 7]}。这种方法不仅可以对DNA或RNA进行等温扩增，还能对靶核酸进行放大，实现了灵敏度的提高，并且RCA技术还具有操作简便、特异性高、快速高效等特点。因此RCA技术被广泛应用于电化学生物传感中的核酸检测。Wu等^[8]利用RCA技术，构建了一个电化学适体传感器用于检测蛋白质。实验原理如图 2所示，通过RCA形成的长链DNA产物与固定在电极表面的捕获探针结合，通过静电作用将电活性物质亚甲基蓝(MB)结合到该长链DNA上，并通过测定电化学信号的增加值来实现对血小板衍生生长因子(PDGF)的检测。Ding等^[9]报道了用于DNA和癌细胞检测的电化学生物传感器，最低检测限达到2.8amol/L。Guo等^[10]结合RCA和类过氧化物酶的DNA酶设计了一种用于检测大肠杆菌的电化学生物传感器。与已报道的方法比较，该传感器中双重扩增技术的应用使该检测方法的灵敏度进一步得到提高，最低检测限达到了8CFU/mL。

虽然RCA已被广泛应用在电化学生物传感器的设计过程中，但是其低于传统PCR技术的灵敏度仍不能满足检测需求。为了进一步提高灵敏度，超分支滚环扩增技术(Hyperbranched rolling circle amplification，HRCA)逐渐走进人们的视野。其原理是，在RCA基础上增加一条与模板链部分序列相同的引物使之能与RCA产物结合，然后在具有链替代作用的聚合酶作用下延伸，同时置换掉下游引物的延伸产物，被置换掉的产物可作为RCA引物的模板继续延伸。整个过程反复进行，最后形成一条长的双链DNA。HRCA使扩增产物在短时间内呈现出指数扩增的效果，大大提高了效率和灵敏度^[11]。Yang等^[12]设计了一个基于适体和HRCA的生物传感器，实现了对赭曲霉素A (OTA)的超灵敏检测。在该实验设计中，OTA的适体与固定于金电极上的捕获探针结合，在有OTA的存在下，与适体结合使其脱离捕获探针。重新暴露出来的捕获探针与环状模板部分结合，在连接酶的存在下，环状模板连接。之后在引物1、引物2、聚合酶以及脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的作用下，HRCA开始进行，最终形成大量的长短不一的双链DNA。然后荧光染料嵌入到双链DNA中，通过电化学发光信号进行检测(图 3)。

随着对灵敏度和特异性要求的不断提高，许多研究者将RCA与其他扩增技术相结合。Wang等^[13]将RCA与核酸内切酶介导的目标循环相结合，实现了对肿瘤标志物p53的超灵敏检测，最低检测限达到0.25fmol/L。Bi等^[14]利用RCA和链杂交反应相结合的方法成功定量检测了DNA甲基化。随后，Cheng等^[15]将RCA与SDA相结合，成功构建了电化学生物传感器检测DNA，最低检测限达到1fmol/L。RCA技术在环状模板的连接和聚合延伸过程中，需要用到酶，因此，扩增效果容易受到外界环境中温度、pH等因素的影响。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是2000年Notomi等^[16]发明的一种用于基因诊断的等温核酸扩增技术。该技术是在恒温条件下(60~65 ℃)下，利用针对靶基因特别设计的一对内引物和一对外引物，在链置换型DNA聚合酶的作用下，经过扩增阶段和循环阶段，对靶基因在短时间内进行高效、特异性的复制。以往，针对LAMP反应产物的检测是通过比较反应中产生的磷酸酶沉淀的浑浊度或加入染料来实现的。现在，一些研究学者通过将LAMP应用于电化学生物传感器的构建中成功地对LAMP产物进行了定量检测。Ahmed等^[17]利用LAMP构建了一种电化学传感器，其可对转基因在20min内进行快速检测，结果令人满意。随后，Sun等^[18]报道了一种在离子液体电极上修饰有壳聚糖/V₂O₅纳米带/多壁碳纳米管的电化学生物传感器。在实验过程中，他们将一条特异性的单链捕获探针固定在修饰后的电极上，使用电化学杂交指示剂MB检测LAMP的扩增产物。该方法具有较高的稳定性，并且可对1.0×10^-11~1.0×10^-6mol/L线性范围内的靶物质进行准确检测。

2013年，Xie等^[19]基于适体和LAMP构建了用于检测OTA的电化学生物传感器，实验原理如图 4所示。捕获探针固定于修饰有金纳米颗粒的玻碳电极表面，OTA适体通过部分互补序列与捕获探针杂交。当有OTA存在时，适体与其结合并从电极表面脱落，没有与OTA结合的适体留在电极表面，并与LAMP反应体系中的模板DNA杂交进行LAMP，生成的大量双链DNA可与反应底液中的MB结合，使底液中游离的MB减少，电化学检测信号降低，以此对OTA进行定量分析，最低检测限0.3pmol/L。

近年来，芯片传感器的快速发展，为各种检测方法提供了更为简单、便捷、微量化、多通道的平台。Nakamura等^[20]报道了一种检测LAMP产物的电化学DNA芯片传感器，这种传感器用Hoechst染料作为杂交指示剂，成功地同时检测了6种LAMP产物。尽管LAMP具有特异性高、操作简单、快速高效的优点，但其仍存在产物易污染、假阳性率高、对引物要求高的缺点。

依赖解旋酶DNA等温扩增(Helicase-dependent isothermal DNA amplification，HAD)技术是2004年美国NEB公司发明的一种核酸等温扩增技术。其基本原理如图 5所示，首先恒温下DNA双链在解旋酶的作用下打开，接着，单链DNA结合蛋白(SSB)使已解开的单链稳定处于单链状态并作为模板与引物杂交，然后，在DNA聚合酶的作用下催化扩增，新生成的双链DNA又作为底物参与下一轮的扩增。整个过程不断循环重复，最终可实现靶DNA的指数式扩增^[21]。与传统PCR需要依靠复杂的温度循环来获取模板相比，HDA只需通过添加解旋酶即可在等温条件下不断的获取单链模板。正因为HAD具有原理简单、操作简便的优势，研究学者除了将其应用于凝胶电泳、酶联免疫吸附试验和实时定量方法^[22~24]中外，还尝试将其用在电化学传感器上。

Torres-Chavolla等^[25]将HDA产物与固定在磁珠表面的捕获探针结合，在金纳米颗粒标记的检测探针加入之后，形成磁珠-靶DNA-纳米金“三明治”结构的复合物。当被磁珠分离后，复合物中的金纳米粒子在印刷碳电极上通过电化学方法被检测，以此可对50μL的靶DNA在4h内进行定量分析，效率高，特异性强。Barreda-García等^[26]提出了一种利用不对称的依赖解旋酶DNA等温扩增技术(Asymmetric helicase-dependent isothermal DNA amplification，aHDA)进行电化学检测的方法。首先，利用比正向引物过量的生物素标记的反向引物来提高作为靶物质的初始基因组DNA中生物素化的单链扩增倍数，形成大量的扩增产物；然后，通过链霉亲和素和生物素的亲和作用，扩增产物与链霉亲和素修饰的磁性微球结合，之后荧光素标记的检测探针与扩增产物杂交；最后，通过酶介导的电化学检测法在印刷丝网电极上进行定量分析(图 6)。该方法线性范围宽、检测限低、成本低，在床旁检测中具有很高的应用前景。

在HDA反应过程中，DNA解旋酶的解旋速度和延伸长度对其扩增效果具有重大影响，模板序列过长会降低扩增效率，因此，DNA解旋酶的选择和模板序列的设计是该技术的研究重点。

核酸外切酶Ⅲ(Exonuclease Ⅲ，Exo Ⅲ)是一种以双链DNA为切割底物，切割方向为3-5，并且要求3端为平齐或者凹陷末端的外切酶。它从多核苷酸的3’端开始按序催化水解3, 5-磷酸二酯键，最后获得5’-单核苷酸产物^[27]。与内切酶相比较，核酸外切酶Ⅲ辅助的靶物质循环技术没有序列依赖性，在探针设计和靶核酸的分析方面更加简单易行，因此，该扩增技术已广泛应用于核酸的检测^[28~32]。Wu等^[30]设计了一个基于核酸外切酶Ⅲ辅助的靶物质循环技术的无标记电化学DNA传感器。如图 7所示，靶物质与信号探针形成3‘端为凹陷端的信号探针和3’端为突出端的靶物质特殊结构的双链DNA。在Exo Ⅲ的作用下，信号探针被切割，具有3’突出末端结构的靶物质被保留并从双链上脱落，与新的信号探针杂交进入下一轮循环。通过静电作用吸附在信号探针上的RuHex可直接反应保留在电极表面上信号探针的量和长度。在该设计中，RuHex作为氧化还原反应的电子传递媒介，虽然具有很强的吸附作用，但是其价格昂贵并且和单链DNA并非特异性结合。另外，如果DNA链上的错配区域比较靠近3’末端，单链DNA也会被Exo Ⅲ剪切。

Liu等^[31]设计了以可形成G-四联体-氯化血红素复合体的双链DNA探针作为信号探针的传感器。该方法克服了单链DNA被Exo Ⅲ剪切的缺点，由于在形成G-四联体复合物时需要氯化血红素和K⁺的存在，因此整个过程相对耗时和复杂。Xuan等^[32]将一条3’端为突出端并且有MB修饰的分子信标固定于电极表面，没有靶物质时，分子信标呈现出茎环结构，使MB远离电极表面，产生极小的电信号；而有靶物质时，分子信标发夹结构打开并在ExoⅢ的作用下进行循环酶切，被切下来的MB靠近电极表面，从而使信号增强。该传感器设计简单、检测灵敏度高、成本低，为DNA的检测提供了一个高效的方法。

杂交链式反应(Hybridization chain reaction，HCR)是Pierce等^[33]在2004年提出的一种链置换驱动的等温、无需酶参与的DNA自组装扩增技术。其基本的反应原理是当包含有与一条茎环结构DNA (H₁)部分互补序列的靶DNA存在时，其作为初始链与H₁结合，H₁的茎环被打开，打开后的H₁又包含了与另一条茎环结构DNA (H₂)部分互补的序列，H₁与H₂结合后使H₂的茎环结构打开形成双链DNA，这条双链DNA的末端会产生一段新的与初始引发链碱基序列相同的单链区域。这段初始引发链的不断生成，可以使杂交连锁反应不断进行，最终形成一条很长的带切口的双螺旋DNA链，直到茎环结构DNA用完为止(图 8)。这种技术设计简单，只需两条茎环结构DNA链和一条单链DNA引发链，并且不需酶的参与^[34]，这些优势使其在电化学传感器中得到了广泛的应用。Zhou等^[35]利用结合在功能化的纳米金上的引发链促发HCR的免疫传感器检测癌胚抗原，最低检测限为1.0fg/mL。Qian等^[36]将适体与HCR相结合，构建了一种无酶无标记的电化学适体传感器，用于凝血酶的检测。Liu等^[37]成功地将HCR与催化发夹自组装技术结合在一起，使构建的传感器灵敏度进一步得到提高。

2014年，Xuan等^[38]提出了一种非线性HCR技术。之后，Jia等^[39]将非线性HCR技术应用于电化学生物传感器中进行DNA检测。该方法通过一条捕获探针、两条辅助探针(A_1，A₂)、辣根过氧化物酶标记的杂交DNA链(HRP-H₁)以及杂交链2(H₂)进行非线性HCR，形成树枝状的DNA结构(图 9)。该方法在一定程度上提高了检测的灵敏度，最低检测限可达到0.4fmol/L。

电化学生物传感器的研究将电化学和分子生物学紧密结合起来，其快响应、高灵敏、低成本等优点使其在核酸、蛋白检测、遗传疾病诊断、病原微生物检测、转基因生物检测等方面得到广泛关注。与传统的模板扩增技术相比较，核酸等温扩增技术摆脱了对精密仪器的依赖，可广泛应用于电化学生物传感器中电化学分析的信号放大。虽然单一的核酸等温扩增技术的灵敏度没有传统扩增技术的高，但是随着更多核酸等温扩增技术的提出和纳米技术的发展，两种或多种扩增技术的结合，以及核酸等温扩增技术与纳米技术的结合，大大提高了检测的灵敏度，同时也提高了传感器的特异性和重现性。随着核酸等温扩增技术和电化学生物传感器研究的不断发展，改进现已成熟的核酸扩增技术的反应条件、研发原理和设计简单的新的扩增技术、发展微型化、多通量、商品化的电化学生物传感器，使其在临床医学诊断中得到实际应用，将会是电化学生物传感器的研究发展方向。