三芥子酸甘油酯类似物的合成及抑菌活性

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	邵艳东

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	林强

三芥子酸甘油酯类似物的合成及抑菌活性

邵艳东, 王向辉^*, 谢灵杰, 门睿, 林强^*

海南师范大学热带药用植物化学教育部重点实验室海口 571158

2016-03-18 收稿, 2016-05-30 接受

基金项目: “十二五”国家科技支撑计划农药专项（2011BAE06B04-07）、海南省重点科技计划项目（ZDYF2016095）和海南省教育厅高等学校研究项目（HNKY2014-39）资助

通信作者: 王向辉, 男, 副教授, 主要从事精细化学品分子设计合成研究, E-mail:god820403@163.com
林强, 男, 教授, 主要从事生物材料、精细化学品设计与合成, E-mail:linqiang@hainu.edu.cn

摘要：以N-（2-溴乙基）邻苯二甲酰亚胺或N-（4-溴丁基）邻苯二甲酰亚胺和硫氢化钠为起始原料，通过取代、肼解、亲核加成等反应合成了10个三芥子酸甘油酯（erucin）类似物，通过核磁共振氢谱、碳谱及质谱对其结构进行了确认。采用比浊法初步测试了其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和四联球菌等7种菌的生长抑制活性，测试结果显示，化合物对测试菌种都表现出较好的生长抑制活性，其中苄硫乙基-1-硫代异硫氰酸酯（5e）和苄硫基丁基-1-硫代异硫氰酸酯（5j）活性最高，对大肠杆菌的最低生长抑制浓度仅为7.8μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最低生长抑制浓度也仅为15.6μg/mL和31.2μg/mL。

关键词：三芥子酸甘油酯合成杀菌活性

Syntheses and Antibacterial Activities of Erucin Derivatives

Shao Yandong, Wang Xianghui^*, Xie Lingjie, Men Rui, Lin Qiang^*

Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education, Hainan Normal University, Haikou 571158

Abstract: Ten erucin analogues were synthesized through substitution, aminolysis, and nucleophilic substitution reaction, starting from N-(2-bromoethyl)phthalimide or N-(4-bromobutyl)phthalimide and sodium hydrosulfide. All of synthesized compounds were tested for their antimicrobial activities in vitro by turbidimetric method against Escherichia coli(DH5a), Staphylococcus aureus(ATCC25923), Staphylococcus albus(ATCC8799), Staphylococcus lutea(ACCC11001), Bacillus subtilis(ATCC6633), Bacillus cereus(ACCC11077) and Micrococcus tetragenus(ATCC35098). The results indicated that all compounds exhibit good antimicrobial activities. Benzyl(2-thiocyanatoethyl)sulfane(5e) and benzyl(4-thiocyanatobutyl)sulfane(5j) showed best inhibitory effects against Escherichia coli(DH5a), with the minimum inhibitory concentration(MIC) of 7.8μg/mL, and excellent inhibitory effects against Staphylococcus aureus(ATCC25923), with the MIC of 15.6μg/mL and 31.2μg/mL.

Key words: Erucin Synthesis Antibacterial activity

三芥子酸甘油酯(erucin，I)是一种新的潜在化学预防剂，来源于酶催化芝麻菜苷的水解产物，是Gmelin等^[1]于1970年首次从油料作物芝麻菜(芸芥，Eruca sativa Mill.)的种子中分离出的。研究表明，芝麻菜苷及其水解产物三芥子酸甘油酯具有潜在的生物活性及药用价值^[2-5]。

三芥子酸甘油酯的合成方法已有文献报道^[6-8]，但关于其类似物合成的报道却较少^[9]。鉴于很多含硫氰酸酯基的化合物具有杀虫、抗菌、抗炎等生物活性^[10-13]，推测含有异硫氰酸酯基的三芥子酸甘油酯也可能具有类似的生物活性。因此，本文通过改变碳链长度及异硫氰酸酯基硫上的取代基类型，合成了一系列三芥子酸甘油酯类似物，并初步测试了其对7种常见革兰氏阳性菌和阴性菌的生长抑制活性。旨在为后继开发新型农用杀菌剂提供理论和数据支持。目标化合物的合成路线见图式 1。

图式1 目标化合物的合成路线 Scheme1 Synthetic route of target compounds

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

WRX-4显微熔点仪(上海将来实验设备有限公司)；Bruker-400核磁共振谱仪(瑞士Bruker公司)；EYEL4磁力搅拌低温恒温水槽(东京理化器械株式会社)；Bruker HCT型电喷雾质谱仪(布鲁克·道尔顿公司)。所用试剂均为市售化学纯或分析纯，液体试剂用前均按照标准操作进行纯化处理。

1.2 化合物的合成

1.2.1 化合物2a、2b的合成

化合物N-(2-巯基-乙基)邻苯二甲酸亚胺(2a)的合成：在100mL两口烧瓶中依次加入5mmol N-(2-溴乙基)邻苯二甲酸亚胺(1a)、6mmol硫氢化钠、0.30g四丁基溴化铵(TBAB)和60mL DMF，氮气保护下室温反应6-8h，TLC监测(展开剂，石油醚:乙酸乙酯=5:1，体积比，下同)至反应结束。取下反应瓶，加入50mL去离子水，用3×30mL乙酸乙酯萃取，有机层用2×30mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤。滤液减压蒸除溶剂，残余物经柱层析(石油醚:乙酸乙酯=20:1)分离，得白色固体0.91g，产率88%，熔点77-78℃(文献值^[14]76-77 ℃，收率68%)。

化合物N-(4-巯基-丁基)邻苯二甲酸亚胺(2b)采用类似的方法合成，理化性质和NMR数据与文献报道^[7]一致。

1.2.2 中间体化合物3a-3j的合成

N-[2-(甲硫基)乙基]邻苯二甲酰亚胺(3a)的合成：在100mL两口烧瓶中，依次加入5mmol化合物^2a、6mmol CH₃I、6mmol K₂CO₃和30mL DMF，氮气保护室温反应10h，TLC(石油醚:乙酸乙酯=15:1)监测至反应结束。向反应瓶中加入50mL去离子水，用3×30mL乙酸乙酯萃取，有机层用2×30mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，抽滤，减压蒸除溶剂。残余物经柱层析(石油醚:乙酸乙酯=15:1)分离，得白色固体0.99g，产率90%，熔点87-88 ℃(文献值^[15]：88-89 ℃，收率66%)。¹H NMR (400MHz，CDCl₃)δ：2.39 (s，3H)，3.02 (t，J=6.8Hz，2H)，4.13 (t，J=6.8Hz，2H)，7.92-8.08 (m，4H)；¹³C NMR (101MHz，CDCl₃)，δ：15.2，32.2，36.5，123.4，132.1，134.0，168.2；MS (ESI) m/z：222.1 [M+H]⁺。

化合物3b-3j的合成方法与3a相似，理化数据见表 1。

表 1 中间体3b-3j的理化性质及核磁数据 Table 1 ¹H NMR and physical parameter data of the compounds (3b-3j)

1.2.3 目标化合物5a-5j的合成

按文献^[7]方法以甲醇作溶剂，在回流条件下对化合物3a进行肼解，后处理后得油状液体(2-甲硫基-乙胺，4a)，无需进一步纯化直接用于下一步反应。

2-(甲硫基)乙基异硫氰酸酯(5a)的合成：在100mL圆底烧瓶中加入10mmol化合物4a、35mmol三乙胺和30mL THF，0℃下搅拌5min。采用恒压漏斗滴加11mmol CS₂的20mL THF溶液，30min内滴加完毕，室温下反应2h，再降至0℃下反应约5min，加入12mmol甲基磺酰氯，0℃下反应30min后室温反应1h。加入100mL乙醚稀释，出现的大量悬浮物，依次用2×30 mL盐酸(1mol/L)、30mL水和30mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。残余物经柱层析分离，用石油醚洗脱，得黄色油状液体1.08g，产率为81%。

化合物5b-5j的合成方法与5a相似，产物均为黄色油状液体，理化数据见表 2。

表 2 目标化合物5a-5j的核磁和质谱数据 Table 2 ¹H NMR,¹³C NMR and MS data of the target compounds (5a-5j)

化合物	n	R	产率/%	¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆) δ	¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ	EMI-MS，m/z
5a	1	CH₃	81	2.11(s，3H)，2.80(t，J=6.4Hz，2H)，3.85(t，J=6.4Hz，2H)	14.31，33.34，44.28，128.48	156.1[M+Na]⁺
5b	1	CH₃CH₂	81	1.20(t，J=7.4Hz，3H)，2.58(q，J=7.4Hz，2H)，2.85(t，J=6.4Hz，2H)，3.85(t，J=6.4Hz，2H)	14.7，24.8，30.8，44.9，128.5	170.1[M+Na]⁺
5c	1	CH₃(CH₂)₂	83	0.96(t，J=7.3Hz，3H)，1.52-1.61(m，2H)，2.56(t，J=7.1Hz，2H)，2.83(t，J=6.4Hz，2H)，3.84(t，J=6.4Hz，2H)	13.1，22.2，31.1，33.0，44.9，128.7	162.1[M+H]⁺
5d	1	CH(CH₃)₂	84	1.24(d，J=6.7Hz，6H)，2.86(t，J=6.5Hz，2H)，2.97-3.07(m，1H)，3.81-3.84(t，J=6.5Hz，2H)	23.3，30.0，34.3，45.3，129.0	162.1 [M+H]⁺
5e	1	C₆H₅CH₂	86	2.75(t，J=7.0Hz，2H)，3.81-3.84(m，4H)，3.70(s，2H)，7.28-7.36(m，5H)	30.8，34.7，44.5，127.0，128.5，128.7，128.9，138.2	224.1 [M+H]⁺
5f	3	CH₃	83	1.60-1.74(m，4H)，2.04(s，3H)，2.50(t，J=6.9Hz，2H)，3.69(t，J=5.8Hz，2H)	14.4，25.6，27.9，32.3，44.4，128.5	184.1[M+Na]⁺
5g	3	CH₃CH₂	84	1.21(t，J=7.4Hz，3H)，1.60-1.80(m，4H)，2.49-2.57(m，4H)，3.69(t，J=6.4Hz，2H)	14.7，24.9，26.0，28.5，29.8，44.4，127.9	198.2[M+Na]⁺
5h	3	CH₃(CH₂)₂	85	0.96(t，J=7.2Hz，3H)，1.54-1.67(m，4H)，1.72-1.79(m，2H)，2.47-2.55(m，4H)，3.69(t，J=6.3Hz，2H)	13.2，22.5，26.1，28.5，30.2，33.1，44.4，127.8	212.1[M+Na]⁺
5i	3	CH(CH₃)₂	82	1.24(d，J=6.7Hz，3H)，1.59-1.80(m，4H)，2.56(t，J=7.2Hz，2H)，2.90-2.96(m，1H)，3.69(t，J=6.4Hz，2H)	23.3，26.3，28.6，28.9，34.0，44.4，127.9	212.1[M+Na]⁺
5j	3	C₆H₅CH₂	86	1.66-1.80(m，4H)，2.46(t，J=6.9Hz，2H)，3.48(t，J=6.5Hz，2H)，3.74(s，2H)，7.23-7.36(m，5H)	26.0，29.0，30.4，36.2，44.7，127.1，128.6，128.9，130.1，138.4	238.1 [M+H]⁺

表 2 目标化合物5a-5j的核磁和质谱数据 Table 2 ¹H NMR,¹³C NMR and MS data of the target compounds (5a-5j)

1.3 抑菌活性测试

采用比浊法^[16]测定所合成化合物的细菌生长抑制活性。以大肠杆菌Escherichia coli (DHa)、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (ATCC25923)、白色葡萄球菌Staphylococcus albus (ATCC8799)、藤黄八叠球菌Staphylococcus lutea (ACCC11001)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (ATCC6633)、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus (ACCC11077)及四联球菌Micrococcus tetragenus (ATCC35098)为供试菌种(由海南师范大学热带药用植物化学教育部重点实验室提供)。采用二倍稀释法，以二甲亚砜溶液为空白对照，环丙沙星为阳性对照。设置供试化合物的质量浓度范围为3.9-500 μg/mL。处理后的培养板置于37℃恒温箱中孵育48h，用酶标仪检测其在590nm下的吸光度，其中吸光度最小且无菌生长的孔中所含的最低药物浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。试验重复3次，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 目标化合物的合成

以溴代烷基邻苯二甲酰亚胺(1a、1b)为初始原料，经TBAB催化与硫氢化钠在氮气保护下反应6-8 h制备中间体硫醇(2a、2b)；以DMF为溶剂、碳酸钾为缚酸剂、碘化钾作为催化剂，氮气保护下与卤代烷室温反应，TLC跟踪实验至结束后，柱分离得到中间体3a-3j；在甲醇溶液中，采用水合肼处理3a-3j进行肼解反应，得到中间体4a-4j；在四氢呋喃溶液中，以三乙胺作为催化剂，与二硫化碳、甲基磺酰氯反应，得到目标化合物5a-5j。

在中间体2的合成过程中，采用了卤代烃与硫氢化钠反应的方法，一步制备了硫醇化合物。分别采用参考文献方法与本文方法进行中间体硫醇2a的合成，并将比较结果列于表 3。本文所采用的方法条件温和，操作方便，产率最高。

表 3 中间体2a的合成方法比较 Table 3 The comparison of different synthesis methods of intermediate compound 2a

2.2 化合物图谱解析

由表 1可知，中间体3b-3j硫原子两侧碳上的氢原子由于化学环境不同，3b中的甲基出峰位置为δ 1.18，受到邻位碳原子上2个氢原子的影响裂分为三重峰，而与之相邻的碳原子上的氢的出峰位置为δ 2.55，裂分为四重峰，这两组峰耦合常数同为7.4Hz，说明其相邻；而硫原子与氮原子中间的碳原子上的氢原子由于受到两个电负性原子的影响，出峰位置移向低场，其裂分规律和耦合常数都相符合，苯环上的4个氢原子出现在较低场，容易辨认。

由表 2中目标化合物5b-5j 的¹³C NMR分析可以看到，同样由于化学环境的不同，碳原子出峰位置有明显的差异，甲基的化学位移在高场，随着受到电负性原子的影响或者不饱和基团的作用移向低场，在δ 127-129之间出现了“—NCS”的特征峰。另外质谱数据也与计算结果相符合，能进一步确认了所合成化合物的结构。

2.3 抑菌活性

化合物的抑菌活性测定结果见表 4。从中可以看出，所有本文合成的化合物对测试菌种都表现出一定的生长抑制活性，其中的大部分对测试菌种的最小抑制浓度不高于125μg/mL，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制活性明显优于其余5种测试菌种；其中5e、5j抑菌效果最为突出，明显优于其余8个测试化合物，对大肠杆菌的最小生长抑制浓度仅为7.8μg/mL，而对金黄色葡萄球菌的最小生长抑制浓度也仅为15.6μg/mL和31.2μg/mL，对其余5种测试菌种同样表现出优良的生长抑制活性。通过对化合物结构和其抑菌活性进行分析发现，当增加硫原子和氮原子之间碳链长度，对于化合物的抑菌能力没有明显的提升，但是当将R取代基由烷基变为苄基的时候，其抑菌能力明显提升。

表 4 目标化合物的抑菌活性(μg/mL) Table 4 Antibacterial activity of target compounds(μg/mL)

3 结论

经取代、肼解和加成等反应制备了10个三芥子酸甘油酯类似物，收率在80%以上。目标化合物的合成共经历4步反应，与文献报道的5步反应相比，具有收率高(总收率大于50%，文献值30%左右)、反应时间短、废弃物少等优点。

采用比浊法选用7种常见细菌对合成化合物的抑菌活性进行了测试，结果表明，所合成化合物对测试菌种均具有一定的生长抑制活性，其中，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用明显优于其余5种测试菌种；化合物5e和5j对测试菌种的抑制效果尤其突出。通过对化合物结构和其抑菌活性进行分析发现，当增加硫原子和氮原子之间碳链长度，对于化合物的抑菌能力没有明显的提升，当将R取代基由烷基变为苄基的时候，其抑菌能力明显提升。

致谢: 感谢海南师范大学化学与化工学院测试中心提供的测试帮助和支持。

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