胡椒碱是胡椒果中最具实用价值的活性成分，被广泛应用在生物医学领域^[1~3]，具有抗癌^[4]、抗菌^[5]、抗抑郁症^{[6, 7]}、抗氧化^[8~11]、增强免疫^{[12, 13]}等功效，这些药用功能主要归功于纯化的含哌啶胡椒碱成分。胡椒碱能降低促进肿瘤细胞增殖物质和多胺类的合成，从而有效抑制肿瘤细胞的繁殖^[14]。将胡椒碱作用于黑色素肿瘤细胞，结果表明胡椒碱能抑制基质金属蛋白的产生，从而抑制NF-kappaB、CREB、c-Fos、ATF-2以及导致炎症的细胞因子的表达^[15]。Sunila等^[16]证明胡椒碱可以抑制埃利希氏腹水癌细胞和腹水淋巴瘤的细胞毒作用，抑制肿瘤的产生，还可增加Bal b/c小鼠的白细胞和血小板数量。以上研究表明，胡椒碱具有独特的抗肿瘤效果。

胡椒碱的提取方法较多，有溶剂提取法^[17]、酸水提取法^[18]、超声波提取法^[19]、微波提取法^[20]、超临界流体二氧化碳提取法^[21]和超声波离子液体提取法^[22]等。胡椒碱有4种构型异构体(胡椒碱、异胡椒碱、胡椒脂碱和异胡椒脂碱)，其中胡椒碱是活性最强、药用价值最高的。因而，分析胡椒碱的几何结构和建立其理论模型有利于研究胡椒碱的功能和性质。其中Li等^[23~27]运用密度泛函理论(DFT)方法对寡肽链、低聚壳聚糖和丙烯腈单体的几何结构、红外光谱和基团活性等进行了研究，更是证明了物质的结构决定其物理化学性质。

本文以95%的乙醇溶液为溶剂，采用溶剂回流法提取得到粗胡椒碱，并以丙酮为溶剂，采用重结晶法纯化胡椒碱。同时用高效液相色谱仪表征纯化后的胡椒碱纯度，并用MTT法表征不同浓度胡椒碱在不同时间内的抗癌效果。此外，用DFT^{[28, 29]}建立胡椒碱结构模型，分析其几何结构、相对能和热力学分布。本文的研究结果对胡椒碱的提取、分离纯化、模型建立、抗癌性能研究等都有重要的借鉴作用。

SENCO旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；LC-2000高压液相色谱仪(上海天美科学仪器厂)；Nicolet 6700傅立叶变换红外光谱仪(赛默飞世尔科技分子光谱部)。

海南胡椒果(黑胡椒粒，红土种植)；6.0mol/L盐酸溶液；98%乙醇(分析纯)；甲醇(色谱纯)；乙醚(分析纯)；丙酮(分析纯)；二甲基亚砜(分析纯)；MTT (上海生工生物工程技术服务有限公司)；C6细胞(中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所)；RPMI 1640培养基和胎牛血清(杭州吉诺生物医药技术有限公司)。

本实验以胡椒果为原料，研磨成60目粉末，取10g胡椒粉末加入100mL 95%乙醇溶液于80℃下回流2h。抽滤收集滤液，滤渣用40mL 95%乙醇浸泡，再次80℃下回流2h。将两份滤液合并进行减压蒸馏，浓缩至10~15 mL，用6mol/L的盐酸调节pH至4，静置4h。离心后过滤，除去不溶于酸的胡椒酸，滤液用NaOH溶液调节pH至11，静置2h，再在热水浴中缓慢加入20mL蒸馏水，溶液变浑浊状，再加适量蒸馏水，待有黄色沉淀析出，再将溶液置于冰水上充分冷却4h，在1200r/min下离心10min得到的黄色粉状固体，即粗胡椒碱。

在粗胡椒碱中加入25mL丙酮，微热溶解。若有固体析出则进行趁热过滤，随后加入与丙酮等量的蒸馏水，待有大量固体析出，进行离心、过滤得到固体，再向滤液中加入与丙酮等量的蒸馏水，待固体析出，再离心、过滤得到固体，重复此步骤2~3次。将得到的固体用乙醚去除脂溶性物质，经干燥得到较高纯度的淡黄色粉末胡椒碱。

将1mg胡椒碱和150mg KBr在玛瑙研钵中研磨，压制成样品片，测定胡椒碱的红外光谱图。测试样品片之前以150mg KBr压制的作为空白片，采集参比背景光谱。最后将获得的胡椒碱红外光谱图与图谱库中的标准图进行检索比对。

将0.1g胡椒碱溶解在20mL甲醇中，用微滤膜过滤后测液相色谱。色谱条件：色谱柱为Diamonsil C₁₈柱，流动相为甲醇，流速为0.25mL/min，柱温25℃，进样量为0.2μL，检测器为紫外检测器，检测波长为341nm (紫外光谱测得的最大吸收波长)。

用DFT的B3LYP方法在6-31G (d, p)水平对胡椒碱16种构象结构分别进行几何结构、能量和热力学分布的优化计算。经优化后得到4种能量最低的稳定构象，对稳定构象的能量和热力学平衡分布比对，建立最优胡椒碱结构模型。

取C6细胞种于96孔板中，接种密度为1万细胞/孔，每孔体积200μL。培养过夜后，加入梯度稀释的胡椒碱的PBS溶液(每孔终溶度分别为0.28、2.85、7.12、14.24、28.50 μg/mL)，与细胞共培养24、48和72 h。每个梯度做5个平行孔，以PBS缓冲液作为空白对照，随后用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞抑制率。每孔加MTT溶液20μL (5mg/mL)，37℃避光孵化4h，之后除去孔中液体，加入200μL二甲基亚砜，摇床混匀20min。之后用酶标仪检测570nm处吸光值，并计算出C6细胞的IC₅₀。

抑制率=[(A_对照组-A_实验组)/A_对照组]×100%

实验中所用的胡椒粉质量为10g，经回流法提取和重结晶处理，得到纯度较高的胡椒碱0.78g。计算得胡椒粉中的胡椒碱含量为7.8%。所得胡椒碱的液相色谱见图 1，根据面积归一法求得纯化后的胡椒碱的纯度高达99.94%。

本文的实验方法能够提取得到较高产率的胡椒碱，且该法克服了传统提取方法中常用有机溶剂的不足之处(如甲醇、氯仿等有毒性)，也克服了酸提取法对水环境的污染。因此，该实验方法对高纯度胡椒碱的提取及后续开发应用有着重要的参考意义。

胡椒碱的结构中含有一个苯环，并与共轭双键形成一个较长的共轭体系，还含有六氢吡啶环、羰基、酰胺键、醚键、C-O和C-N键等。图 2中，1583、1491、1448 cm^-1处为苯环的特征峰，由于胡椒碱苯环和双键形成共轭体系，使得苯环吸收峰较低于正常值^[30]，但其强度增加，如1583.3cm^-1处的特征峰。在3008cm^-1处存在一个中等强度的吸收峰，是芳环上-H的伸缩振动产生的特征峰。在2938cm^-1处的强吸收峰是碳碳双键上不饱和H的伸缩振动特征峰。在1634cm^-1处的强吸收峰是酰胺基的特征峰，且由于共轭效应影响使得吸收峰波长发生红移，且强度变大。在1253cm^-1处的强吸收峰是饱和碳上H的弯曲振动特征峰，由于六氢吡啶环中有5个-CH₂基团相连成链使得其向低波数方向移动，并可从718.7cm^-1的相关峰得到佐证。

将所制备的胡椒碱的红外光谱在谱图库中进行检索和对比。结果显示，实验制备的高纯度胡椒碱与胡椒碱标准谱图匹配度高达93.61%。此外，胡椒碱红外光谱图中的特征峰与文献^{[31, 32]}报道的特征峰一致。以上结果均表明，实验中提取得到的产物为高纯度胡椒碱。

物质的结构决定其物理化学性质。研究胡椒碱的功能和性质首先需要确定其稳定的构象。根据统计学原理，利用体系准确计算的热力学数据可以计算出298.15K下的吉布斯自由能数据，由此我们可以计算出常温下(298.15K)胡椒碱的4种稳定构象的热力学平衡分布。表 1列出了成分大于1%的稳定构象的相对能、偶极矩和同种构型不同构象的平衡分布数据。Stepania等^[33]利用实验的红外光谱和各稳定构型的计算光谱估算出实验条件下的缬氨酸分子结构的分布。本文运用另一种与林子敬等^[34]相同的方法计算了常温下胡椒碱不同构象的分布情况。由表 1中所有胡椒碱构象的相对能E_R可知，胡椒碱4种构象的能量依次增高，其中构象1的能量最低。由不同构象的热力学分布可知，最稳定的4种构象1、2、3、4的含量共占胡椒碱16种构象的99.73%，其中构象1的分布最多(41.678%)，为最优结构模型。

对胡椒碱的抗癌活性进行了测试。以IC₅₀参数来表示抗癌活性是较为常用的方法^{[35, 36]}。如图 3，MTT结果显示，PBS空白组的C6细胞几乎没有凋亡，而与胡椒碱共培养之后的C6细胞在24h的IC₅₀约为26.9μg/mL，在48h后的IC₅₀达到约12.6μg/mL，72h之后的IC₅₀只有约6.1μg/mL，表明胡椒碱对C6细胞的药用活性存在浓度和时间依赖性。此外，所制备的胡椒碱在一定浓度下的抗癌活性高于文献[37]的报道值，这可能是由于本文方法提取到胡椒碱具有更高的纯度所致。

本文采用回流法提取和重结晶法纯化胡椒碱，收率为7.8%，纯度达99.94%。对纯化后的胡椒碱进行不同浓度和时间下的抗癌活性试验和分析，证明胡椒碱具有良好的抗肿瘤细胞功效。运用密度泛函理论中的B3LYP/6-31G (d, p)方法，对胡椒碱的结构、偶极矩、能量和热力学分布进行优化计算，确立了胡椒碱的最优结构模型。本文的研究对指导胡椒碱的提取、分离纯化、模型建立、抗癌性能研究具有重要意义。