巯基化合物是生物体内重要的组成部分，对生物体的正常运行发挥着不可或缺的作用。生物体内常见的巯基化合物包括半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)等。Cys是人体内发挥重要作用的一种氨基酸。它的缺乏会引起儿童发育缓慢、头发褪色、肝脏损伤、乏力、嗜睡等症状^[1]。Hcy是Cys的变种，它比Cys在连接巯基的碳链上多了一个亚甲基。Hcy含量是一项常规体检项目，其体内含量较高的人往往更容易患上心脑血管类的疾病，已经有不少研究证实二者之间存在密切关联^[2~4]。GSH是由谷氨酸、Cys、甘氨酸组成的三肽。GSH在生物体解毒^{[5, 6]}以及肝病^[7]和肾病^[8]的治疗方面有着广泛应用。GSH在食品、医疗、美容等行业也已经有许多相关商业化的产品面世。另外，二硫苏糖醇(DTT)在生命分析中也被广泛使用，比如用来修饰核酸适配体，使后者能够轻松连接到金电极上^{[9, 10]}。这些巯基化合物在医疗卫生以及科学研究中发挥着如此巨大的作用，发展关于他们的检测方法也越来越成为科学家们关注的焦点。越来越多的检测巯基化合物的方法被提了出来，比如荧光法^[11~16]、电化学方法^[17]、色谱法^[18]、比色法^[19]。其中比色法只能做到半定量检测，电化学方法的重现性和稳定性不是很理想，色谱法存在需要特定的色谱柱和大量的有机溶剂等劣势。荧光法由于操作简单、选择性好、灵敏度高等优点逐渐普及起来。但是大多数荧光法往往需要合成一种特定的荧光探针^[11~15]或者量子点^[16]。这些合成步骤会花费较长的时间，不适合快速检测。

在本文中，我们提出了一种直接以异硫氰酸荧光素(FITC)作为荧光探针的快速检测巯基化合物的方法。我们在实验中首次发现了巯基化合物能使FITC荧光强度显著降低这一有趣现象，以此为出发点探究了影响该现象的pH、时间等条件，并且在此基础上提出了一种快速检测巯基化合物的新方法。

FITC、DTT、GSH、Hcy、Cys以及其他氨基酸均购买于Sigma公司。碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、盐酸等均购于南京化学试剂一厂。还原型谷胱甘肽胶囊购于美国杰诺公司。所有实验用水均是超纯水。所用药品和试剂均为分析纯级。

F-7000荧光光谱仪(日本日立)；5424离心机(德国eppendorf)；pH3c精密pH计(上海伟业仪器厂)。

在2mL离心管中加入100μL 10^-3mol/L的FITC和不同浓度的巯基化合物，然后用缓冲溶液调节体积至1mL，静置一段时间，以494nm为激发波长，在500~650 nm间扫描荧光光谱，记录528nm处的荧光强度。

在FITC溶液中加入巯基化合物，分别扫描加入巯基化合物前后FITC溶液的荧光光谱，以加入GSH后的结果为例作图，如图 1所示，在加入GSH之后，FITC溶液的荧光强度出现了明显的下降。其机理是FITC的异硫氰基和GSH的巯基发生反应，生成新的不发荧光的物质^[20]，使荧光强度下降。

为了选取合适的pH条件，用不同pH的缓冲溶液配制FITC溶液，分别记录加入巯基化合物前后FITC溶液的荧光强度，以加入GSH后的结果为例作图，如图 2所示。从图中可以看到FITC在酸性时荧光强度很弱，随着pH的增大，荧光强度逐渐增强，在pH超过11之后荧光强度又迅速降低。加入GSH之后的FITC的荧光强度变化趋势也有类似的特点。考虑到在pH为10时FITC的荧光强度最高，且加入GSH之后荧光强度下降最明显，故选取pH10为最佳pH条件。

为了考察反应所需的时间，在FITC溶液中加入不同浓度的巯基化合物，从0min开始在不同的时间点记录荧光发射强度，以加入GSH后的结果为例作图，如图 3所示。从图中可以看到，在加入不同浓度GSH后，FITC溶液的荧光强度在0到2min内明显下降，在2min之后荧光强度变化趋于平缓。由此可以推断, GSH加入FITC溶液之后反应立即开始，并且在大约2min之内完成反应。为了保证足够的反应时间，且考虑到实际操作的可行性，选择在加入巯基化合物之后5min来测量荧光强度。

为了验证该方法的选择性，在FITC溶液中分别加入一系列巯基化合物和其他氨基酸，测定荧光强度，结果如图 4所示。从图中可以看到只有与含有巯基的GSH、Cys、GSH、DTT反应之后FITC的荧光强度出现了明显的降低，其他氨基酸的存在均不会使FITC的荧光产生明显变化。可见该方法具有良好的选择性。

在上述优化条件下，在FITC溶液中加入不同浓度的巯基化合物，扫描荧光光谱，以加入GSH后的结果为例作图，如图 5a所示，随着GSH浓度的增加，荧光强度出现了有梯度的降低。以(F-F₀)/F₀随GSH浓度作线性关系图，结果如图 5b，在1~90 μmol/L得到了良好的线性关系，线性方程是Y=-0.00465C-0.03735，R²=0.994，其中Y是(F-F₀)/F₀，C是GSH浓度(μmol/L)。

类似地，我们也对其他巯基化合物Hcy、Cys、DTT做了标准曲线，结果如表 1所示。

我们选取了市场上常见的一种还原型谷胱甘肽胶囊作为样品，来验证本方法对实际样品的检测效果，结果如表 2所示。该结果与胶囊说明书的描述一致。我们还用该样品做了多次回收试验，回收率103.4%~94.54%，回收效果良好。

本文基于巯基化合物对FITC荧光强度的猝灭作用，建立了一种快速检测巯基化合物的新方法，且用于实际样品的检测取得了理想的检测效果。与以往的报道相比，本方法最大的优点就是用时极短，在5min内即能完成检测，同时具有线性范围广、选择性好等优点。