力在生物过程中扮演着重要角色。所有生物的运动过程，从细胞的活动到DNA的解旋和复制，都是由分子力驱动。近年来，随着单分子测量技术的发展，科学家能够直接测量从蛋白质、DNA等生物分子到细胞所产生的力与位移，从而在单分子水平上研究生命相关过程^[1～3]。

单分子力谱技术不断发展。目前单分子操纵能力可跨越6个数量级，长度在10^-10～10^-4m范围内，从细胞操纵(100μm)到RNA聚合酶推进单碱基对测量(0.34 nm)；力在10^-14～10^-8N范围内，从共价键断裂机理分析(nN)到核酸折叠动力学分析(pN)。单分子力谱技术应用广泛，可以通 过操纵单细胞研究受体结合位点和结合强度或测量细胞牵引力和粘附力，还可以研究马达蛋白，获得更加精密的信息，例如，分子马达步长、ATP酶动力学、阻力以及装载对分子马达生化性质和机械行为的影响，同时为核酸分子修饰和转录的研究提供了可能。

本文将重点阐述几种生物单分子力谱技术。首先对原子力显微镜(AFM)、光镊(OT)、磁镊(MT)这3种最常见的力谱技术进行介绍，然后描述3种可以进行大规模并行测量的力谱技术：声力谱(AFS)，离心力显微镜(CFM)以及力诱导剩磁谱(FIRMS)技术。

AFM是在扫描隧道显微镜(STM)的基础上发展而来的，主要是通过量子隧道效应而得到10^-10m级分辨率的非导体表面成像图，最早用于材料形貌的表征。随着AFM的普及和发展，AFM不仅可以用于成像，还可以在单分子水平上操纵分子，测量分子间相互作用力，分辨率在pN量级。

AFM在单分子水平上测量力的基本原理是，将目标分子通过化学反应或物理吸附分别固定在基底和针尖上，通过针尖相对基底在竖直方向运动，系统记录针尖靠近基底(图 1，1～3) 和从基底回退过程(图 1，4～6) 中微悬臂弯曲方向和弯曲程度的变化。根据Hooke定律F=kx，计算出针尖与基底分子间相互作用力的大小，得到力谱测量过程中的力-距离曲线。

AFM单分子力测定技术可以测得pN量级微弱的相互作用力^[4]，是研究生物分子相互作用，包括蛋白与蛋白^[5]、蛋白与DNA^[6]、细胞与细胞^{[7, 8]}、蛋白解折叠^[9]等的有力工具。

研究发现，当力作用于1个或多个蛋白分子时，蛋白-蛋白间亲和力可能下降或者蛋白-蛋白间可能形成新的结合位点。Lu等^[10]使用AFM研究钙离子与凝溶胶蛋白第六结合域(G6) 的亲和力的变化。当受到外界机械力时，Ca²⁺与G6的亲和力会改变，表明阳离子与蛋白结合亲和力是与力相关的，由此可以研究在受压细胞环境内部阳离子介导蛋白的一些复杂行为。

Kim等^[11]基于AFM进行DNA测序(图 2)。首先将DNA聚合酶修饰在探针上，聚合酶与待测DNA链接，待测碱基位于聚合酶活性位点上，然后将4类核苷酸(dATP，dTTP，dGTP，dCTP)分别固定在不同区域的玻璃表面上，探针靠近核苷酸，测量聚合酶与碱基的相互作用。当碱基与聚合酶活性位点上碱基互补配对时，形成三配合复杂结构，探针回退过程中会产生键断裂。根据力-拉伸曲线判定碱基种类，依次循环，检测DNA的碱基序列。

AFM应用范围广，不仅适用于各种研究对象，而且在大气、真空、液体条件下均可操作，无需放射标记，修饰过程简单，普及率广。近年来AFM发展迅猛，一方面快速获取数据，实时记录分子动态，性能更加高效；另一方面可与其他单分子技术相结合，譬如，AFM与全内反射荧光显微镜技术的结合^[12]。

OT，又称光阱，是最常见的单分子操纵技术之一。它通常使用高孔径显微镜物镜，通过激光聚焦至衍射极限光点产生光阱势。焦点附近绝缘微粒受到指向焦点方向的光学梯度力，从而通过光学梯度力操纵微粒分子^[13]。对于尺寸在20nm到几μm范围内的微粒，例如，蛋白分子、单个细胞、硅胶微球或者聚苯乙烯微球，OT都可以稳定捕获到^[14]。OT可以对微粒施加超过100pN的力，在10^-8m级精度下测量微粒的三维位移，时间分辨率为10^-4s^[15]。

在OT的应用中，通过在微粒与固定物体间施加特异性作用力，测定由相互作用力引起的力与位移。例如，最典型的应用是在单分子水平上观察驱动蛋白沿微管的运动(图 3a)^[16～18]。OT可以直接检测马达分子的速度、力学、步长和行进移动距离，也可以作为力与位移传感器，研究DNA转录过程中RNA聚合酶产生的力与位移^{[19, 20]}(图 3b)。把RNA聚合酶修饰在光珠上，待转录的DNA一端固定于基底，一端与聚合酶结合。在DNA转录过程中产生力，导致光珠运动，通过观测OT中光珠的运动情况，揭示DNA转录的精密过程。

由于激光可以穿透局部生物组织，OT具有进行无创伤捕获和操纵活体动物细胞的优势。Zhong等^[21]使用近红外OT捕获和操纵阻塞小鼠皮下毛细血管的血红细胞，实现了流体细胞的非接触式微操纵，恢复血管内血液流通。由此表明，OT在生命科学研究领域包括细胞迁移、细胞筛选以及靶向给药过程方面具有巨大应用潜力。

近年来，OT技术快速发展，应用更加广泛^[22]。Koirala等^[23]采用双光阱研究端粒G-四链体与小分子结合后的折叠稳定性。在端粒延伸机制中G-四链体的动态结构尤为重要，获得G-四链体的形成机制可以为药物测试和设计提供新的方法，而能够增强端粒DNA G-四链体稳定性的小分子有望在癌症治疗上得到相关应用^[24]。Lee等^{[25, 26]}使用OT与单分子三色荧光能量共振转移(FRET)技术，观察霍力迪交叉结构在作用力下三螺旋臂的运动以及两个相同长度的DNA发夹结构独立解折叠动力学。

OT应用广泛，测量精确，具有很多优势，但是也存在一些需要改进的地方。由于光场梯度决定势阱刚度，影响强度或者强度分布的光学扰动会降低OT性能。OT缺乏选择性和排它性，任何靠近捕获激光焦点的电介质颗粒都会被捕获，大大影响测量精度。激光焦点的光强度高，通常为10⁹～10¹²W/cm，常常引起局部加热进而影响酶活性，改变局部介质的粘附性能。

MT的原理是通过外加磁场操纵可磁化微粒进而操纵与微粒连接的生物分子。从结构上来说，MT主要包括3部分：超顺磁球、磁场以及显微装置(图 4)。MT可以操纵和旋转0.5~5 μm大小的磁球，施加大于1 nN的力。MT常用来研究核酸酶，特别是DNA拓扑异构酶和分子马达F₀F₁ATP酶，用来测量DNA的弹性^{[27, 28]}、蛋白质的折叠动力学^[29]以及研究DNA与蛋白质相互作用^[30]，例如，DNA拓扑异构酶^[31]、RNA/DNA聚合酶^{[32, 33]}、位移酶^[34]等。

近年来，MT技术不断发展，磁球操纵技术经历了从一维到二维再到三维的过程。最初研究者在测量肌动蛋白的粘弹性实验中实现了将磁珠运动方向固定在X方向，随后在研究肌动蛋白的基础上制作了能够简单精确控制磁球二维运动和旋转的微操纵装置。之后，基于衍射的方法对磁球进行空间位置定位，通过对磁球运动反馈调节，搭建三维操纵磁球的MT装置。磁场的采用也经历了从永磁铁到电磁铁的变化，最初利用两块可移动永磁铁使磁球产生侧向的感应磁场力拉伸DNA分子，随后更多的是利用加软铁芯的电磁铁研究F肌动蛋白的力学性质和活体细胞骨架。电磁铁显著优势是可以更简单地控制所需的磁场强度和梯度。

Li等^[35]使用MT研究端粒G-四链体结构的折叠动力学，通过精确调节施加在G-四链体上的拉力，在26～39 pN之间可以观察G-四链体与G-三链体之间的可逆转化过程，从而证明G-四链体结构在解折叠过程中需经过G-三链体中间过渡态。同样地，MT还被用来研究原癌基因c-MYC启动区序列的G-四链体的稳定性和折叠动力学，这有助于从单分子水平上了解癌症发生的相关机制^[36]。DNA折纸技术依赖于热或者化学退火的方法，Bae等^[37]通过使用MT，在不经过热退火过程下研究DNA折纸结构的折叠原理。通过拉力拉伸单个脚手架DNA，消除因碱基配对产生的次级结构，然后订书针DNA链与脚手架DNA碱基互补配对。随着力逐渐改变至消失，通过订书针DNA固定链之间改变位置，最终完成DNA纳米结构折叠。所以，通过MT技术可以得到一种DNA纳米结构折叠的可编程办法。Selvam等^[38]利用OT纳米级的分辨率和MT易操作的优势，把两种技术相结合来定量测定基因启动区DNA超螺旋结构和G-四链体两种拓扑结构的拓扑耦合(图 5)。这种高分辨OT-MT技术有望在研究生物大分子拓扑结构与活性关系方面得到广泛应用。

相对于OT、AFM等生物力谱技术，MT不会对样品造成光损伤，对样品和显微室的制备要求不高，可以在复杂多元生物体系，例如，在细胞内部或者复杂生物分子网络内非侵入性测量力与位移。此外，通过磁场施加作用力，MT有望进行大规模并行测量^[39]。

AFS利用声力可以同时拉伸多个分子，是最近提出的一种单分子操纵技术^[40]。在AFS中，使用振荡电压驱动压电元件，在流通池上方共振产生平面声驻波，进而微球受到沿驻波垂直方向(z轴)的力F(式(1) )。

$F=-V\nabla \frac{1-{{\kappa }^{*}}}{4}{{k}_{m}}{{P}^{2}}-\text{ }\frac{({{\rho }^{*}}-1)}{2{{\rho }^{*}}+1}\text{ }\rho m{{\nu }^{2}}$

(1)

其中，V是微球体积，P为声压，ν为声速，ρ^*，к^*分别为微粒与介质的密度比和压缩系数比。当聚苯乙烯或二氧化硅微球在水中时，方形声压梯度产生主导力，驱动微球朝向声压节点。AFS可以操作控制的力可达到120pN，甚至更高。这些力足以使研究的分子产生构形变化，譬如，DNA的过拉伸、蛋白质解折叠。

AFS装置(图 6a)包括流通池、用于物体成像的倒置显微镜物镜(OL)、数码相机、LED光源和50/50分光镜(BS)。流通池由2块玻璃片和流体腔组成，产生声波的压电元件与上方玻璃片连接。喷涂了铝层的镜片，用于照明。生物分子(例如DNA)一端与玻璃片连接，一端与微球连接，在声力作用下拉伸。使用一维模型计算流体腔的共振频率和配置力，当驱动压电元件频率为6.8MHz时，在上方玻璃-水界面附近产生使微球脱离表面的强推力；当频率为9.2MHz时产生使微球朝向表面的力。通过分析物镜与数码相机获得的图片来定位微球位置，在x和y轴向上可以精确到2nm，在z轴向精确到5nm。通过固定在表面的参照微球矫正由于力引起的漂移(图 6b为微球的衍射图，依此定位微球位置，图 6c所示为不同频率下的能量)。

AFS是一种精确的单分子力谱测量技术，可以通过力-拉伸测量、恒力以及动力学力谱测量来研究DNA与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间的相互作用。例如，使用AFS装置拉伸双链DNA，测量DNA的张力。AFS可以研究蛋白质与DNA的不同结合方式对DNA力学性质的影响。AFS不仅测量的动力范围大，而且可以同时进行大规模测量，装置相对简单，成本低。AFS的应用有望从专业实验室的基础研究拓展到分子生物学、医疗诊断等更加广阔的领域。

CFM^[41]的基本概念是，通过离心力场对大量研究对象施加作用力，同时采用高速旋转的高分辨率检测系统观测微粒毫米至纳米量级的运动情况。由公式F=mrω²计算施加在分子上的作用力，对于已知尺寸和密度的单分散微粒，每个微粒受到大小相同的离心力。

CFM主要配置有用来对微球施加作用力的微型显微镜旋转平台、用来区分微球的与玻片上分子连接、直接粘附在玻片上、未与玻片连接这3种不同状态的光学显微镜传输成像系统、以及CCD、LED和压电转换器组成的动态读数和控制系统(图 7)

使用CFM可以对成千上万的单分子并行测量，成本低、操作简单、高度稳定、动态可控。与OT和MT结合极性和磁矩不同，CFM耦合的是微球的质量密度，这样不仅避免了光损伤，而且任何材质的微球都可以使用，扩大了力谱研究体系。通过改变微球大小、材料和旋转速度，CFM可以测量10^-14N级至mN级范围内的力。CFM最大的优势是可以大规模并行测量，极大提高了实验效率。此外，CFM非常通用，可以与许多显微镜技术结合以满足特殊实验需求。

FIRMS技术采用超高灵敏度的磁力仪直接探测磁性颗粒物，通过磁标记的形式研究生物大分子间相互作用机理^[42]。光学原子磁力仪基于磁光效应原理^[43]。当线偏振光通过处于特定外磁场的原子介质后由于原子对线偏振光中左右圆偏振成分不同的吸收和色散，导致光的偏振方向产生与磁场相关的转动。基于磁场的超灵敏探测，利用扫描磁成像的方法(图 8a)，可以通过磁场强度分布的数据反演拟合颗粒物成像信息，同时还能够得到定量信息(公式(2) )^{[44, 45]}

$B\left( m,\text{ }r \right)=\frac{{{\mu }_{0}}}{4\pi {{r}^{3}}}\left( 3\hat{r}\left( m\cdot \hat{r} \right)-m \right)$

(2)

FIRMS技术的基本原理如图 8b。首先将目标分子固定在玻璃基底上，待测分子修饰在磁性颗粒物上。孵育一定时间后，磁球通过物理吸附或者化学吸附连接在玻璃基底上。在磁化后获得初始信号，然后逐步施加微扰力f₁，通过物理吸附的磁球与玻璃基底发生脱附。由于布朗弛豫效应，磁信号降低。当进一步施加微扰力f₂(f₂>f₁)，通过化学吸附的磁球与玻璃基底发生脱附，同样由于布朗弛豫效应，磁信号进一步发生改变。于是，通过微扰力f₂可以测量化学吸附作用力的大小。采用这种方法能够分析细胞表面的特异性吸附、抗体-抗原分子间的相互作用力^[46]、研究蛋白质合成过程中马达蛋白的分子作用机制^[47]。通过FIRMS技术，测量DNA双链分子间的作用力，分辨率可以达到2pN^[48]，而使用AFM同等测量下，分辨率仅达到5pN。

FIRMS技术的优势在于可以同时测量大量单分子事件，克服单一事件的随机性，实验可靠性和重现性大大提高，同时磁颗粒物探针不受外界环境光线的干扰，产生的磁信号非常稳定，可以进行非接触式远距离检测，增加了方法的适用性，在生物和医学领域展现巨大的应用前景。

在过去的近30年里，单分子力谱技术飞速发展，不断革新，为生物大分子研究提供了新的方法，广泛用于研究蛋白、DNA/RNA、细胞等。单分子技术朝着快速高效的方向发展，并与其他技术，特别是单分子荧光技术，相结合。随着所处理问题复杂性增大，这种多技术联合的方法将会越来越重要。另一方面，随着科学研究任务的深入，每次仅测量单个分子已经不能满足需要，能够进行大规模并行单分子测量的技术显得尤为重要。随着生命科学领域单分子研究的不断深入和单分子力谱技术的不断改进和完善，单分子力谱技术在生命科学研究中的应用将更为广泛。