化学通报   2016, Vol. 79 Issue (1): 66-70   PDF    
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  • 2015-07-29 接受
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    闫长领
    张春朵
    樊宏哲
    陈玉娟
    李金
    刘珣
    王公轲
    盐酸环丙沙星分子印迹电化学传感器
    闫长领1, 张春朵1, 樊宏哲2, 陈玉娟1, 李金1, 刘珣1, 王公轲1    
    1 河南师范大学化学与化工学院 新乡 453007;
    2 新乡医学院第三附属医院心胸外科 新乡 453000
    2015-03-09 收稿, 2015-07-29 接受
    基金项目: 国家自然科学基金项目（21303044，21173071，21303043）和高等学校重点科研项目（15A150058）资助
    作者简介: 闫长领,男,50岁,副教授,主要从事电化学和溶液化学研究。E-mail:yanchangling@163.com
    摘要： 本文将电化学合成与分子印迹技术相结合，采用循环伏安法在石墨电极表面，形成盐酸环丙沙星（CPX）分子印迹聚吡咯薄膜，制备了CPX分子印迹传感器。实验对传感器的制备条件进行了优化，用铁氰化钾作为活性电子探针，采用方波伏安法研究了传感器性能。结果表明，在1×10-8～1×10-4 mol/L范围内，峰电流与CPX浓度负对数呈良好的线性关系，检出限（S/N=3）为3.5×10-9 mol/L。传感器对模板分子CPX选择性强，重现性和稳定性好，置于室温下15d峰电流强度无明显变化。
    关键词： 分子印迹     盐酸环丙沙星     吡咯     电化学传感器    
    Molecularly Imprinted Electrochemical Sensor for Ciprofloxacin hydrochloride
    Yan Changling1, Zhang Chunduo1, Fan Hongzhe2, Chen Yujuan1, Li Jin1, Liu Xun1, Wang Gongke1     
    1 School of Chemistry and Chemical Engineering, Henan Normal University, Xinxiang 453007;
    2 The Third affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453000
    Abstract: Molecular imprinting technique was used to prepare electrochemical sensor for ciprofloxacin hydrochloride (CPX) by electrochemical polymerization on the surface of graphite electrode using pyrrole as functional monomer. The effect of preparation conditions on sensor was investigated and the performances of the sensor were measured by square wave voltammetry (SWV) with ferricyanide as an electrochemical probe. The results showed that the peak current was linear to the negative logarithm of CPX concentration in the range from 1.0×10-8 to 1.0×10-4 mol/L with a detection limits (S/N=3) of 3.5×10-9 mol/L. The sensor has good selectivity, reproducibility and stability for template CPX and the peak current of the sensor did not clearly change after stored for 15 days.
    Key words: Molecular imprinting     Ciprofloxacin hydrochloride     Pyrrole     Electrochemical sensors    

    盐酸环丙沙星(CPX) 属于人工合成的氟喹诺酮类新型广谱高效抗菌药物，该类药物有抗菌谱广、抗菌活性高和生物利用率高等特点，被广泛用于生物体内很多感染性疾病的治疗[1]。但是，近年来此类药物的长期使用和滥用,造成在生物体内的残留导致食源疾病的发生[2]。目前常用检测CPX的方法有高效液相色谱法(HPLC)[3, 4]、微生物法、免疫学法、毛细管电泳法等，然而这些方法所用仪器和试剂昂贵，样品处理麻烦，检测周期较长，不能满足大规模实际检测的需要[5～10]。因此，研发操作简便、成本低廉、结果可靠的CPX检测方法显得尤为必要。

    分子印迹是通过在聚合物中形成与模板分子具有相互匹配的空间识别位点从而获得对目标分子具有高度亲和性和选择性聚合物的技术。分子印迹聚合物具有抗恶劣环境能力强、重复使用、稳定性好等优点，在传感器技术、环境检测、医药领域等方面展现出良好的应用前景[11～21]。本实验利用分子印迹技术，以吡咯为单体，CPX为模板分子，采用循环伏安(CV) 法在石墨电极表面合成聚吡咯薄膜，制备CPX分子印迹传感器，以铁氰化钾为活性分子探针，对传感器性能进行了测试。

    1 实验部分
    1.1 仪器与试剂

    CH1660D型电化学工作站(北京华科普天科技责任有限公司)；三电极系统：以232型饱和甘汞电极(SCE) 为参比电极、213型铂电极为对电极、自制石墨电极为工作电极；KQ-100B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；pH计(上海精密仪器科技有限公司)。

    吡咯(阿拉丁试剂)，使用前通过减压蒸馏纯化；CPX(C17H18FN3O3·HCl 98%，阿拉丁试剂)；铁氰化钾(AR，北京化工厂)；其余试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

    1.2 电极的处理

    将2B铅笔芯剥出，套上绝缘套，预留3mm长作为工作区。用金相砂纸打磨抛光后，依次用2mol/L的硫酸、6mol/L的盐酸、4mol/L的硝酸浸泡5min，然后用二次蒸馏水清洗干净，自然晾干。使用前，在1mol/L的硫酸溶液中，用方波伏安法在-1.8～0.5 V电压范围内扫描10次激活，再用二次蒸馏水冲洗干净。

    1.3 印迹膜电极的制备及洗脱

    图 1为印迹电极的制备过程示意图。以CPX为模板分子、吡咯为单体，用CV法在石墨电极表面制备分子印迹聚合膜(MIP)。将三电极体系置于含有0.01mol/L吡咯、0.005mol/L CPX和不同pH的0.05mol/L醋酸缓冲溶液中，CV扫描范围是-0.1～1.2 V，扫描速度是50mV/s。非印迹聚合膜(NIP) 在同样的实验条件下制备，只是溶液中不加入模板。

    图 1 CPX分子印迹传感器制备示意图 Fig. 1 The simplified sketch for the fabrication process of CPX molecularly imprinted sensor

    聚合完成后,取出印迹电极先用乙醇-水(3∶1,V/V) 洗脱液冲洗5min[22]，除去未聚合的单体及表面物理吸附的模板，然后用1mol/L的NaOH的乙醇-水(3∶1,V/V) 混合液作为洗脱液，充分浸洗印迹膜以除去聚合物中的模板，用二次蒸馏水冲洗干净，自然晾干，得到CPX分子印迹传感器。

    1.4 检测方法

    在室温条件下，将印迹传感器置于一定浓度的CPX溶液中，再放入1.0mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.1mol/L KCl的探针溶液，采用方波伏安(SWV) 法在三电极体系中进行测试。测试条件为：电位范围-0.1～0.6 V，电位增量5mV/s，方波振幅50mV，方波频率20Hz。检测前电极在测试液中浸泡10min，使CPX与印迹位点充分作用。测试后先用洗脱液浸洗，再用乙醇-水(3∶1，V/V) 浸洗5min，二次水冲洗后用于下次测定。

    2 结果与讨论
    2.1 分子印迹膜的导电特性

    将在pH=5.2、扫描圈数为20、扫速为50mV/s、洗脱时间为3h(其他条件如实验部分所述) 等条件下制备的印迹电极和裸电极，于探针溶液中进行测试，图 2为各种电极的SWV曲线。由图可以看出，未洗去模板的印迹电极(图 2c) 基本不导电，说明电极表面生成了几乎不导电的聚合物膜，这与聚合过程的CV图结果(图 3) 一致，图 3中a为电聚合的第一圈扫描，b表示其他扫描圈数。由于在聚合过程中形成了一层不导电的聚合物膜，所以随着圈数的增加，电流强度越来越低。而裸电极有较大的峰电流(图 2a)，除去模板的印迹电极峰电流(图 2b) 低于裸电极，但高于未除去模板的印迹电极。铁氰化钾在非印迹电极上的电流响应较小(图 2d)。实验表明，在弱酸性聚合条件下聚吡咯形成带有正电荷的主链[23, 24]，CPX分子与聚吡咯主链之间可以通过静电作用、氢键及弱的疏水作用相结合，CPX分子的存在堵塞了聚合物中的离子运动通道，阻碍了活性探针K3[Fe(CN)6]向电极表面的扩散，导致印迹电极无法导电。当模板分子洗脱后，在聚合物膜中留下与CPX分子相匹配的印迹空穴，带负电的[Fe(CN)6]3-离子可以通过空穴形成的通道到达电极表面，发生氧化还原反应产生响应电流；而非印迹聚合物膜内没有形成有效结合位点，K3[Fe(CN)6]不能达到电极表面，产生相应的响应。

    图 2 不同电极的方波伏安图 Fig. 2 SWV curves of different electrodes

    图 3 电聚合循环伏安图 Fig. 3 The cyclic voltammetry curves of electropolymerization

    2.2 聚合条件的优化
    2.2.1 聚合时间的优化

    聚合时间短则聚合膜太薄，所形成的印迹分子空穴少；而聚合时间过长形成的膜太厚，膜内的模板分子不易洗脱，不能形成达电极表面的通道，影响对目标分子的检测。为此，在其他条件不变的情况下，通过改变CV扫描圈数，制备聚合膜厚度不同的印迹电极。用探针溶液对印迹传感器进行测试，结果如图 4所示。可以看出当扫描15圈时，印迹传感器具有最大峰电流，说明此时膜厚度较适宜，既便于模板分子的洗脱，又可以形成较多的印迹空穴。因此，本实验选择扫描15圈制备印迹传感器。

    图 4 聚合时间的优化 Fig. 4 Optimization of polymerization time

    2.2.2 pH的优化

    改变醋酸缓冲溶液的pH，使电化学聚合在不同pH条件进行，印迹传感器于探针溶液中的测试结果如图 5所示。由图可知，当pH=5.2时，SWV曲线的峰电流最大。CPX的等电点约为6.70，当溶液pH由4.8逐渐增大到5.2时，其阴离子形式所占比例逐渐增加，这有利于其与带有正电荷的聚吡咯主链结合，从而在聚吡咯中形成较多的印迹位点，因此响应电流随pH的增大而增大；但在pH接近等电点时会使CPX的溶解度急剧减小，导致当pH大于5.4以后在聚吡咯中形成的印迹位点减少，响应电流逐渐降低。当pH约为5.2时，既可以使CPX有一定的溶解度又有利于其与带正电的聚吡咯主链结合，能够形成较多的印迹位点，有利于[Fe(CN)6]3-达到电极表面发生氧化-还原反应，产生较大的峰电流。

    图 5 pH的优化 Fig. 5 Optimization of pH

    2.2.3 洗脱时间的确定

    分子印迹传感器的洗脱是印迹位点形成的关键，本实验采用含有1mol/L NaOH的乙醇-水(3∶1,V/V) 洗脱液除去模板。电聚合完成后，首先用体积比为3∶1的乙醇和水的混合液冲洗，除去表面没有聚合的功能单体和模板分子；然后用洗脱液浸洗，考察不同浸洗时间的洗脱效果。浸洗5h以后，峰电流不再变化，表明此时CPX分子已基本洗脱，有效印迹位点数达到最多。

    2.2.4 CPX浓度的优化

    合适的CPX浓度可以形成较多的结合位点，使传感器有良好的性能。实验对聚合液中模板分子的浓度进行了优化，配制聚合液中CPX的浓度分别为0.00125、0.0025、0.005、0.01、0.02 mol/L，在其他条件相同的情况下，制备不同的印迹电极，测定印迹电极的响应峰电流。由图 6可以看出，当CPX浓度为0.005mol/L时，印迹电极的峰电流最大。这是由于模板分子过少时，单体直接发生聚合反应形成聚合膜，这时形成有效印迹位点的数量比较少；当模板分子太多，模板分子会阻碍印迹聚合膜的形成，形成的膜粗糙，且印迹位点不稳定[25]。因此，本实验制备液中模板分子的浓度为0.005mol/L。

    图 6 CPX浓度的优化 Fig. 6 Optimization of CPX concentration

    2.3 吸附平衡时间

    将优化条件下制备的印迹传感器浸洗5h洗脱模板后,于1.0×10-3mol/L的CPX溶液中浸泡不同时间，然后于测试溶液中对传感器进行测试。吸附8min后峰电流不再减小，表明此时已达吸附平衡，CPX分子占据了绝大多数印迹空穴，堵塞了印迹膜中探针离子迁移的通道，响应电流达到最小。实验中为确保达到吸附平衡，选择吸附时间10min以上。

    2.4 传感器的性能指标
    2.4.1 线性范围、使用寿命

    用优化条件下制备的印迹传感器，对不同浓度的CPX进行测定。测试前印迹传感器在测试液中浸泡10min以上，使CPX与印迹位点充分作用。图 7为传感器SWV峰电流与CPX浓度负对数的关系曲线，插图为SWV测试结果。由图 7可以看出在1×10-4～1×10-8mol/L 范围内峰电流与CPX深度呈良好的线性关系(R=0.9963)，最低检测限(S/N=3) 为3.5×10-9mol/L。

    图 7 方波伏安峰电流与CPX浓度负对数的关系曲线(插图为传感器在不同浓度CPX溶液中的方波伏安曲线) Fig. 7 Dependence of the SWV peak current on the negative logarithm of CPX concentration (Inset: SWV curves of the sensor in the solutions of different CPX concentrations) a~i : 1×10-8,5×10-8,1×10-7,5×10-7,1×10-6,5×10-6,1×10-5,5×10-5 and 1×10-4 mol/L

    采用连续再生法评估传感器寿命，即每次检测后进行洗脱、晾干再进行下次测试。从连续30次的测试结果可以看出，30次测试的峰电流基本不变。另外，将该电极于室温、大气环境下保存，15d内每隔两天对传感器进行一次测试。结果表明，15d后传感器响应电流仍保留其初始值的99%以上。上述结果表明，该分子印迹传感器能够连续多次使用、稳定性好、使用寿命较长。

    2.4.2 准确度和精密度

    以K3[Fe(CN)6] 溶液为分子探针，测定印迹传感器在1×10-5 mol/L CPX溶液中的SWV曲线，利用线性回归方程计算测试浓度，结果如表 1 所示。分子印迹电极传感器对模板分子测量的相对误差为2.35%，相对标准偏差为2.61%，证明传感器具有较高的准确度和精密度。

    表 1 检测CPX重复实验数 Table 1 CPX repeated testing experiment data

    2.4.3 样品分析

    于市场上购买天方牌(河南天方药业有限公司)、嘉健牌(河南中杰药业有限公司)、白云山牌(白云山制药股份有限公司)3种CPX片，各取2片、研磨，称取一定量配置成0.01mol/L的储备液。取上清液，然后稀释成所1×10-6mol/L浓度的检测液，用优化条件下制备的传感器进行检测，采用线性回归方程计算检测液中CPX含量，每个样品平行测定3次，结果列于表 2中。其标准偏差分别为2.0%、1.2%、2.0%，表明该方法可用于实际样品测定。

    表 2 药物中盐酸环丙沙星的测定结果 Table 2 Determination results of Ciprofloxacin hydrochloride in tablets (n=3)

    2.4.4 印迹传感器的选择性

    为了验证印迹传感器(MIP/GE) 和非印迹传感器(NIP/GE) 对CPX的特异识别能力，选择在生物体中常见且具有抗菌性的药物：四环素(TCH)、氯霉素(CM) 和具有类似结构的恩诺沙星(EF) 进行试验。将上述3种抗菌性药物和CPX分别配制成浓度为1×10-5mol/L的溶液，以铁氰化钾为探针，分别用印迹电极和非印迹电极采用SWV法进行测量。各样品响应电流与空白测试液响应电流的差值(ΔI) 如图 8。从图中可以看出，MIP/GE对四环素、氯霉素的响应电流ΔI很小，说明这两种分子构象与印迹空穴不匹配，与印迹空穴作用很弱，只有少量印迹空穴被占据；恩诺沙星的ΔI稍大，这是因为恩诺沙星与CPX具有类似结构；模板分子CPX的ΔI最大，约为恩诺沙星的4倍，说明MIP/GE对模板分子特异识别能力最强，具有良好的选择性；而NIP/GE对4种物质的响应电流都很小，差别不大，说明了NIP/GE对CPX没有选择特异性。

    图 8 印迹传感器对模板分子的选择性识别 Fig. 8 Selective recognition of the imprinting sensor for the template molecules

    3 结论

    采用分子印迹技术，以吡咯为单体，CPX分子为模板，通过电化学聚合方法制备了分子印迹传感器，并以铁氰化钾为分子探针，利用方波伏安法对传感器性能进行了测试。结果表明，在优化条件下，传感器的线性范围为1×10-8～1×10-4mol/L，相关系数为0.9963，最低检测限为3.5×10-9mol/L，样品实测相对标准偏差为1.2%～2.0%。该传感器具有制作简单，选择性、稳定性和再生性能好等特点，对实际样品中CPX的检测具有较好的应用前景。

    参考文献
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