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• 人类健康问题与体内金属离子含量有着密不可分的联系。锌是除铁之外人体内含量第二多的元素^{[1, 2]}，Zn²⁺能调节基因表达，参与细胞凋亡，同时也是RNA和DNA聚合酶的组成部分^{[3, 4]}。Zn²⁺在基因转录、DNA合成、金属酶调节、神经信号传递和细胞新陈代谢等多种生物过程中起着重要作用^[5~7]，是人体中不可缺少的重要元素。近年来，由于含锌污染物过量排放，对环境危害越来越大，对人类健康也造成巨大威胁。人体内积累较高浓度的Zn²⁺会引起阿尔茨海默症、帕金森病、糖尿病、免疫系统受损、婴儿腹泻等^[8~11]。因此，Zn²⁺检测备受人们的关注。在众多检测方法中，荧光法由于操作简便，可实时监测受到人们的青睐。近期，基于水杨醛^[12]、喹啉^[13]、芘^[14]、香豆素^{[15, 16]}、萘二甲酰亚胺^[17~19]、荧光素^[20]、若丹明^[21]、氟硼荧染料^[22]和卟啉^[23~25]等荧光团作为荧光传导信号检测Zn²⁺已有大量报道。其中多数荧光探针具有良好的选择性和较高的灵敏度，也可应用于生物体系进行荧光成像^[26]。但是，部分探针分子仍然存在合成路线较长、识别位点不明、只能在纯溶剂中检测等缺点，限制了这些荧光探针的进一步应用^[27~30]。因此，开发合成简单、经济实用的荧光探针分子仍然具有重要意义。

  本文利用2-氨基吡啶和4-N, N-二乙氨基水杨醛通过一步反应合成了一种席夫碱类荧光探针L(图式 1)，该探针对Zn²⁺具有专一的选择性和较高的灵敏度，合成方法简单，产率较高，成本较低，并且能在实际水样中检测Zn²⁺。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  探针L合成路线

  Scheme 1.  Synthesis route of probe L

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  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  400MHz核磁共振谱仪(美国Agilent公司)；970CRT荧光分光光度计(上海三科仪器有限公司)。本实验所用试剂均为市售分析纯级。2-氨基吡啶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，4-N, N-二乙氨基水杨醛(萨思化学技术(上海)有限公司)，石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷(自天津永大化学试剂有限公司)，二甲基亚砜(DMSO，天津市光复精细化工研究所)。柱色谱所用硅胶(100~200目)购自青岛裕名化工厂，实验用水为去离子水。

  1.2   化合物L的合成

  取250mL圆底烧瓶洗净烘干，加入1.933g(10.0mmol)4-N, N-二乙氨基水杨醛、0.943g(10.0mmol)2-氨基吡啶、40mL乙醇溶液和5滴乙酸，摇匀，充分溶解后搅拌回流6h。结束后旋蒸出乙醇，柱层析纯化(洗脱液：石油醚/乙酸乙酯体积比25:1)得到2.116g化合物L(产率78.6%)。熔点97.6~99.8℃，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：13.83(s，1H)，9.22(s，1H)，8.44(d，J=4.0Hz，1H)，7.82(td，J=8.0、1.6Hz，1H)，7.41(d，J=8.8Hz，1H)，7.26(d，J=8.0Hz，1H)，7.24~7.17(m，1H)，6.33(d，J=8.8Hz，1H)，6.06(d，J=1.6Hz，1H)，3.40(q，J=7.0Hz，4H)，1.12(t，J=7.0Hz，6H)。¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：165.17，161.97，157.99，152.73，149.16，139.15，135.70，121.62，118.88，108.78，104.89，97.13，44.43，13.01。

  1.3   溶液配制

  1.3.1   Tris-HCl缓冲溶液

  称取0.605g三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，放入500mL烧杯中，用少量的去离子水溶解后，然后用10%的盐酸调节pH为7.4，最后定容到500mL容量瓶中，即得到1×10^-2mol/L Tris-HCl缓冲溶液。

  1.3.2   探针L标准溶液

  称取6.7mg探针L用DMSO溶解后转入25mL容量瓶中，定容至刻度线，摇匀，得到1×10^-3 mol/L溶液，再用移液器吸取1mL置于100mL容量瓶中，用DMSO:Tris=6:4(体积比，下同)溶液定容至刻度线，摇匀，配制成1×10^-5mol/L探针L溶液。

  1.3.3   各种金属离子溶液

  以Zn²⁺为例：准确称量68.15mg氯化锌，用去离子水溶解后转入10mL容量瓶中，再用去离子水标定至刻度线，摇匀，配成5×10^-2mol/L溶液。其他阳离子(Hg²⁺、Pb²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ag⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、K⁺、Cr³⁺)一般用硝酸盐或氯化物配制，均配成5×10^-2mol/L的溶液。

  1.4   光谱测定

  1.4.1   探针L对各金属离子的选择性实验

  用5mL移液器取2mL 1×10^-5mol/L的探针L溶液分别加入19个离心管中，再依次加入20μL浓度为5×10^-2mol/L的Zn²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ag⁺、Al³⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe³⁺、Cr³⁺等18种离子的溶液(剩余一个离心管作为空白)，摇匀。用荧光分光光度计记录其荧光光谱变化(灵敏度为2，E_x缝宽为5nm，E_m缝宽为30nm)。

  1.4.2   探针L对Zn²⁺的荧光滴定实验

  将Zn²⁺配制成浓度为0.5~50×10^-3 mol/L的溶液。根据Zn²⁺是探针L的0~50倍计算，加入不同体积的金属离子溶液，配制成不同浓度的样品，摇匀，记录荧光光谱变化。

  1.4.3   探针L对金属离子的抗干扰实验

  以Cu²⁺为例，用移液器量取20μL 5×10^-2mol/L的Cu²⁺溶液加入到2mL 1×10^-5mol/L探针L的溶液中，再加入20μL Zn²⁺溶液摇匀，静置片刻，记录其荧光光谱变化。其他金属离子均与此相同。

  1.4.4   pH对探针L荧光光谱影响实验

  分别用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节DMSO:Tris=6:4溶液的pH依次为2，3，4，5，…，12，13，用移液器分别取2mL加入到24个离心管中(分成两组)，然后量取20μL 5×10^-2mol/L的Zn²⁺加入其中一组，再量取1×10^-5mol/L的探针L溶液20μL加入两组中，摇匀。用荧光分光光度计记录荧光光谱变化。

  2.   结果与讨论

  2.1   化合物L的合成与表征

  用2-氨基吡啶和4-N，N-二乙氨基水杨醛通过一步反应即可合成探针L，合成简单，产率较高。从图 1的¹H NMR谱可看出，δ 13.83处是羟基上的氢的化学位移峰，δ 9.22处为碳氮双键上的氢的化学位移峰，δ 8.44处是吡啶环上N原子邻位上的氢的化学位移峰，δ 7.82、7.26、6.06处分别为羟基对位、间位、邻位上的氢的化学位移峰，δ 7.41、7.20、6.33处为吡啶环上其余的氢的化学位移峰，δ 3.40处为亚甲基上的氢的化学位移峰，δ 1.12处为甲基上的氢的峰。此外，由¹³C NMR可看出有14组峰(图 2)，与化合物L分子中的碳数相同，且化学位移值匹配，进一步证实成功合成了目标分子L。

  图 1

  

  图 1.  探针L的¹H NMR谱

  Figure 1.  ¹H NMR spectrum of probe L

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  图 2

  

  图 2.  探针L的¹³C NMR谱

  Figure 2.  ¹³C NMR spectrum of probe L

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  2.2   探针L对各种金属离子的选择性

  首先测试了探针L的荧光性质。探针L的DMSO/Tris(6:4，pH=7.4)缓冲溶液在384nm波长的光激发下，470nm处有微弱的荧光。向缓冲溶液中加入5×10^-4 mol/L Zn²⁺溶液后，470nm处荧光强度显著增强(增强15倍，图 3)，体系由无荧光变成蓝色强荧光(图 3内插图)。而向探针L溶液中分别加入其他阳离子，如Hg²⁺、Pb²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ag⁺、Al³⁺、Mg²⁺、K⁺、Fe³⁺、Cr³⁺等，荧光强度均无明显变化，这表明探针L对Zn²⁺有很高的选择性。

  图 3

  

  图 3.  探针L(1×10^-5mol/L)在DMSO/Tris(6:4，pH 7.4)溶液中加入各种阳离子后荧光光谱的变化(λ_ex=384nm)；内插图：在365nm紫外灯照射下，探针L及加Zn²⁺后的颜色变化

  Figure 3.  Fluorescence spectra of probe L(1×10^-5mol/L) in DMSO/Tris (6:4, pH7.4) buffer upon addition of various metal cations (λ_ex=384nm); Inset: The color changes of probe L without and with Zn²⁺ under a portable UV lamp at 365nm excitation

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  2.3   探针L对Zn²⁺的荧光滴定及检测限

  图 4是探针L的DMSO/Tris(6:4，pH=7.4)溶液荧光强度随Zn²⁺浓度变化情况。当加入不同浓度(0~50×10^-5 mol/L)的Zn²⁺时，探针L在470nm处的荧光强度随Zn²⁺浓度的增加而逐渐增强，当Zn²⁺浓度为5×10^-4mol/L时荧光强度达到最强，说明Zn²⁺浓度50倍达到饱和。同时，我们观察到Zn²⁺浓度在1.8~3.3×10^-4 mol/L范围内荧光强度与Zn²⁺浓度有很好的线性关系(图 5)，并计算得到斜率K。另外，测试了12个平行样的荧光强度，根据公式∑(Xi-X)²=(X₁-X)² + (X₂-X)² +……+ (Xn-X)²求出平方差的总和(X_i为每次测量探针本身荧光强度值，X为荧光强度平均值，n为测试次数，n大于等于11)，然后根据公式S=[∑(Xi-X)²/(n-1)]^0.5求出S，再根据检测限公式3S/K，求出检测限为9.39×10^-7mol/L。上述结果表明探针L可定量检测Zn²⁺，且具有较高的灵敏度。

  图 4

  

  图 4.  探针L的DMSO/Tris (6:4，pH 7.4)溶液中加入不同浓度(0~50×10^-5 mol/L)的Zn²⁺后L(1×10^-5mol/L)的荧光发射变化

  Figure 4.  Fluorescence emission change of L(1×10^-5mol/L) upon addition different amounts of Zn²⁺ (0~50×10^-5 mol/L) in DMSO/Tris (6:4, pH 7.4) buffer

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  图 5

  

  图 5.  L在DMSO/Tris (6:4，pH 7.4)缓冲液中的发射强度与Zn²⁺浓度的校准曲线

  Figure 5.  Standard calibration curve of the emission intensity of L against Zn²⁺ concentrations in DMSO/Tris (6:4, pH=7.4) buffer

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  2.4   pH对探针L识别Zn²⁺的影响

  为了验证探针L检测Zn²⁺的实用性，我们考察了pH对探针L识别Zn²⁺的影响。以pH为横坐标、荧光强度为纵坐标作图得到图 6可看出，在pH为2~13范围内，探针L均具有较弱的荧光强度，而在pH为7~11范围内，加入Zn²⁺后能引起荧光明显增强，表明探针L可在中性或弱碱条件下检测Zn²⁺，具有潜在的应用价值。

  图 6

  

  图 6.  L和L+Zn²⁺在不同pH下的荧光强度变化(λ_em=470 nm)

  Figure 6.  Fluorescence intensity changes of L and L+Zn²⁺ at the different pH (λ_em=470 nm)

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  2.5   探针L对Zn²⁺识别的抗干扰能力

  其他离子共存是否影响对Zn²⁺的识别，是探针L实际应用价值的重要参考。将探针L分别加入含其他金属离子的溶液来测定470nm处的荧光强度，结果如图 7所示，可看出只有Zn²⁺能引起L的荧光强度显著增强。再往各个含金属离子的L溶液中加入Zn²⁺时，可看出含Al³⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺的L溶液的荧光强度没有显著升高，说明这些离子共存时对探针L识别Zn²⁺有一定的干扰。

  图 7

  

  图 7.  在470nm处，探针L(1×10^-5mol/L)加入各种金属离子5×10^-4mol/L及继续加入5×10^-4mol/L的Zn²⁺后的荧光强度，激发波长为384nm

  Figure 7.  Fluorescence intensities of L (1×10^-5mol/L) in the presence of various metal ions (5×10^-4mol/L, black) and additional Zn²⁺ (5×10^-4mol/L, red). Intensity was recorded at 470 nm, excitation at 384 nm

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  2.6   探针L与Zn²⁺的结合模式

  为了测定探针L与Zn²⁺的化学计量比，进行了Job’s polt实验，结果如图 8所示。从图中可看出，荧光强度随L比例的增加先增强后降低，在摩尔数比为0.5时出现拐点，表明探针L与Zn²⁺形成的络合物是1:1结合的。此外，我们利用1:1的希尔方程进行线性拟合，得到拟合相关系数R²=0.99288，计算出探针L与Zn²⁺的结合常数为K_a=2.6×10³ L·mol^-1, 从而进一步证明探针L与Zn²⁺是1:1结合的。

  图 8

  

  图 8.  L与Zn²⁺的Job plot曲线，L和Zn²⁺的总浓度为5×10^-5mol/L

  Figure 8.  Job plot of L and Zn²⁺, the total concentration of L and Zn²⁺ is 5×10^-5 mol/L

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  为了确定探针L与Zn²⁺的结合模式，我们利用B3LYP/LANL2DZ混合泛函和6-311G基组函数对结合的稳定构型进行密度泛函理论计算^[31]，发现受体L中两个N原子和酚羟基的氧原子共同与1个Zn²⁺络合，形成稳定结构(图 9)，且所形成的结构中两个芳香环几乎在同一平面上。由此可知，受体L自身由于C＝N异构化导致激发态发生非辐射能量转移使荧光猝灭。与Zn²⁺结合后抑制了C＝N异构化，并使分子共平面，增加了分子刚性，从而使荧光显著增强^[32]。

  图 9

  

  图 9.  密度泛函理论计算得到L与Zn²⁺结合的最优结构

  Figure 9.  Calculated energy-minimized structure of L with Zn²⁺

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  2.7   探针L在水样中检测Zn²⁺

  为了开发探针L的潜在应用价值，考察了L在实际水样中检测Zn²⁺的可行性。取实验室的自来水、渤海大学听林湖水、锦州凌河区的小凌河水，分别用CH₂Cl₂萃取3次，水层煮沸15min后过滤^[33]。用上述水样配制1×10^-5mol/L的L的DMSO/H₂O溶液，在溶液中依次加入0~50×10^-5mol/L的Zn²⁺，放置30min后测试470nm处的荧光强度。如图 10所示，在5×10^-5~40×10^-5 mol/L范围内L溶液的荧光强度与Zn²⁺浓度成正比，良好的线性关系说明探针L可在5×10^-5~40×10^-5mol/L范围内定量检测Zn²⁺。

  图 10

  

  图 10.  三个水样中L的荧光强度与Zn²⁺浓度(5×10^-5~40 ×10^-5mol/L)的线性关系

  Figure 10.  Linear relation of fluorescence intensities of L (1×10^-5mol/L) upon addition of Zn²⁺ (5×10^-5~ 40 ×10^-5mol/L) in three natural water samples

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  3.   结论

  本文利用2--氨基吡啶与4-N, N-二乙氨基水杨醛一步合成荧光探针L。该探针在DMSO/Tris(6:4，1×10^-5mol/L，pH=7.4)溶液中于中性或弱碱性条件下可选择性识别Zn²⁺，检测限可达9.39×10^-7 mol/L，并可在实际水样中定量检测Zn²⁺。

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  Scheme 1  探针L合成路线

  Scheme 1  Synthesis route of probe L

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  图 1  探针L的¹H NMR谱

  Figure 1  ¹H NMR spectrum of probe L

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  图 2  探针L的¹³C NMR谱

  Figure 2  ¹³C NMR spectrum of probe L

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  图 3  探针L(1×10^-5mol/L)在DMSO/Tris(6:4，pH 7.4)溶液中加入各种阳离子后荧光光谱的变化(λ_ex=384nm)；内插图：在365nm紫外灯照射下，探针L及加Zn²⁺后的颜色变化

  Figure 3  Fluorescence spectra of probe L(1×10^-5mol/L) in DMSO/Tris (6:4, pH7.4) buffer upon addition of various metal cations (λ_ex=384nm); Inset: The color changes of probe L without and with Zn²⁺ under a portable UV lamp at 365nm excitation

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  图 4  探针L的DMSO/Tris (6:4，pH 7.4)溶液中加入不同浓度(0~50×10^-5 mol/L)的Zn²⁺后L(1×10^-5mol/L)的荧光发射变化

  Figure 4  Fluorescence emission change of L(1×10^-5mol/L) upon addition different amounts of Zn²⁺ (0~50×10^-5 mol/L) in DMSO/Tris (6:4, pH 7.4) buffer

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  图 5  L在DMSO/Tris (6:4，pH 7.4)缓冲液中的发射强度与Zn²⁺浓度的校准曲线

  Figure 5  Standard calibration curve of the emission intensity of L against Zn²⁺ concentrations in DMSO/Tris (6:4, pH=7.4) buffer

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  图 6  L和L+Zn²⁺在不同pH下的荧光强度变化(λ_em=470 nm)

  Figure 6  Fluorescence intensity changes of L and L+Zn²⁺ at the different pH (λ_em=470 nm)

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  图 7  在470nm处，探针L(1×10^-5mol/L)加入各种金属离子5×10^-4mol/L及继续加入5×10^-4mol/L的Zn²⁺后的荧光强度，激发波长为384nm

  Figure 7  Fluorescence intensities of L (1×10^-5mol/L) in the presence of various metal ions (5×10^-4mol/L, black) and additional Zn²⁺ (5×10^-4mol/L, red). Intensity was recorded at 470 nm, excitation at 384 nm

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  图 8  L与Zn²⁺的Job plot曲线，L和Zn²⁺的总浓度为5×10^-5mol/L

  Figure 8  Job plot of L and Zn²⁺, the total concentration of L and Zn²⁺ is 5×10^-5 mol/L

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  图 9  密度泛函理论计算得到L与Zn²⁺结合的最优结构

  Figure 9  Calculated energy-minimized structure of L with Zn²⁺

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  图 10  三个水样中L的荧光强度与Zn²⁺浓度(5×10^-5~40 ×10^-5mol/L)的线性关系

  Figure 10  Linear relation of fluorescence intensities of L (1×10^-5mol/L) upon addition of Zn²⁺ (5×10^-5~ 40 ×10^-5mol/L) in three natural water samples

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