基于浊点提取悬铃木球叶中黄酮化合物的研究

张泽志

引用本文: 张泽志. 基于浊点提取悬铃木球叶中黄酮化合物的研究[J]. 化学通报, 2019, 82(11): 1033-1037. shu
Citation:  Zhang Zezhi. Cloud Point Extraction of Flavones from Balls and Leaves of Platanus[J]. Chemistry, 2019, 82(11): 1033-1037. shu

基于浊点提取悬铃木球叶中黄酮化合物的研究

    作者简介: 张泽志, 男, 博士, 副教授, 主要从事绿色过程研究。E-mail:zhangzezhi@zzu.edu.cn;
  • 基金项目:

    河南省教育厅科学技术研究重点项目(13B150975)资助

摘要: 采用微波辅助浊点提取悬铃木球叶中的黄酮类化合物。在单因素试验的基础上,以0.6%吐温-80的乙醇溶液作为浊点萃取剂,通过响应面法确立悬铃木黄酮类化合物的优化提取工艺条件为:微波功率410W、提取时间7min、液料比49:1 mL/g,实际测得黄酮平均得率1.480mg/g。分离纯化得到2个黄酮类化合物,经理化数据和波谱分析确定,化合物1为3,5,7-三羟基黄酮,分子式为C15H10O5;化合物2为山奈酚,分子式为C15H10O6

English

  • 悬铃木(Platanus)系悬铃木科悬铃木属落叶乔木植物,因生长迅速,叶大荫浓而被作为城市绿化树种。目前对其研究多集中于环境绿化方面的优点及其花粉引起的过敏等内容,对其化学成分的提取纯化和药用活性方面研究较少。悬铃木落叶多而时间长,多以焚烧、掩埋等方式处理,不仅造成严重的环境污染而且浪费资源。研究表明悬铃木球叶中含有多糖、黄酮类化合物等天然活性物质[1~5]。黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、抑菌抗病毒、抗氧化衰老等功效[6~9]

    浊点萃取是以表面活性剂水溶液代替有机溶剂作为萃取剂的液-液萃取新技术,利用表面活性剂增溶和浊点现象而实现高效提取[10, 11]。因操作步骤简单、有机溶剂使用少、活性成分在提取过程中不易变性且工艺易于放大,浊点萃取技术被广泛应用于金属离子、大分子类物质的富集和天然植物活性成分提取等方面[10~13]

    为了充分利用植物资源,变废为宝,寻找新的药用化学成分资源,本文采用微波辅助浊点萃取技术来提取悬铃木球叶中的黄酮类化合物,通过响应面优化法确立悬铃木黄酮类化合物的适宜提取工艺条件,确立了悬铃木总黄酮得率与各实验因素变量的二次回归模型方程,最终分离纯化得到2个化合物,并对其进行了鉴定。本文可为悬铃木资源的开发利用提供理论依据。

    悬铃木球叶(采自郑东新区龙子湖高校园区悬铃木种植区域);AB-8大孔吸附树脂(蚌埠市辽源新材料有限公司);色谱硅胶(青岛海洋化工厂);Sephadex LH-20(北京索莱科技有限公司);甲醇、乙醇、吐温-80、石油醚、乙酸乙酯等试剂均为市售分析纯级。

    XH-100A型微波反应器(北京祥鹄科技发展有限公司);熔点测定仪(上海精密仪器仪表有限公司);Agilent 400 MR型核磁共振谱仪(安捷伦公司)。

    取悬铃木球叶,去除腐败和枯黄部分后,称取20kg,洗净晾干,剪成小段后置于烘箱中60℃烘干,冷却粉碎后再置于烘箱50℃烘干,保存于干燥器中备用。分别称取5.0g悬铃木粉状样品置于1000mL平底烧瓶中,加入250mL 0.6%(质量比)吐温-80的乙醇溶液作为浊点提取剂,放入微波反应器,连接冷凝回流装置。设定单因素和响应面优化分析方案,在设定参数下提取后取出,冷却静置,抽滤得黄酮类化合物滤液,处理后测定总黄酮化合物的得率。在优化提取条件下提取,将多次提取滤液合并,减压蒸馏浓缩,收集回收提取剂,得到总黄酮类化合物粗浸膏。提取与纯化流程框图见图 1

    图 1

    图 1.  提取与纯化流程图
    Figure 1.  Diagram of extraction and purification process

    以NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定黄酮含量。依文献[7, 14]所述方法,用最小二乘法进行线性回归,得黄酮芦丁的浓度c(mg·mL-1)与吸光度A的拟合方程:A=11.8272c+0.1055,回归系数r值为0.9995,表明方法线性关系良好,可作为悬铃木总黄酮化合物含量的测定方法。

    由悬铃木样品提取液吸光度A值计算悬铃木总黄酮类化合物的浓度c,按式Y=(c×10×50)/m计算悬铃木黄酮类化合物得率Y,以得率的大小作为优化实验提取条件的依据。式中,Y为总黄酮得率,mg/g;c为总黄酮浓度,mg/mL;m为悬铃木样品质量,g;10为总黄酮溶液的定容体积,mL;50为提取液稀释的倍数。

    实验主要考察微波功率、提取时间、液固比等因素对悬铃木黄酮提取率的影响。单因素实验中,固定其他实验因素参数,改变另一因素参数,考察该因素参数对悬铃木总黄酮得率的影响。

    表面活性剂吐温-80的浊点按GB/T 5559-2010/ISO 1065:1991标准方法测定,加热方式为微波加热。

    在单因素试验基础上,以0.6%吐温-80的乙醇溶液作为浊点萃取剂,以微波功率、提取时间、液固比等因素为考察变量,取微波功率X1、提取时间X2、液固比X3,依响应面法中的Box-Behnken试验设计原理,采用三因素三水平的响应面分析方法[15],以-1、0、+1代表自变量编码水平,按方程$x_{1}=\frac{X_{1}-400}{50}$$x_{2}=\frac{X_{2}-7}{1}$$x_{3}=\frac{X_{3}-50}{5}$分别对各因素进行编码。

    将悬铃木黄酮类化合物粗浸膏用60%乙醇溶液室温溶解,分次过已处理好的大孔树脂柱。分别以45%、75%、95%的乙醇-水溶液依次洗脱,将75%乙醇洗脱液部分经浓缩得浸膏。经过多次MCI-gel柱色谱,以60%甲醇-水溶液、80%甲醇-水溶液以及纯甲醇依次进行洗脱,将60%甲醇部分浓缩浸膏经硅胶柱层析,以石油醚-乙酸乙酯(10:1~1:2)和乙酸乙酯-甲醇(1:1)系统依次洗脱。石油醚-乙酸乙酯洗脱部分再经过Sephadex LH-20纯化得到化合物1;乙酸乙酯-甲醇洗脱部分,再经过制备型高效液相色谱(流动相为75%甲醇)纯化得到化合物2

    分别进行单因素实验,主要考察微波功率X1、提取时间X2、液固比X3等因素对悬铃木黄酮提取率的影响。单因素实验结果表明,波功率为400W、提取时间7min、液固比50mL/g时,悬铃木黄酮提取率最高。

    浊点萃取剂吐温-80的浊点不仅取决于自身分子结构和浓度,而且受添加物(如极性有机物乙醇等)的影响。研究发现,随着乙醇溶液中吐温-80浓度的升高,其浊点先下降后上升,当浓度为0.6%时浊点最低,约为73℃。这可能是由于其浊点下降过程中,浓度升高仅使胶束的数目增加,使胶束之间因相互碰撞的几率增大导致聚集的可能性增加,因此易引起与水相分离,使浊点降低。浊点达到最小值时,随吐温活性剂浓度的增大,胶束形状转变导致胶束粒子的回旋半径增大,溶液粘度增加,胶束聚集几率降低,导致浊点升高,但仍然低于吐温-80未加添加物的浊点(约93℃)[16]

    同时,在以样品提取液中总黄酮类化合物的提取率为考察目标的实验中,0.5%~0.8%吐温-80的乙醇溶液对黄酮化合物的提取率较高且变化不大。综合以上因素,在单因素实验中,取吐温-80的质量浓度为0.6%,此时吐温-80溶液的浊点温度约为73℃。此温度易引起活性剂与水相分离,有利于黄酮化合物的富集。此外,在本实验中,由于萃取体系中溶液的体积较大,约250mL(见材料和方法1.2),再加上微波功率为400W,提取时间7min,该条件下整个萃取体系的温度会升高,高于吐温-80溶液的浊点温度73℃,该情况有利于进行浊点萃取。

    在单因素试验基础上,0.6%吐温-80的乙醇溶液作为萃取剂,以波功率为400W、提取时间7min、液固比50mL/g对各因素进行编码,试验因素与水平设计见表 1

    表 1

    表 1  Box-Behnken试验因素及水平
    Table 1.  Factors and levels of Box-Behnken design
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    因素 代码 编码水平
    未编码 已编码 -1 0 +1
    微波功率/W X1 x1 350 400 450
    提取时间/min X2 x2 6 7 8
    液固比/mL·g-1 X3 x3 45 50 55

    表 1中所示因素和水平,按照Box-Behnken设计要求设计出17组实验方案(见表 2)。依实验方案进行实验,黄酮得率测定结果列于表 2最右列。

    表 2

    表 2  实验方案和结果
    Table 2.  Experiment design and test results
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    编号 微波功率
    X1
    提取时间
    X2
    液料比
    X3
    黄酮得率实测值
    Y/(mg·g-1)
    1 -1 +1 0 0.909
    2 0 +1 +1 1.308
    3 +1 0 -1 1.338
    4 -1 0 +1 1.150
    5 0 +1 -1 1.269
    6 0 0 0 1.470
    7 0 0 0 1.469
    8 0 0 0 1.455
    9 +1 0 +1 1.280
    10 0 0 0 1.467
    11 0 -1 -1 0.989
    12 -1 -1 0 0.868
    13 +1 -1 0 0.960
    14 +1 +1 0 1.268
    15 -1 0 -1 0.902
    16 0 0 0 1.458
    17 0 -1 +1 1.121

    将实验数据和结果进行回归拟合,得到以悬铃木总黄酮得率Y为目标函数的编码形式的二次回归方程模型(1),并对模型进行方差及显著性分析,结果见表 3

    表 3

    表 3  方差及显著性分析
    Table 3.  Analysis of mean square
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    来源 总和 自由度 F Prob>F 显著性
    模型 0.78 9 167.53 < 0.0001 显著
    x1 0.033 1 63.93 < 0.0001
    x2 0.18 1 342.61 < 0.0001
    x3 0.025 1 47.35 0.0002
    x1x2 0.018 1 34.41 0.0006
    x1x3 0.023 1 45.20 0.0003
    x2x3 0.0022 1 4.17 0.0803
    x12 0.23 1 442.86 < 0.0001
    x22 0.22 1 426.87 < 0.0001
    x32 0.017 1 32.16 0.0008
    残差 0.0036 7
    失拟项 0.0034 3 24.54 0.0049 显著
    净误差 0.00019 4
    总离差 0.78 16
    CV=1.87%
    R2=0.9894

    $Y=0.74+0.21 x_{1}+0.61 x_{2}+0.32 x_{3}+0.067 x_{1} x_{2}- \\ 0.076 x_{1} x_{3}-0.023 x_{2} x_{3}-0.23 x_{1}^{2}-0.23 x_{2}^{2}-0.63 x_{3}^{2} $

    (1)

    表 3可知,模型的F值为167.53,显著性水平Prob>F小于0.0001,表明模型显著;失拟项F值为24.54大于0.05,表明失拟不显著,残差由随机误差引起;拟合的多元相关系数R2为0.9894,接近于1,说明回归方程拟合度很好。变异系数CV值(1.87%)很小,表明实验数据精密度高,数据可靠。此外,从回归方程模型因变量的方差分析可知,模型一次项x1x2P值均 < 0.0001,说明差异极显著,x3(P=0.0002)差异显著;交互项x1x3(P=0.0006)和交互项x1x2(P=0.0002)在0.001水平处达到显著,交互项x2x3(P=0.0803)差异不显著,二次项x12(P < 0.0001),x22(P < 0.0001)差异极显著,x32(P=0.0008)差异显著。表明微波功率及微波提取时间对黄酮类化合物得率的主效应明显,且在微波功率、液固比之间和微波功率、提取时间之间存在交互作用。依据对应F值的大小F(x1)=63.93,F(x2)=342.61,F(x3)=47.35,可知因素的主效应关系为:提取时间>微波功率>液固比。上述结果说明,模型能反映响应值的变化规律,拟合程度好,可用于微波辅助提取悬铃木总黄酮实验条件的分析和预测。

    利用软件分析方程所代表的曲面,可以推测出最佳条件在实验中所覆盖的区域。按所建响应面模型得到三维响应曲面图及等高线图,以获得实验因素间交互作用对黄酮提取率的影响。固定液固比,微波功率X1与提取时间X2交互作用对总黄酮得率的影响的响应曲面图及等高线如图 2所示。固定提取时间,微波功率X1与液固比X3交互作用对总黄酮得率的影响的响应曲面图及等高线见图 3。固定微波功率,提取时间X2与液固比X3交互作用对总黄酮类化合物的得率的影响响应曲面图及等高线如图 4所示。

    图 2

    图 2.  微波功率与提取时间对总黄酮得率交互影响的响应曲面图(a)和等高线图(b)
    Figure 2.  Contour and response surface plots for Y between microwave power and extraction time

    图 3

    图 3.  微波功率与液固比对黄酮得率交互影响的响应曲面图(a)和等高线图(b)
    Figure 3.  Contour and response surface plots for Y between microwave power and liquid-solid ratio

    图 4

    图 4.  提取时间与液固比对黄酮得率交互影响的响应曲面图(a)和等高线图(b)
    Figure 4.  Contour and response surface plots for Y between extraction time and liquid-solid ratio

    图 2~图 4可知,以悬铃木黄酮得率为响应目标时,各因素对黄酮得率的影响不是简单的线性关系,各因素的交互作用存在其适宜的取值范围,该取值范围或最佳取值可以通过式(1)分别对各因素xi求导,联合求解方程组即可得曲面函数的驻点,依此确定微波提取悬铃木总黄酮的优化实验条件。

    联合求解方程组可得基于悬铃木总黄酮类化合物的优化提取实验条件:微波功率412.58W、提取时间7.12min、液料比49.29:1 mL/g,该条件下悬铃木黄酮类化合物得率的预测值为1.487mg/g。

    为检验响应面法的可靠性,采用上述优化条件进行验证试验,考虑到实际操作的便利,将条件修正为微波功率410W,提取时间7min,液料比49:1 mL/g,平行测定5次,实际测得平均总黄酮得率1.480mg/g,与理论预测值相比,其相对误差约为0.47%。

    取经过实验部分1.5节的方法纯化后的悬铃木黄酮化合物,测定化合物12的熔点以及氢谱和碳谱。

    化合物1:棕黄色粉状晶体,熔点214~215℃;1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ:8.17~8.22(m,2H,H-2′,6′),7.48~7.53(m,2H,H-3′,5′),7.42~7.48(m,1H,H-4′),6.42(d,J=2.1Hz,1H,H-8),6.20(d,J=2.1Hz,1H,H-6);13C NMR(101MHz,MeOD-d4)δ:177.8,166.1,162.7,158.6,147.0,138.6,132.8,130.1,129.6,128.9,104.6,99.5,94.6。以上数据与文献[17, 18, 19]报道的数据基本一致,故化合物1鉴定为3, 5, 7-三羟基黄酮(高良姜素),其分子式为C15H10O5。其结构式为:

    化合物2:棕黄色粉状晶体,熔点276~278℃;1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ:8.06~8.12 (m,2H,H-2′,6′),6.88~6.94(m,2H,H-3′,5′),6.40(d,J=2.1Hz,1H,H-8),6.19(d,J=2.1Hz,1H,H-6);13C NMR (101MHz,MeOD-d4)δ:177.5,165.7,162.6,160.7,158.4,148.1,137.2,130.8,123.8,116.4,104.6,99.4,94.5。以上数据与文献[17~19]报道的数据基本一致,故化合物2鉴定为3, 4’, 5, 7-四羟基黄酮(山奈酚),其分子式为C15H10O6。其结构式为:

    采用微波辅助浊点萃取技术提取悬铃木球叶中的黄酮类化合物,得出优化的提取条件为:微波功率410W、提取时间7min、液料比49:1 mL/g,平行测定5次,实际测得黄酮平均得率1.480mg/g,与理论预测值相比,其相对误差约为0.47%。对总黄酮提取物通过色谱等分离纯化,得到2个化合物。化合物1为高良姜素,分子式为C15H10O5;化合物2为山奈酚,分子式为C15H10O6


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  • 图 1  提取与纯化流程图

    Figure 1  Diagram of extraction and purification process

    图 2  微波功率与提取时间对总黄酮得率交互影响的响应曲面图(a)和等高线图(b)

    Figure 2  Contour and response surface plots for Y between microwave power and extraction time

    图 3  微波功率与液固比对黄酮得率交互影响的响应曲面图(a)和等高线图(b)

    Figure 3  Contour and response surface plots for Y between microwave power and liquid-solid ratio

    图 4  提取时间与液固比对黄酮得率交互影响的响应曲面图(a)和等高线图(b)

    Figure 4  Contour and response surface plots for Y between extraction time and liquid-solid ratio

    表 1  Box-Behnken试验因素及水平

    Table 1.  Factors and levels of Box-Behnken design

    因素 代码 编码水平
    未编码 已编码 -1 0 +1
    微波功率/W X1 x1 350 400 450
    提取时间/min X2 x2 6 7 8
    液固比/mL·g-1 X3 x3 45 50 55
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    表 2  实验方案和结果

    Table 2.  Experiment design and test results

    编号 微波功率
    X1
    提取时间
    X2
    液料比
    X3
    黄酮得率实测值
    Y/(mg·g-1)
    1 -1 +1 0 0.909
    2 0 +1 +1 1.308
    3 +1 0 -1 1.338
    4 -1 0 +1 1.150
    5 0 +1 -1 1.269
    6 0 0 0 1.470
    7 0 0 0 1.469
    8 0 0 0 1.455
    9 +1 0 +1 1.280
    10 0 0 0 1.467
    11 0 -1 -1 0.989
    12 -1 -1 0 0.868
    13 +1 -1 0 0.960
    14 +1 +1 0 1.268
    15 -1 0 -1 0.902
    16 0 0 0 1.458
    17 0 -1 +1 1.121
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    表 3  方差及显著性分析

    Table 3.  Analysis of mean square

    来源 总和 自由度 F Prob>F 显著性
    模型 0.78 9 167.53 < 0.0001 显著
    x1 0.033 1 63.93 < 0.0001
    x2 0.18 1 342.61 < 0.0001
    x3 0.025 1 47.35 0.0002
    x1x2 0.018 1 34.41 0.0006
    x1x3 0.023 1 45.20 0.0003
    x2x3 0.0022 1 4.17 0.0803
    x12 0.23 1 442.86 < 0.0001
    x22 0.22 1 426.87 < 0.0001
    x32 0.017 1 32.16 0.0008
    残差 0.0036 7
    失拟项 0.0034 3 24.54 0.0049 显著
    净误差 0.00019 4
    总离差 0.78 16
    CV=1.87%
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  • 发布日期:  2019-11-01
  • 收稿日期:  2019-07-02
  • 接受日期:  2019-08-04
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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