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• 细胞内pH值在细胞增殖、凋亡、酶活性和蛋白质降解等代谢过程中起着至关重要的作用^[1~5].它与许多常见疾病如癌症、阿尔茨海默氏症以及其他许多疾病有直接联系^{[6, 7]}.此外, 有文献报道^[8], 细胞内酸化已成为细胞调亡的一个重要的早期特征, 因此, 监测活细胞内pH值的变化非常重要.荧光光谱和荧光成像技术具有高灵敏度、高分辨率和瞬时分辨率, 并且对细胞没有破坏性等优点, 分子荧光pH探针已经成为观察细胞内pH值变化不可或缺的工具.同时, 荧光pH探针还广泛应用于分析化学、生物测试等范畴.然而, 目前大多数文献报道的对pH值敏感的荧光探针都是在中性或微酸性条件下工作, 只有很少一部分能够在极端酸度下^[9~14]或者在跨度较大的pH范围内^{[15, 16]}进行活细胞成像.这促使我们就跨度较大的pH值范围下的高敏感的pH值荧光探针展开研究.

  目前常用的pH感应荧光探针主要有荧光素类、罗丹明类、氟硼荧(BODIPY)类、花菁素类等^[17~20].除了这些常见的类别外, 一些荧光蛋白中咪唑单元是一个对pH敏感的功能结构, 例如, 咪唑单元是红荧光蛋白EBFP2、mCherry和EosFP荧光团系统的重要组成部分^{[21, 22]} (图 1), 并且是其对pH敏感的关键因素^[23~25].另一方面, 研究表明, 大范围共轭结构能有效提高有机小分子光敏材料的发光性能^[26]; 吲哚和咔唑单元均具刚性平面结构, 可作为电子给体发色团, 有优良的光热稳定性和电荷传输性能, 是合成优良二阶非线性光学材料的合成单元^{[27, 28]}.在咪唑单元中引入吲哚或咔唑砌块将有助于增大分子的共轭范围, 期望能使两者相互作用, 从而改善咪唑化合物的光学性能.鉴于此, 本文选用吲哚-3-甲醛、咔唑-3-甲醛及苯偶酰和9, 10-菲醌等为原料, 设计合成了19个未见报道的具有拓展π结构的含吲哚环或咔唑环的多取代咪唑衍生物, 结构如图 2, 测试其紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱, 并筛选出光学性能较好的化合物进一步研究其对pH值的光学响应和在一定pH范围内的荧光成像.

  图 1

  

  图 1.  红荧光蛋白mCherry、EBFP2和EosFP的荧光团

  Figure 1.  Fluorophores from red-emitting proteins of mCherry, EBFP2 and EosFP

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  图 2

  

  图 2.  所合成化合物的结构

  Figure 2.  Structures of the synthesized compounds

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  1.   结果与讨论

  1.1   合成反应条件的优化

  制备2, 4, 5-三取代咪唑类化合物通常以α-二酮或α-羟基酮、醛为原料, 醋酸铵等为氮源, 在催化作用下经多组分一锅反应合成.采用的催化剂有KH₂PO₄、(C₄H₉)₄NBr、PEG-400、分子碘、烷基苯磺酸、醋酸等均相催化剂^[29], 以及负载型催化剂如SiO₂-TiCl₄^[30]、活性炭负载FeCl₃^[31]、粘土负载钛化合物^[32]、改性氧化铝^[33]等.此外, 微波辐射对合成多取代咪唑也有很好的促进作用^[34].虽然在新型催化剂作用下合成多取代咪唑类化合物方面取得了很大的进展, 但较经典的冰醋酸作用下的合成法因冰醋酸廉价易得和低毒性, 以及绿色环保, 仍被广泛应用^[35~38].本文以冰醋酸为溶剂和催化剂, 采用“一锅”反应高效地合成了系列含吲哚或咔唑结构单元的多取代咪唑衍生物.

  通过以N-乙基-5-苯基吲哚-3-甲醛、苯偶酰及醋酸铵为原料合成化合物1h的反应为模型, 对影响反应的多种因素进行系统研究, 探索一锅法合成目标化合物的较优反应条件.

  1.1.1   溶剂选择与用量

  如前所述, 在以二酮、醛和醋酸铵(或胺)为原料的多组分反应合成三取代咪唑和四取代咪唑的反应中, 一般可以醋酸为溶剂.但据报道, 此合成反应也可以甲醇或乙醇为溶剂在金属配合物或固体酸催化作用下进行^{[31, 39, 40]}.因此, 我们分别探讨了以醋酸、甲醇和乙醇为溶剂合成目标化合物(表 1).结果表明, 溶剂对反应有较大影响, 不加催化剂或加少量醋酸为催化剂时在乙醇中基本不发生反应, 醋酸为溶剂最佳(Entries 1~4).因为反应过程中, 加热条件下醋酸铵分解产生氨, 氨与醛的亲核加成, 以及其产物中间体与邻二酮的亲核加成均需在酸催化下进行^{[29, 40]}.乙醇的酸性过弱不足以催化反应进行, 甲醇酸性较乙醇稍强, 对反应有一定催化作用, 但效果不理想, 而醋酸在作为溶剂的同时, 也充当了催化剂的角色.以醋酸为溶剂, 1 mmol N-乙基-5-苯基吲哚-3-甲醛和1 mmol苯偶酰及6 equiv.醋酸铵进行反应, 醋酸用量以5 mL为宜.溶剂用量过多, 反应物浓度降低, 产率也随之降低.所以最终选择醋酸的用量为5 mL (表 1, Entries 4~6).此外, 反应物在醋酸中的溶解性较在甲醇或乙醇中的好.

  表 1

  

  表 1  溶剂的选择及用量、温度和反应物配比对反应的影响^a

  Table 1.  Effects of selection and amount of solvents, temperatures and molar ratio of reagents on the reaction

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  Entry	Solvent (mL)	n(aldehyde): n(benzil)	Temp./℃	Time/h	Yieldb/%
  1	CH3OH (20)	1:1	Reflux	12	Trace
  2	C2H5OH (30)	1:1	Reflux	12	—
  3	C2H5OH (25)c	1:1	Reflux	12	Trace
  4	HOAc (4)	1:1	100	12	37.6
  5	HOAc (5)	1:1	100	10	65.4
  6	HOAc (6)	1:1	100	12	58.5
  7	HOAc (5)	1:1	90	12	43.2
  8	HOAc (5)	1:1	110	7	40.6
  9	HOAc (5)	1:1.1	100	8	89.2
  10	HOAc (5)	1:1.2	100	8	90.0
  11	HOAc (5)	1.1:1	100	8	65.8
  a The amount of NH4OAc is 6 mmol (excess); b Isolated yields by recrystallization in EtOH; c 5 mL HOAc added.

  1.1.2   温度和反应物配比

  温度对反应的影响较明显(表 1, Entries 5, 7, 8), 适宜的反应温度为100 ℃.温度过低, 反应速度慢, 使反应不完全.但温度高于100 ℃时, 产率下降, 其原因可能是由于含活泼羰基的原料醛在过高温度下易被氧化成酸.

  探究了底物吲哚甲醛与苯偶酰配比对反应的影响.反应结果显示, 当醛与苯偶酰的物质的量比为1.0:1.1时目标产物产率达到最大值(表 1, Entries 5, 9, 11), 继续增加苯偶酰用量对产率几乎没有影响(表 1, Entries 9, 10), 故我们确定了苯偶酰的量应是醛的1.1倍.

  加热过程中醋酸铵分解生成的氨直接参与反应^{[29, 40]}, 经探索, 本合成中醋酸铵的较佳用量为醛的6倍量.

  通过上述单因素考察, 最终确定合成化合物1h的优化条件为:吲哚甲醛与苯偶酰的物质的量比为1:1.1, 6 equiv.的醋酸铵为氮源, 5 mL醋酸为溶剂(1 mmol吲哚甲醛), 于100 ℃下反应8 h.此时产物1h产率为89.2% (表 1, Entry 9).

  1.2   多取代咪唑衍生物的合成

  在上述优化条件下, 以苯偶酰或9, 10-菲醌为底物分别与含不同取代基的吲哚-3-甲醛或咔唑-3-甲醛反应, 合成了系列多芳基咪唑衍生物(1a~1n、2a~2d、3和4), 结果见表 2.

  表 2

  

  表 2  含氮杂环多芳基咪唑衍生物的合成及其光谱数据^a

  Table 2.  Synthesis and Optical Data of multi-aryl imidazoles containing nitrogen heterocycly

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  Entry	R1	R2	R3	Product	Time/h	Yieldb/%	UV-Vis absorptionc		Emissionc, d λem/nm
  							λmax/nm	ε/(mol•L-1•cm-1)
  1	H	Br	C2H5	1a	5.5	90.5	277, 320	27600 (277 nm)	406
  2	H	Br	n-Bu	1b	5	89.4	276, 320	22300 (276 nm)	404
  3	H	Br	Allyl	1c	5.5	85.3	275, 313	26900 (275 nm)	404
  4	H	H	C2H5	1d	4	92.5	275, 314	18000 (314 nm)	412
  5	H	H	Allyl	1e	5	91.4	276, 312	20700 (312 nm)	410
  6	H	OCH3	C2H5	1f	4	82.1	276, 320	24400 (276 nm)	414
  7	H	OCH3	Allyl	1g	5	84.1	278, 320	29000 (278 nm)	414
  8	H	Ph	C2H5	1h	7	89.2	266, 320	44500 (266 nm)	410
  9	H	Ph	n-Bu	1i	7	85.6	264, 317	43800 (264 nm)	409
  10	H	p-CH3C6H4	n-Bu	1j	8	84.3	267, 320	50400 (267 nm)	410
  11	OH	H	C2H5	1k	5.5	74.8	278, 320	21700 (320 nm)	413
  12	OH	Ph	C2H5	1m	6	78.9	267, 322	38000 (267 nm)	410
  13	OH	p-CH3C6H4	n-Bu	1n	7	71.6	268, 320	44100 (268 nm)	452
  14	-	-	C2H5	2a	2	73.7	305	50600	399
  15	-	-	n-Bu	2b	2.5	68.3	305	44600	398
  16	-	-	Allyl	2c	2	69.3	305	51600	397
  17	-	-	CH2Ph	2d	3	76.4	305	48300	398
  18	-	-	-	3	8	85.4	262, 330	50600 (262 nm)	412
  19	-	-	-	4	8	86.5	262, 308	63300 (262 nm)	400
  a Reaction conditions: 1 mmol of aldehyde, 1.1 equiv. of benzyl or 9, 10-phenanthraquinone, 6 equiv. of NH4OAc, and 5 mL of HOAc, at 100 ℃ under air; b Isolated yields by recrystallization in EtOH; c data tested in ethanol (1.0×10-5 mol/L) at 25 ℃; d excited at 320 nm for compounds 1 and 3, and at 310 nm for compounds 2 and 4.

  在上述优化条件下, 合成了系列目标化合物, 结果见表 2.如表 2所示, 苯偶酰和9, 10-菲醌均易于与3-吲哚甲醛/3-咔唑甲醛及醋酸铵进行反应, 产物收率为68.3~92.5%.吲哚甲醛及咔唑甲醛N-位上取代基的类型对反应的产率及速率均影响不大; 吲哚甲醛5-位上的取代基含苯环时, 其反应活性明显降低(表 2, Entries 8~10, 12, 13);咔唑醛比吲哚醛更容易进行反应(表 2, Entries 4, 5, 14, 16).

  1.3   化合物光学性质分析

  1.3.1   溶剂对化合物光学性质的影响

  为研究所合成目标化合物在极性不同的溶剂中的光学性能, 并筛选有利于荧光发射的溶剂, 实验以化合物1i和2d为模板, 分别测试其在正己烷、甲苯、乙酸乙酯、乙醇和乙腈中的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱, 实验结果显示, 溶剂极性对化合物1i和2d的紫外吸性能的影响不明显; 溶剂性质对化合物1i和2d的荧光发射最大波长的影响不大, 但对荧光发射强度有较大的影响, 1i和2d在乙醇溶液中均有相对最强的荧光发射.

  综合不同溶剂中的光谱测试结果, 同时考虑到乙醇是一种低毒性低污染溶剂, 最终选择乙醇为溶剂, 测试研究了所合成的19个目标化合物在乙醇中的光学性质, 筛选出了荧光性能较好的化合物.

  1.3.2   化合物在乙醇溶液中的光学性质研究

  所合成目标化合物的紫外-可见吸收和荧光发射性质见表 2和图 3.由表 2可知, 含吲哚环结构的咪唑衍生物(1a~1n, 3)的荧光发射最大波长主要集中在404~414 nm, 含咔唑环结构的咪唑衍生物(2a~2d, 4)的荧光发射最大波长集中在400 nm附近.化合物结构对荧光性能有很大影响, 从图 3a和3c可见, 含咔唑结构咪唑衍生物的荧光强度显著大于含吲哚结构咪唑衍生物, 例如2a＞1d, 2c＞1e, 以及4＞3, 其原因是咔唑环的引入能与咪唑环形成电子更丰富的π共轭体系, 有利于荧光发射.分子的平面结构影响其共轭效果, 菲并咪唑结构比4, 5-二苯基咪唑结构有更好的刚性平面, 因而菲并咪唑化合物有更强的荧光发射, 如4＞2d, 这与Park等报道的一致^[41].含吲哚环结构咪唑衍生物中, 吲哚环5位上取代基的电子效应对化合物的荧光发射性能的影响较明显, 供电子的苯基和甲氧基均使荧光强度增强, 而吸电子的溴则使荧光强度降低, 如1h和1f＞1d＞1a以及1g＞1e＞1c(图 3a和3b).吲哚环和咔唑环中氮原子上的取代基对荧光强度也有一定的影响, 烯丙基和苄基相较乙基和丁基更有助于增强化合物的荧光发射强度, 如1e＞1d, 2c和2d＞2b(图 3a和3c).测试结果显示, 尽管在p-CH₃C₆H₄和羟基的协同作用下1n的最大发射波长在452 nm, 较1j的红移了42 nm; 但4, 5-二苯基咪唑衍生物中, 该2个苯基的邻位上的羟基会使化合物的荧光猝灭, 如1h＞＞1m和1j＞＞1n(图 3a和3b), 这与Tian^[35]和Jezewski^[36]等的研究结果相同.

  图 3

  

  图 3.  化合物在乙醇中的荧光发射光谱

  Figure 3.  Fluorescence spectra of compounds in ethanol

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  如图 3c所示, 具菲并咪唑结构和咔唑砌块的化合物4的荧光发射强度最强.根据化合物荧光发射强度及其结构特点, 挑选了化合物2d、3和4三个化合物为酸感应探针, 分别测试了其在三氟乙酸作用下的荧光性能.

  1.4   三氟乙酸诱导下化合物在溶液中的光谱研究

  咪唑是非中心对称结构五元二氮杂环化合物, 环中2个氮原子结构各异, 具有优良的配位络合性和电子、质子传递性, 可用作离子探针^{[42, 43]}.本实验中, 分别往化合物2d、3和4 (探针2d、3和4)的乙醇-水溶液(V:V=1:1, 1.0×10^-5 mol/L)中加入三氟乙酸(TFA), 测试随酸浓度改变而变化的探针化合物乙醇-水溶液的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱.随酸浓度增加, 探针2d溶液在305 nm处的吸收峰强度逐渐减弱, 且随酸度的增加最大吸收波长发生了轻微蓝移(302 nm), 与此同时, 在350 nm处出现了一个新的吸收峰.而随酸浓度增加, 探针3溶液在283 nm处的吸收强度逐渐减弱至最终完全猝灭, 在325 nm处的吸收强度逐渐增强, 并且吸收峰红移至329 nm.探针4随酸浓度增加, 在308 nm处的吸收, 在强度逐渐减弱的同时蓝移至302 nm; 而位于367 nm处的吸收, 其强度逐渐增强且逐渐蓝移至363 nm.

  TFA的加入对探针2d溶液的荧光发射强度和最大波长均有一定影响(λ_ex=304 nm), 其中对荧光发射强度的影响更明显.随着TFA浓度的增加, 2d溶液的荧光发射强度逐渐增强, 最大发射波长从400 nm处红移至408 nm.对于探针3, 320 nm光作用下, 加入TFA前, 溶液在419 nm处有中等强度的发射峰; 随TFA的加入, 发射峰强度逐渐增强, 最大发射波长蓝移至409 nm.而探针4, 随TFA浓度的增加, 308 nm光作用下, 荧光发射强度先减弱后增强, 最大发射波长由400 nm红移至424 nm, 红移了24 nm.

  1.5   电化学性质研究

  为更深入研究探针的pH传感机理, 对探针化合物进行了循环伏安测试.循环伏安法(CV)是测定前线轨道能级的重要手段, 通过紫外吸收光谱和CV可以较精确地计算出能带间隙(E_g)^[44], 以及最高占有轨道(HOMO)和最低未占轨道(LUMO)能级^[45].探针化合物及其质子化产物在乙腈溶液中的电化学性质见表 3.由表 3可知, 与纯探针2d和4相比, 其对应的质子化产物(2d-H⁺, 4- H⁺)中的能带间隙E_g有所升高, 而3-H⁺的能带间隙E_g相较于纯探针3则降低了. E_g计算结果与探针2d和4在酸诱导作用下的紫外可见最大吸收波长发生了蓝移, 而探针3的吸收波长发生了红移的现象相吻合.

  表 3

  

  表 3  探针化合物的电化学性质

  Table 3.  Electrochemical Properties of probe compounds

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  Entry	Ega/eV	Eox/V	HOMOb/eV	LUMOc/eV
  2d	3.09	0.91	-5.65	-2.56
  2d-H+	3.19	0.78	-5.52	-2.33
  3	3.20	0.79	-5.53	-2.33
  3-H+	3.13	0.79	-5.53	-2.40
  4	3.07	0.81	-5.55	-2.48
  4-H+	3.23	0.79	-5.53	-2.30
  a Estimated from the absorption spectra in ethanol; b EHOMO=-(4.74+Eox); c ELUMO=EHOMO+Eg.

  1.6   探针的pH滴定

  选取探针2d和4进行pH滴定, 研究其对pH值的荧光相应.荧光pH滴定结果表明, 探针化合物溶液的荧光光谱与pH值之间有很强的依赖关系.对于探针2d, 如图 4所示, 在酸性条件下, 随体系pH值由3.90升高至10.00, 体系的最大发射波长发生了轻微的蓝移(408 nm蓝移至398 nm)最大波长处的荧光强度逐渐减弱.同时, 在此pH范围内, 荧光强度和pH值之间呈现很好的线性关系(见图 4中插图, 拟合优度R²=0.99765).探针4的荧光pH滴定实验结果见图 5.弱酸性条件下, pH=6.89~4.00, 探针4溶液的荧光强度变化不大, 同时最大发射波长由400 nm红移至424 nm; 继续增强酸性, pH=4.00~1.98, 荧光强度随酸性的增强逐渐减弱, 并且与pH值之间呈现很好的线性关系(见图 5a)中插图, R²=0.99363).碱性条件下, pH=7.35~10.30, 随碱性的增强, 体系在406 nm处的峰逐渐减弱, 而在466 nm处逐渐出现一个新的发射峰; 而且, 在466和406 nm处的发射比率(I₄₆₆/I₄₀₆)响应与pH值之间呈指数相关关系(图 5b中插图, R²=0.96865).这说明, 在pH=7.35~10.30范围, 探针4可作为一种比率型荧光传感器检测pH值.而在pH=6.89~7.35范围, 荧光强度及最大发射波长的变化均不大.探针分子对H⁺/OH^-可能的传感机制及溶液荧光变化如图 6所示.

  图 4

  

  图 4.  探针2d在EtOH/缓冲溶液中的荧光光谱和pH滴定曲线

  Figure 4.  Fluorescence spectra and pH titration curves of probe 2d in EtOH/buffer solutions

  Inset shows a pH-dependent plot of the emission at λ_max (λ_ex＝304 nm)

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  图 5

  

  图 5.  探针4在EtOH/缓冲溶液中的荧光光谱和pH滴定曲线

  Figure 5.  Fluorescence spectra and pH titration curves of probe 4 in EtOH/ buffer solutions

  Inset shows (a) a pH-dependent plot of the emission at λ_max and (b) plot of the emissions ratio of probe 4 at 466 and 406 nm (I₄₆₆/I₄₀₆) vs pH (λ_ex＝308 nm)

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  图 6

  

  图 6.  探针2d和4对H⁺/OH^-可能的传感机制以及在紫外光(λ_ex=365 nm)照射下荧光的变化

  Figure 6.  Probable sensing mechanism of the probes 2d and 4 responded to H⁺/OH^-and the corresponding changes of luminescence under UV radiation (λ_ex=365 nm)

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  1.7   探针的抗金属离子干扰性

  考虑到细胞内存在的金属离子可能对探针2d和4荧光响应产生影响, 对探针抗金属离子干扰性进行了测试. 图 7为金属离子对荧光强度的影响(发射比率F/F₀, 探针在有金属离子存在下与没有金属离子时溶液荧光强度的比值).结果显示, 不同金属离子的加入, 探针荧光强度变化不大, 即金属离子对探针2d和4的荧光强度的干扰较小.这表明, 探针2d和4有望用于监测细胞内pH值的变化.

  图 7

  

  图 7.  探针2d和4 (50 μmol•L^-1)在不同金属离子(500 μmol• L^-1) H₂O-EtOH中荧光强度的变化

  Figure 7.  Emission changes of probes 2d and 4 (50 μmol•L^-1) in various metal ions (500 μmol•L^-1) H₂O-EtOH

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  1.8   探针2d和4在MCF-7细胞中的荧光成像

  通过前述实验, 发现探针2d和4的荧光性能与pH之间有强依赖关系, 而且金属离子对其干扰小.因此, 我们将探针应用到人源乳腺癌细胞(MCF-7)的检测中, 观察其是否能监测活细胞中pH值的变化.荧光显微拍摄的图像如图 8所示, 在绿光区波段(λ_ex=450~490 nm)的光激发下, 这些细胞显示出绿色荧光.对探针2d, 图 8a显示, 探针在酸性环境(pH=3.90)中发出强烈的绿色荧光(图 8e是其相应的明场图像); 随pH值逐渐增大, 荧光逐渐减弱(图 8b, 8c, 8d).探针4在pH值接近中性时荧光最强(图 8j), 强碱环境下次之(图 8k), 强酸环境下最弱(图 8i).不同pH值下细胞成像实验显示, 探针的荧光强度在细胞内的变化趋势与体外相同, 证明探针2d和4的细胞渗透性良好、生物毒性低、能迅速透过细胞膜感应细胞内的pH环境, 是一种理想的生物活性探针, 可以顺利检测细胞内pH值的波动.

  图 8

  

  图 8.  探针2d和4作用下MCF-7细胞在不同pH缓冲液中的荧光显微分析

  Figure 8.  Fluorescence microscopy analysis of MCF-7 cells infected by probes in various pH buffers

  a, b, c, d are the fluorescence images infected by probe 2d; e, f, g, h are the bright fields; i, j, k are the fluorescence images infected by probe 4; m, n, o are the bright fields

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  2.   结论

  以冰醋酸为溶剂和催化剂, 醋酸铵为氮源, 苯偶酰(或9, 10-菲醌)与吲哚-3-甲醛/咔唑-3-甲醛经“一锅”反应高效合成了系列含吲哚或咔唑结构的多取代咪唑衍生物(1a~1n, 2a~2d, 3和4), 产物收率为68.3~92.5%.通过光谱测试筛选出两种基于咪唑环结构的对pH敏感的荧光探针2d和4, 这两种探针基于质子化和去质子化的机制通过不同的荧光发射强度对pH值作出响应.其中探针2d在pH=3.9~10范围, 荧光强度随pH值增大逐渐减弱, 且荧光强度与pH值之间呈现良好的线性关系.探针4在pH=1.98~4范围, 荧光逐渐猝灭; 而在碱性条件下, pH=7.35~10.30范围, 随碱性的增强, 406 nm处的峰逐渐减弱, 而在466 nm处逐渐出现一个新的发射峰, 发射比率(I₄₆₆/I₄₀₆)响应与pH值之间呈指数相关关系, 探针4可作为一种比率型荧光探针.常见的金属离子对2种探针的pH感应没有明显的干扰.另外, 我们还利用荧光成像技术成功地将这2种探针应用于MCF-7细胞中pH的检测.本研究提供了两种可应用于化学和生物领域的, 在较大pH值范围内有高灵敏度的pH荧光探针.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  X-6数字显微熔点测定仪(上海物理光学仪器厂, 温度未经校正); Starter-3型pH计(上海奥康斯仪器有限公司); Eqinox55红外光谱仪(德国Bruker公司); Inova 300NB核磁共振仪(美国Varian公司); 4000QTRAP质谱仪(美国AB Sciex公司); CHNS/O 2400有机元素分析仪(美国Perkin Elmer公司); TU-1810紫外可见分光光度计(北京谱析通用仪器有限责任公司); F-4500荧光分光光度计(上海三科仪器有限公司); TE2000光学显微镜(日本尼康公司); DY2300电化学工作站(雷迪美特中国有限公司).

  所用试剂均为市售分析纯或化学纯试剂, 未进一步纯化; 实验中所用水为去离子水.

  3.2   实验方法

  20 mL反应瓶中加入1.0 mmol N-烃基吲哚-3-甲醛^{[46, 47]}, 1.1 mmol苯偶酰, 6 mmol醋酸铵, 5 mL醋酸, 磁力搅拌下于100 ℃反应一定时间(TLC跟踪反应).反应毕, 将反应混合物倒入100 mL冰水混合物中, 过滤得固体, 先后用水和甲醇洗涤滤饼, 粗产物经乙醇重结晶得目标产物1a~1n.

  分别以N-烃基咔唑-3-甲醛^[48]和9, 10-菲醌替代N-烃基吲哚-3-甲醛及苯偶酰N-烃基进行反应得化合物2a~2d、3和4.

  2-(1-乙基-5-溴-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(1a):白色固体, 产率90.5%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.40 (s, 1H, NH), 8.64 (d, J=1.9 Hz, 1H, PyH), 8.11 (s, 1H, PhH), 7.67~7.55 (m, 3H, PhH), 7.55~7.49 (m, 2H, PhH), 7.49~7.37 (m, 4H, PhH), 7.35 (d, J=2.0 Hz, 3H, PhH), 4.25 (q, J=7.2 Hz, 2H, CH₂CH₃), 1.44 (t, J=7.2 Hz, 3H, CH₂CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 143.22, 135.11, 128.89, 127.84, 127.51, 124.87, 124.20, 113.15, 112.69, 106.32, 41.28, 15.67; IR (KBr) v: 3057, 2978, 1598, 1490, 1450, 1409, 1340, 1217, 785, 698; MS (ESI) m/z: 442.4, 444.4 [M+ H]⁺. Anal. calcd for C₂₅H₂₀N₃Br: C 67.88, H 4.56, N 9.50; found C 67.80, H 4.59, N 9.53.

  2-(1-丁基-5-溴-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(1b):浅绿色固体, 产率89.4%. m.p. 264.9~265.9 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.39 (s, 1H, NH), 8.64 (d, J=1.9 Hz, 1H, PhH), 8.08 (s, 1H, PyH), 7.56 (q, J=8.6 Hz, 5H, PhH), 7.47~7.20 (m, 7H, PhH), 4.25 (t, J=6.8 Hz, 2H, CH₂(CH₂)₂CH₃), 1.79~1.65 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂CH₃), 1.29~1.14 (m, 2H, (CH₂)₂CH₂CH₃), 0.91 (t, J=7.3 Hz, 3H, (CH₂)₃CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 143.19, 135.41, 129.13, 128.74, 128.53, 127.41, 124.88, 124.19, 113.12, 112.78, 106.20, 46.09, 32.20, 19.93, 14.01; IR (KBr) v: 3063, 2954, 1600, 1452, 1380, 1341, 767, 697 cm^-1; MS (ESI) m/z: 470.4, 472.4 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₂₇H₂₄N₃Br: C 68.94, H 5.14, N 8.93; found C 68.87, H 5.17, N 8.96.

  2-(1-烯丙基-5-溴-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(1c):浅绿色固体, 产率85.3%. m.p. 279.8~280.3 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.45 (s, 1H, NH), 8.67 (d, J=1.9 Hz, 1H, PyH), 8.07 (s, 1H, PhH), 7.58 (s, 5H, PhH), 7.37~7.11 (m, 7H, PhH), 6.16~6.00 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5.28~5.09 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 4.92 (d, J=5.5 Hz, 2H, CH₂CH=CH₂); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 143.07, 135.43, 134.29, 128.92, 128.55, 127.50, 125.03, 124.26, 117.94, 113.29, 112.95, 106.56, 48.90; IR (KBr) v: 3053, 2900, 1600, 1495, 1462, 1310, 1249, 770, 696 cm^-1; MS (ESI) m/z: 454.4, 456.4 [M+ H]⁺. Anal. calcd for C₂₆H₂₀N₃Br: C 68.73, H 4.44, N 9.25; found C 68.70, H 4.45, N 9.29.

  2-(1-乙基-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(1d):黄绿色固体, 产率92.5%. m.p. 264.2~265.8 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.32 (s, 1H, NH), 8.53~8.46 (m, 1H, PyH), 8.05 (s, 1H, PhH), 7.67~7.51 (m, 5H, PhH), 7.39 (s, 4H, PhH), 7.33~7.15 (m, 4H, PhH), 4.29 (q, J=7.2 Hz, 2H, CH₂CH₃), 1.45 (t, J=7.2 Hz, 3H, CH₂CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 143.88, 136.32, 128.85, 127.53, 126.51, 125.99, 122.38, 122.26, 120.37, 110.42, 106.66, 41.02, 15.75; IR (KBr) v: 3049, 2976, 1596, 1489, 1416, 1340, 1219, 738, 695 cm^-1; MS (ESI) m/z: 364.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₂₅H₂₁N₃: C 82.62, H 5.82, N 11.56; found C 82.70, H 5.79, N 11.51.

  2-(1-烯丙基-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(1e):白色固体, 产率91.4%. m.p. 258.9~259.9 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.36 (s, 1H, NH), 8.56~8.48 (m, 1H, PyH), 8.01 (s, 1H, PhH), 7.68~7.49 (m, 5H, PhH), 7.39 (s, 5H, PhH), 7.22~7.12 (m, 3H, PhH), 6.16~6.02 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5.27~5.11 (m, 2H, CH₂C- H=CH₂), 4.91 (d, J=5.5 Hz, 2H, CH₂CH=CH₂); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 143.73, 136.66, 134.59, 128.89, 127.23, 125.96, 122.51, 122.28, 120.50, 117.73, 110.70, 106.92, 48.72; IR (KBr) v: 3048, 2906, 1598, 1484, 1413, 1339, 1251, 828, 743, 696 cm^-1; MS (ESI) m/z: 376.4 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₂₆H₂₁N₃: C 83.17, H 5.64, N 11.19; found C 83.24, H 5.61, N 11.15.

  2-(1-乙基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(1f):浅绿色固体, 产率82.1%. m.p. 264.3~265.5 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.28 (s, 1H, NH), 8.05~7.99 (m, 2H, PyH), 7.70~7.50 (m, 4H, PhH), 7.49~7.22 (m, 7H, PhH), 6.90 (dd, J=8.9, 2.5 Hz, 1H, PhH), 4.24 (q, J=7.2 Hz, 2H, CH₂CH₃), 3.84 (s, 3H, OCH₃), 1.43 (t, J=7.2 Hz, 3H, CH₂CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 154.56, 144.02, 131.65, 128.86, 127.40, 126.94, 126.49, 112.13, 111.15, 106.20, 104.19, 55.85, 41.16, 15.78; IR (KBr) v: 3063, 2978, 1583, 1485, 1446, 1376, 1335, 1296, 1224, 1181, 802, 766, 693 cm^-1; MS (ESI) m/z: 394.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₂₆H₂₃N₃O: C 79.36, H 5.89, N 10.77; found C 79.30, H 5.91, N 10.83.

  2-(1-烯丙基-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二苯基- 1H-咪唑(1g):浅黄色固体, 产率84.1%. m.p. 241.5~242.9 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.32 (s, 1H, NH), 8.05 (d, J=2.5 Hz, 1H, PyH), 7.96 (s, 1H, PhH), 7.58 (d, J=25.7 Hz, 4H, PhH), 7.39~7.21 (m, 7H, PhH), 6.89~6.79 (m, 1H, PhH), 6.07~5.98 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5.26~5.09 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 4.87 (d, J=5.4 Hz, 2H, CH₂CH=CH₂), 3.84 (s, 3H, CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 154.61, 143.86, 134.66, 131.94, 128.69, 127.68, 126.49, 117.69, 112.24, 111.43, 106.49, 104.22, 55.83, 48.89; IR (KBr) v: 3050, 2946, 1591, 1484, 1443, 1313, 1216, 846, 774, 696 cm^-1; MS (ESI) m/z: 406.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₂₇H₂₃N₃O: C 79.97, H 5.72, N 10.36; found C 80.03, H 5.70, N 10.33.

  2-(1-乙基-5-苯基-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(1h):黄色固体, 产率89.2%. m.p. 264.6~265.7 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.38 (s, 1H, NH), 8.72 (d, J=1.3 Hz, 1H, PyH), 8.09 (s, 1H, PhH), 7.71 (d, J=7.4 Hz, 2H, PhH), 7.66~7.47 (m, 8H, PhH), 7.46~7.21 (m, 7H, PhH), 4.31 (q, J=7.2 Hz, 2H, CH₂CH₃), 1.46 (t, J=7.2 Hz, 3H, CH₂CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 143.74, 142.37, 135.93, 133.10, 129.38, 128.91, 127.43, 127.32, 126.88, 126.47, 121.86, 120.22, 110.96, 107.11, 41.19, 15.81; IR (KBr) v: 3048, 2975, 1592, 1471, 1449, 1401, 1343, 1222, 801, 759, 696 cm^-1; MS (ESI) m/z: 440.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₃₁H₂₅N₃: C 84.71, H 5.73, N 9.56; found C 84.77, H 5.70, N 9.53.

  2-(1-丁基-5-苯基-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(1i):褐色固体, 产率85.6%. m.p. 247.9~248.8 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.36 (s, 1H, NH), 8.73 (s, 1H, PyH), 8.07 (s, 1H, PhH), 7.73~7.68 (m, 2H, PhH), 7.63 (d, J=8.5 Hz, 3H, PhH), 7.56~7.42 (m, 7H, PhH), 7.39~7.30 (m, 4H, PhH), 7.22 (t, J=7.1 Hz, 1H, PhH), 4.27 (t, J=6.8 Hz, 2H, CH₂(CH₂)₂CH₃), 1.82~1.73 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂CH₃), 1.37~1.26 (m, 2H, (CH₂)₂CH₂- CH₃), 0.93 (t, J=7.3 Hz, 3H, (CH₂)₃CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 143.72, 142.38, 136.66, 136.22, 136.19, 133.05, 129.37, 129.12, 128.68, 128.57, 128.11, 127.85, 127.43, 127.32, 126.87, 126.71, 126.38, 121.86, 120.22, 111.03, 107.01, 46.01, 32.29, 9.98, 14.04; IR (KBr) v: 3050, 2952, 1600, 1472, 1401, 1349, 1196, 804, 758, 695 cm^-1; MS (ESI) m/z: 468.6 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₃₃H₂₉N₃: C 84.76, H 6.25, N 8.99; found C 84.70, H 6.27, N 9.03.

  2-(1-丁基-5-对甲基苯基-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二苯基- 1H-咪唑(1j):褐色固体, 产率84.3%. m.p. 277.8~278.9 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.35 (s, 1H, NH), 8.70 (d, J=1.4 Hz, 1H, PyH), 8.05 (s, 1H, PhH), 7.67~7.57 (m, 5H, PhH), 7.55~7.42 (m, 5H, PhH), 7.33~7.24 (m, 5H, PhH), 7.22 (t, J=7.3 Hz, 1H, PhH), 4.27 (t, J=6.8 Hz, 2H, CH₂(CH₂)₂CH₃), 2.36 (s, 3H, CH₃), 1.82~1.71 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂CH₃), 1.30~1.15 (m, 2H, (CH₂)₂CH₂CH₃), 0.93 (t, J=7.3 Hz, 3H, (CH₂)₃CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 143.76, 139.49, 136.62, 136.19, 136.08, 135.98, 133.00, 132.00, 129.97, 129.13, 128.68, 128.57, 128.02, 127.85, 127.40, 127.14, 126.70, 126.39, 121.71, 119.93, 110.95, 106.92, 46.00, 32.29, 21.11, 19.98, 14.05; IR (KBr) v: 3027, 2957, 2924, 1593, 1479, 1339, 1198, 826, 88, 695 cm^-1; MS (ESI) m/z: 482.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₃₄H₃₁N₃: C 84.79, H 6.49, N 8.72; found C 84.71, H 6.53, N 8.76.

  2-(1-乙基-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二(邻羟基苯基)-1H-咪唑(1k):灰色固体, 产率74.8%. m.p. 241.2~242.9 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.61 (s, 1H, H), 12.64 (s, 1H, OH), 9.79 (s, 1H, NH), 8.23~8.16 (m, 1H, PyH), 8.09 (s, 1H, PhH), 7.64~7.58 (m, 1H, PhH), 7.39~7.22 (m, 4H, PhH), 7.14~6.93 (m, 4H, PhH), 6.85 (d, J=8.0 Hz, 1H, PhH), 6.56 (t, J=7.4 Hz, 1H, PhH), 4.29 (q, J=7.2 Hz, 2H, CH₂CH₃), 1.44 (t, J=7.2 Hz, 3H, CH₂CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 156.64, 156.44, 40.76, 136.46, 134.64, 132.46, 130.72, 127.60, 127.22, 125.40, 122.75, 122.59, 120.88, 120.71, 119.68, 118.84, 118.53, 116.97, 116.48, 110.95, 105.20, 41.11, 15.66; IR (KBr) v: 3279, 3085, 2972, 1592, 1454, 1344, 250, 1219, 822, 740, 653 cm^-1; MS (ESI) m/z: 396.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₂₅H₂₁N₃O₂: C 75.93, H 5.35, N 10.63; found C 76.00, H 5.32, N 10.58.

  2-(1-乙基-5-苯基-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二(邻羟基苯基)-1H-咪唑(1m):灰色固体, 产率78.9%. m.p. 307.9~309.2 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.58 (s, 1H, OH), 12.69 (s, 1H, OH), 9.79 (s, 1H, NH), 8.47 (d, J=1.3 Hz, 1H, PyH), 8.11 (s, H, PhH), 7.76~7.67 (m, 3H, PhH), 7.60~7.48 (m, 3H, PhH), 7.43~7.29 (m, 3H, PhH), 7.04~6.93 (m, 4H, PhH), 6.86 (d, J=7.5 Hz, 1H, PhH), 6.56 (t, J=7.1 Hz, 1H, PhH), 4.32 (q, J=7.2 Hz, 2H, CH₂CH₃), 1.46 (t, J=7.2 Hz, 3H, CH₂CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 156.62, 156.48, 142.05, 140.63, 136.03, 134.75, 133.48, 132.48, 130.75, 129.44, 128.01, 127.63, 127.23, 127.07, 125.93, 125.47, 122.87, 122.02, 119.68, 118.83, 118.56, 117.05, 116.50, 111.43, 105.64, 41.28, 15.75; IR (KBr) v: 3330, 3047, 974, 1591, 1457, 1375, 1214, 819, 752, cm^-1; MS (ESI) m/z: 472.5 [M+ H]⁺. Anal. calcd for C₃₁H₂₅N₃O₂: C 78.96, H 5.34, N 8.91; found C 78.89, H 5.36, N 8.95.

  2-(1-丁基-5-对甲基苯基-1H-吲哚-3-基)-4, 5-二(邻羟基苯基)-1H-咪唑(1n):砖红色固体, 产率71.6%. m.p. 209.1~210.2; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.58 (s, H, OH), 12.69 (s, 1H, OH), 9.82 (s, 1H, NH), 8.42 (d, J=1.4 Hz, 1H, PyH), 8.07 (s, 1H, PhH), 7.65~7.55 (m, 3H, PhH), 7.54~7.48 (m, 1H, PhH), 7.34 (t, J=9.0 Hz, 4H, PhH), 7.04~6.95 (m, 4H, PhH), 6.85 (d, J=7.7 Hz, 1H, PhH), 6.56 (t, J=7.5 Hz, 1H, PhH), 4.28 (t, J=6.8 Hz, 2H, CH₂(CH₂)₂CH₃), 2.38 (s, 3H, CH₃), 1.81~1.72 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂CH₃), 1.35~1.25 (m, 2H, (CH₂)₂CH₂- CH₃), 0.92 (t, J=7.3 Hz, 3H, (CH₂)₃CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 156.45, 139.15, 136.24, 136.17, 134.73, 133.40, 130.04, 128.61, 127.62, 127.06, 121.87, 119.69, 118.85, 118.50, 117.05, 111.44, 46.03, 32.18, 21.11, 19.92, 14.01; IR (KBr) v: 3522, 3238, 2956, 1699, 1585, 1460, 1383, 1245, 823, 753; MS (ESI) m/z: 514.6 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₃₄H₃₁N₃O₂: C 79.51, H 6.08, N 8.18; found C 79.45, H 6.11, N 8.22.

  2-(9-乙基-9H-咔唑-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(2a):浅黄色固体, 产率73.7%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.62 (s, 1H, NH), 8.87 (d, J=1.4 Hz, 1H, PhH), 8.28~8.16 (m, 2H, PhH), 7.72 (d, J=8.7 Hz, 1H, PhH), 7.65~7.58 (m, 5H, PhH), 7.53~7.42 (m, 3H, PhH), 7.41~7.31 (m, 3H, PhH), 7.26 (t, J=7.2 Hz, 2H, PhH), 4.49 (q, J=7.0 Hz, 2H, CH₂CH₃), 1.36 (t, J=7.1 Hz, 3H, CH₂CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 147.27, 140.50, 139.98, 135.92, 131.80, 129.10, 128.77, 128.03, 127.61, 126.89, 126.52, 124.08, 122.74, 122.71, 122.04, 120.75, 119.61, 117.71, 109.87, 109.73, 7.58, 14.27; IR (KBr) v: 3061, 2971, 1600, 1485, 1450, 1383, 1337, 1229, 812, 769, 697; MS (ESI) m/z: 414.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₂₉H₂₃N₃: C 84.23, H 5.61, N 10.16; found C 84.19, H 5.62, N 10.19.

  2-(9-丁基-9H-咔唑-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(2b):浅黄色固体, 产率68.3%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.63 (s, 1H, NH), 8.86 (d, J=1.5 Hz, 1H, PhH), 8.28~8.12 (m, 2H, PhH), 7.72 (d, J=8.7 Hz, 1H, PhH), 7.68~7.58 (m, 3H, PhH), 7.58~7.42 (m, 5H, PhH), 7.41~7.29 (m, 3H, PhH), 7.25~7.16 (m, 2H, PhH), 4.44 (t, J=6.9 Hz, 2H, CH₂(CH₂)₂CH₃), 1.79~1.65 (m, 2H, CH₂CH₂CH₂CH₃), 1.34~1.22 (m, 2H, (CH₂)₂CH₂- CH₃), 0.91 (t, J=7.4 Hz, 3H, (CH₂)₃CH₃); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 147.27, 140.97, 140.46, 137.28, 135.92, 131.80, 129.12, 128.78, 128.65, 128.04, 127.61, 126.88, 126.49, 124.05, 122.60, 122.58, 121.99, 120.69, 119.57, 117.66, 110.06, 109.93, 42.64, 31.26, 20.30, 14.24; IR (KBr) v: 3058, 2957, 1600, 1485, 1449, 1379, 1213, 813, 749, 697; MS (ESI) m/z: 442.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₃₁H₂₇N₃: C 84.32, H 6.16, N 9.52; found C 84.40, H 6.13, N 9.47.

  2-(9-烯丙基-9H-咔唑-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(2c):浅黄色固体, 产率69.3%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.65 (s, 1H, NH), 8.88 (d, J=1.3 Hz, 1H, PhH), 8.27~8.15 (m, 2H, PhH), 7.69 (d, J=8.7 Hz, 1H, PhH), 7.61 (d, J=8.2 Hz, H, PhH), 7.53~7.42 (m, 3H, PhH), 7.41~7.19 (m, 5H, PhH), 6.03~5.94 (m, 1H, CH₂CH=CH₂), 5.21~5.10 (m, 2H, CH₂CH=CH₂), 5.10~4.97 (m, 2H, CH₂CH=CH₂); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 147.21, 140.94, 140.41, 135.89, 133.57, 129.12, 128.75, 28.04, 127.61, 126.91, 126.55, 124.08, 122.70, 122.25, 120.73, 119.83, 117.69, 117.01, 110.23, 110.07, 45.17; IR (KBr) v: 3056, 1601, 1485, 447, 1221, 813, 722, 696; MS (ESI) m/z: 426.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₃₀H₂₃N₃: C 84.68, H 5.45, N 9.87; found C 84.65, H 5.47, N 9.88.

  2-(9-苄基-9H-咔唑-3-基)-4, 5-二苯基-1H-咪唑(2d):浅黄色固体, 产率76.4%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 12.64 (s, 1H, NH), 8.89 (d, J=1.4 Hz, 1H, PhH), 8.25~8.17 (m, 2H, PhH), 7.77 (d, J=8.7 Hz, 1H, PhH), 7.67 (d, J=8.3 Hz, 1H, PhH), 7.63~7.53 (m, 4H, PhH), 7.52~7.43 (m, 3H, PhH), 7.42~7.28 (m, 5H, PhH), 7.28~7.19 (m, 5H, PhH), 5.73 (s, 2H, CH₂); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 147.17, 141.11, 140.63, 138.16, 129.09, 128.74, 127.79, 127.61, 127.23, 126.69, 124.22, 122.81, 122.40, 120.79, 119.98, 117.76, 110.38, 110.22, 46.15; IR (KBr) v: 3057, 1601, 1486, 1449, 1379, 1213, 813, 749, 694; MS (ESI) m/z: 476.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₃₄H₂₅N₃: C 85.87, H 5.30, N 8.84; found C 85.79, H 5.34, N 8.87.

  2-(1-苄基-1H-吲哚-3-基)-1H-菲并[9, 10-d]咪唑(3):深褐色固体, 产率85.4%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (300 MHz, MSO-d₆) δ: 13.17 (s, 1H, NH), 8.87 (d, J=7.7 Hz, 2H, PhH), 8.80~8.75 (m, 1H, PyH), 8.69 (d, J=8.1 Hz, 1H, PhH), 8.52~8.36 (m, 1H, PhH), 8.31 (s, 1H, PhH), 7.79~7.72 (m, 2H, PhH), 7.67~7.59 (m, 3H, PhH), 7.42~7.27 (m, 7H, PhH), 5.62 (s, 2H, CH₂); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 147.28, 138.28, 137.05, 129.21, 128.73, 128.10, 127.68, 127.41, 126.25, 125.17, 123.01, 122.53, 121.05, 111.07, 107.37, 49.87; IR (KBr) v: 3044, 2967, 1591, 1451, 1332, 1232, 843, 740, 694; MS (ESI) m/z: 424.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₃₀H₂₁N₃: C 85.08, H 5.00, N 9.92; found C 85.15, H 4.98, N 9.87.

  2-(9-苄基-9H-咔唑-3-基)-1H-菲并[9, 10-d]咪唑(4):深褐色固体, 产率86.5%. m.p. 213.5~214.3; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 13.47 (s, 1H, NH), 9.11 (d, J=1.4 Hz, 1H, PhH), 8.88 (d, J=8.3 Hz, 2H, PhH), 8.64 (d, J=7.7 Hz, 2H, PhH), 8.44 (dd, J=8.6, 1.6 Hz, 1H, PhH), 8.33 (d, J=7.6 Hz, 1H, PhH), 7.91 (d, J=8.7 Hz, 1H, PhH), 7.80~7.62 (m, 5H, PhH), 7.55~7.48 (m, 1H, PhH), 7.37~7.21 (m, 6H, PhH), 5.77 (s, 2H, CH₂); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 150.89, 141.22, 138.08, 129.12, 127.91, 127.83, 127.52, 127.26, 126.88, 125.49, 25.09, 124.40, 123.00, 122.81, 122.37, 122.25, 120.95, 120.20, 118.85, 110.50, 46.23; IR (KBr) v: 3054, 2966, 1601, 1453, 1380, 1207, 808, 749, 695; MS (ESI) m/z: 474.5 [M+H]⁺. Anal. calcd for C₃₄H₂₃N₃: C 86.23, H 4.90, N 8.87; found C 86.29, H 4.89, N 8.82.

  3.3   光谱性能测试

  3.3.1   紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱的测定

  准确称取待测样品, 定容配成100 mL 1.0×10^-4 mol/L母液; 准确移取母液, 定容稀释配成1.0×10^-5 mol/L测试液.于室温下分别测定各化合物测试液的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱.

  3.3.2   光谱pH滴定

  参照文献[49]方法, 在10 mL容量瓶中加入5 mL合成化合物的乙醇溶液(浓度为1.0×10^-4 mol/L), 用不同pH的BR缓冲溶液稀释至刻度, 使溶液(缓冲溶液- EtOH, V:V=1:1)中探针化合物的浓度为5.0×10^-5 mol/L, 溶液稳定2 min后, 测试溶液的pH值, 并对溶液进行荧光光谱测试.

  3.3.3   抗金属离子干扰性能测试

  参照文献[49]方法, 1.0×10^-4 mol/L的探针2d或4的乙醇溶液中加入相应的金属离子水溶液, 使溶液(H₂O-EtOH, V:V=1:1)中探针化合物的浓度为5.0×10^-5 mol/L, 且金属离子的浓度为探针浓度的10 equiv., 对溶液进行荧光光谱测试, 观察各金属离子对荧光强度的影响.

  3.4   电化学性能的测试

  参照文献[45]方法, 用DY2300电化学工作站测试一定条件下探针在乙腈溶液中的氧化还原行为.测试使用三电极工作体系, 以玻璃碳电极为工作电极, 饱和甘汞电极为参比电极, 铂电极作为对电极.将样品用乙腈配成浓度为1.0×10^-5 mol/L溶液, 支持电解质为0.1 mol•L^-1六氟磷酸四丁基铵(TBAPF₆), 以0.05 mV/s的速度在-0.5~1.7 V电位范围内进行扫描.

  3.5   细胞培养及成像

  参照文献[50]方法, 收集处于对数生长期的人源乳腺癌(MCF-7)细胞, 加入到含有10% FBS和1%双抗的高糖培养基(DMEM)中, 细胞消化计数后按照5×10⁵个/孔, 每孔500 μL种板于24孔板中, 在37 ℃, 5% CO₂细胞培养箱中培养贴壁24 h; 吸弃培养基, 每孔注入500 μL探针化合物浓度为1.0×10^-5 mol/L的DMEM培养基溶液, 置于培养箱中继续培养1 h.吸弃上层溶液, 用新鲜DMEM培养基洗涤细胞三次, 分别加入不同pH值的BR缓冲溶液培养15 min.将孔板中细胞用DMEM培养基洗涤三次, 然后置于荧光显微镜下, 在绿光区波段(λ_ex=450~490 nm)光激发下, 观察荧光成像结果.

  辅助材料(Supporting Information) 标题化合物的¹HNMR、¹³C NMR、循环伏安曲线、紫外可见吸收及荧光发射谱图等.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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  图 1  红荧光蛋白mCherry、EBFP2和EosFP的荧光团

  Figure 1  Fluorophores from red-emitting proteins of mCherry, EBFP2 and EosFP

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  图 2  所合成化合物的结构

  Figure 2  Structures of the synthesized compounds

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  图 3  化合物在乙醇中的荧光发射光谱

  Figure 3  Fluorescence spectra of compounds in ethanol

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  图 4  探针2d在EtOH/缓冲溶液中的荧光光谱和pH滴定曲线

  Figure 4  Fluorescence spectra and pH titration curves of probe 2d in EtOH/buffer solutions

  Inset shows a pH-dependent plot of the emission at λ_max (λ_ex＝304 nm)

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  图 5  探针4在EtOH/缓冲溶液中的荧光光谱和pH滴定曲线

  Figure 5  Fluorescence spectra and pH titration curves of probe 4 in EtOH/ buffer solutions

  Inset shows (a) a pH-dependent plot of the emission at λ_max and (b) plot of the emissions ratio of probe 4 at 466 and 406 nm (I₄₆₆/I₄₀₆) vs pH (λ_ex＝308 nm)

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  图 6  探针2d和4对H⁺/OH^-可能的传感机制以及在紫外光(λ_ex=365 nm)照射下荧光的变化

  Figure 6  Probable sensing mechanism of the probes 2d and 4 responded to H⁺/OH^-and the corresponding changes of luminescence under UV radiation (λ_ex=365 nm)

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  图 7  探针2d和4 (50 μmol•L^-1)在不同金属离子(500 μmol• L^-1) H₂O-EtOH中荧光强度的变化

  Figure 7  Emission changes of probes 2d and 4 (50 μmol•L^-1) in various metal ions (500 μmol•L^-1) H₂O-EtOH

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  图 8  探针2d和4作用下MCF-7细胞在不同pH缓冲液中的荧光显微分析

  Figure 8  Fluorescence microscopy analysis of MCF-7 cells infected by probes in various pH buffers

  a, b, c, d are the fluorescence images infected by probe 2d; e, f, g, h are the bright fields; i, j, k are the fluorescence images infected by probe 4; m, n, o are the bright fields

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  表 1  溶剂的选择及用量、温度和反应物配比对反应的影响^a

  Table 1.  Effects of selection and amount of solvents, temperatures and molar ratio of reagents on the reaction

  Entry	Solvent (mL)	n(aldehyde): n(benzil)	Temp./℃	Time/h	Yieldb/%
  1	CH3OH (20)	1:1	Reflux	12	Trace
  2	C2H5OH (30)	1:1	Reflux	12	—
  3	C2H5OH (25)c	1:1	Reflux	12	Trace
  4	HOAc (4)	1:1	100	12	37.6
  5	HOAc (5)	1:1	100	10	65.4
  6	HOAc (6)	1:1	100	12	58.5
  7	HOAc (5)	1:1	90	12	43.2
  8	HOAc (5)	1:1	110	7	40.6
  9	HOAc (5)	1:1.1	100	8	89.2
  10	HOAc (5)	1:1.2	100	8	90.0
  11	HOAc (5)	1.1:1	100	8	65.8
  a The amount of NH4OAc is 6 mmol (excess); b Isolated yields by recrystallization in EtOH; c 5 mL HOAc added.

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  表 2  含氮杂环多芳基咪唑衍生物的合成及其光谱数据^a

  Table 2.  Synthesis and Optical Data of multi-aryl imidazoles containing nitrogen heterocycly

  Entry	R1	R2	R3	Product	Time/h	Yieldb/%	UV-Vis absorptionc		Emissionc, d λem/nm
  							λmax/nm	ε/(mol•L-1•cm-1)
  1	H	Br	C2H5	1a	5.5	90.5	277, 320	27600 (277 nm)	406
  2	H	Br	n-Bu	1b	5	89.4	276, 320	22300 (276 nm)	404
  3	H	Br	Allyl	1c	5.5	85.3	275, 313	26900 (275 nm)	404
  4	H	H	C2H5	1d	4	92.5	275, 314	18000 (314 nm)	412
  5	H	H	Allyl	1e	5	91.4	276, 312	20700 (312 nm)	410
  6	H	OCH3	C2H5	1f	4	82.1	276, 320	24400 (276 nm)	414
  7	H	OCH3	Allyl	1g	5	84.1	278, 320	29000 (278 nm)	414
  8	H	Ph	C2H5	1h	7	89.2	266, 320	44500 (266 nm)	410
  9	H	Ph	n-Bu	1i	7	85.6	264, 317	43800 (264 nm)	409
  10	H	p-CH3C6H4	n-Bu	1j	8	84.3	267, 320	50400 (267 nm)	410
  11	OH	H	C2H5	1k	5.5	74.8	278, 320	21700 (320 nm)	413
  12	OH	Ph	C2H5	1m	6	78.9	267, 322	38000 (267 nm)	410
  13	OH	p-CH3C6H4	n-Bu	1n	7	71.6	268, 320	44100 (268 nm)	452
  14	-	-	C2H5	2a	2	73.7	305	50600	399
  15	-	-	n-Bu	2b	2.5	68.3	305	44600	398
  16	-	-	Allyl	2c	2	69.3	305	51600	397
  17	-	-	CH2Ph	2d	3	76.4	305	48300	398
  18	-	-	-	3	8	85.4	262, 330	50600 (262 nm)	412
  19	-	-	-	4	8	86.5	262, 308	63300 (262 nm)	400
  a Reaction conditions: 1 mmol of aldehyde, 1.1 equiv. of benzyl or 9, 10-phenanthraquinone, 6 equiv. of NH4OAc, and 5 mL of HOAc, at 100 ℃ under air; b Isolated yields by recrystallization in EtOH; c data tested in ethanol (1.0×10-5 mol/L) at 25 ℃; d excited at 320 nm for compounds 1 and 3, and at 310 nm for compounds 2 and 4.

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  表 3  探针化合物的电化学性质

  Table 3.  Electrochemical Properties of probe compounds

  Entry	Ega/eV	Eox/V	HOMOb/eV	LUMOc/eV
  2d	3.09	0.91	-5.65	-2.56
  2d-H+	3.19	0.78	-5.52	-2.33
  3	3.20	0.79	-5.53	-2.33
  3-H+	3.13	0.79	-5.53	-2.40
  4	3.07	0.81	-5.55	-2.48
  4-H+	3.23	0.79	-5.53	-2.30
  a Estimated from the absorption spectra in ethanol; b EHOMO=-(4.74+Eox); c ELUMO=EHOMO+Eg.

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