核酸适配体在癌症诊断中的研究进展

郭圆斌 栗坤

引用本文: 郭圆斌, 栗坤. 核酸适配体在癌症诊断中的研究进展[J]. 化学通报, 2021, 84(1): 40-46. shu
Citation:  Yuanbin Guo, Kun Li. Research Progress of Aptamers in Cancer Diagnosis[J]. Chemistry, 2021, 84(1): 40-46. shu

核酸适配体在癌症诊断中的研究进展

    通讯作者: 栗坤  女, 博士, 教授, 主要从事血清肿瘤标志物核酸适配体的筛选及其检测技术的研究。E-mail: likun@ysu.edu.cn
  • 基金项目:

    河北省重点研发项目 19272401D

摘要: 核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)从体外合成的寡核苷酸文库中筛选得到的短的寡核苷酸分子(ssDNA或RNA)。核酸适配体能够通过折叠成特定的空间结构与靶标分子进行特异性结合,与抗体相比,适配体具有高亲和力、易修饰、低成本、易于合成和低免疫原性等优势,可以针对细胞、蛋白质、组织、生长因子进行癌症生物标志物的研究。作为一种新的诊断方法,其在分子诊断领域具有广阔的应用前景。本文综述了近年来核酸适配体在肺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌诊断中的应用研究,阐明了核酸适配体作为分子探针从细胞的检测到血清的检测所扮演的作用。

English

  • 癌症是一种全球性的恶性肿瘤疾病,虽然在一定程度上可以预防和控制癌症,但仍然存在许多挑战,包括早期发现的困难和化疗的副作用。核酸适配体作为一种新型的分子探针,并作为一种稳定、有效、经济的生物识别元件,由于独特的分子识别模型,在癌症的早期诊断中起到了很好的作用;纳米粒子的出现为核酸适配体提供了一种辅助作用。本文介绍核酸适配体在癌症诊断中的应用进展。

    核酸适配体,即化学抗体,是一类从指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment,SELEX)进化而来的短DNA或RNA寡核苷酸[1~3],通过形成一些独特的结构,如茎(Stem)、环(Loop)、发夹(Hairpin)、隆起(Bulge)、假结(Pseudoknot)和G-四链体(G-quadruplex),识别各种靶标分子[4, 5]。纳米粒子的出现为癌症早期诊断提供了一种新手段[6, 7],而适配体作为一种新型的识别元件,具有较高的亲和力和选择性,此外,作为一种与抗体相媲美的新型识别分子,正日益受到人们的关注[8, 9]。与抗体不同的是,适配体具有制备简单、修饰容易、稳定性高等独特的优点[10],其不仅能与小分子结合,甚至能与整个生物体结合,并且与靶标结合就有纳摩尔量级的解离常数[11];第一个筛选得到的核酸适配体是与小分子结合的[12]。此外,核酸适配体可以高效识别细胞[13]、蛋白质[14, 15]、组织[16]和寄生虫[17]等特异性靶点,并且被广泛应用于分子传感[18]、细胞识别[19]和靶向给药[20, 21]等领域。

    肺癌是发病率和死亡率增长最快、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[22],由于缺乏简单的疾病筛查方法进行早期诊断,大多数肺癌患者就诊时已属中晚期[23],这凸显了肺癌早期检测的重要性。核酸适配体作为早期诊断的工具,在肺癌诊断中有很多应用。

    非小细胞肺癌是最典型的一种肺癌。有研究者通过体内SELEX鉴定了一种靶向非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的体内转录RNA适配体(trans-RA16)[24],为了验证该适配体的特异性,他们将化学合成的适配体(syn-RA16)与体内转录的适配体进行比较(如图 1所示)[25],发现体内转录的RNA适配体比化学合成的适配体亲和力更高。与trans-RA16相似,syn-RA16能够以剂量依赖的方式抑制NCI-H460细胞的活性,syn-RA16的IC50值为118.4nmol/L (n=4),trans-RA16的IC50值为105.7nmol/L(n=4)。对syn-RA16的进一步研究表明,其可内化NCI-H460细胞,抑制NCI-H460细胞生长。此外,他们还鉴定一段反式RA16(S3)的截断片段,该片段在一定浓度能够抑制细胞的生长率。

    图 1

    图 1.  trans-RA16或syn-RA16适配体对NCI-H460细胞抑制活性[25]

    (A)标准细胞计数Kit-8 (CCK-8)分析NCI-H460细胞;(B)显微镜分析;(C) IC50曲线;(D) 标准细胞计数Kit-8 (CCK-8)分析HeLa细胞

    Figure 1.  Inhibitory activity of trans-RA16 or syn-RA16 aptamers towards NCI-H460 cells[25]

    Zamay等[26]选择并鉴定了DNA适配体作为与手术后组织来源的肺腺癌细胞结合的特异性亲和探针。该适配体是针对天然状态和构象的肺癌细胞生物标志物而产生的,可以为个体患者提供肿瘤特异性的适配体,并在抗癌治疗期间进行多次合成,从而开辟了个性化诊断的可能性。腺苷是一种潜在的肺癌监测生物标志物,Zhou等[27]研究表明,核酸适配体与纳米金粒子结合可以提高对腺苷的靶向性。高密度脂蛋白结合蛋白(HDLBP)被鉴定为靶向小细胞肺癌SCLC的一种新的蛋白生物标志物[28],HDLBP适配体通过与HDLBP结合,抑制SCLC细胞的增殖、转移和G1/S细胞周期转变,该适配体可作为一种有前景的强效核苷酸药物用于SCLC治疗。半乳糖蛋白-1(Gal-1)是在肺癌中表达的一种蛋白,Yao等[29]开发了一种针对Gal-1的DNA适配体(AP-74 M-545),该适配体能够与Gal-1高亲和力结合。CD45是Gal-1在T细胞上的主要受体和凋亡介导因子,AP-74 M-545可以通过阻断Gal-1与CD45的结合,抑制T细胞凋亡。此外,针对未知目标的适配体开始被应用,一种用于检测肺癌相关蛋白的传感器可以实现肺癌患者血浆中癌相关靶点的检测[30]。用于人类肺癌成像的荧光探针也在不断被开发[31],研究表明,适配体在缓冲液和血清中能够特异性靶向非小细胞肺癌[32]。这些适配体的研究为肺癌的诊断提供了一种新方法。

    胃癌在整个世界范围内具有较高的发病率和致死率,是全世界第二大致死的癌症,在我国北部地区发病比较严重[33]。尽管诊断方法有所改进,但迄今为止尚未实现早期检测,而胃癌的早期诊断可以显着提高患者的治愈率。

    准确评估肿瘤标志物对胃癌的诊断分析至关重要。上皮细胞黏附分子(EpCAM)被认为是一种肿瘤干细胞(CSC)生物标志物,也是针对CSC进行适体选择的最有希望的靶标之一。Alshaer等[34]采用Cell-SELEX技术筛选到可与EpCAM蛋白特异性结合的ssDNA适配体。使用固定在磁珠上的EpCAM测量了Ep1对EpCAM蛋白的结合亲和力,表观亲和力为118nmol/L。该适配体可作为靶向药物递送的有吸引力的配体和鉴定癌细胞的显像剂。miRNA的异常表达通常与肿瘤发生、转移和进展有关。其中,miRNA-21在大多数癌细胞中过表达。Qian等[35]设计了由一对适配体功能化的金纳米粒子探针组成的二元系统,以实现细胞内miRNA-21的特异性识别和成像,并具有诱导细胞凋亡的治疗作用。有关核蛋白特异性核酸适配体NCL-Apt和miRNA let-7d组成的嵌合体对胃癌细胞中JAK2表达水平和活性的影响也在不断深入研究中[36]。2019年,Li等[37]开发了一种检测低分化胃癌的分子成像探针。通过SELEX过程(如图 2所示)获得了4个特异性的胃癌血清适配体Seq-3、Seq-6、Seq-19和Seq-54,其Kd值分别为128±26.3、149±23.6、232±44.2、202±25.6 nmol/L,这些适配体能明确区分正常血清与其他癌症血清,因此,这些高亲和力的DNA核酸适配体可作为胃癌诊断的有前途的分子探针。

    图 2

    图 2.  胃癌全血清消减SELEX过程示意图[37]
    Figure 2.  Schematic of the whole-serum subtractive SELEX process for gastric cancer serum[37]

    外泌体是带有分子信息的膜纳米囊,可反映其亲代细胞的生物学和遗传特征[38]。大量研究已经证实细胞外泌体具有作为非侵入性癌症生物标志物的潜力。Huang等[39]利用分支滚动环扩增(BRCA)技术筛选到靶向外泌体的适配体,其检出限为4.27×104外泌体/mL。该方法成功用于检测实际胃癌患者血浆中的外泌体,具有临床应用的潜力。

    结直肠癌(CRC)是世界上第三大常见和致命的癌症[40],全球每年约有100万新发病例和60万例死亡。结直肠癌早期很少有明显的症状[41],并且早期诊断通常是侵入性的,可能伴随着疼痛,因此及早发现肿瘤标志物非常有实际意义。

    Maimaitiyiming等[42]利用Cell-SELEX方法筛选得到DNA适配体ApC1,其可选择性靶向结直肠癌Caco-2细胞并高亲和力,在未来的研究中还可作为结直肠癌靶向药物递送的最佳候选者。Zhao等[43]研究表明,使用终端去氧核苷酸转移酶(TdT)启动的分子信标(MBs)排列荧光适配体探针(标记为TMAP)可以监测并在复杂样品中检出LoVo细胞。他们[44]还开发了一种基于阳离子脂质体的纳米粒子,该纳米粒子负载了miR-139-5p并用EpCAM适配体进行表面修饰,其可用于大肠癌的靶向治疗。Li等[45]利用单壁碳纳米管辅助技术筛选得到特异性较强的核酸适配体Seq-2,其可以牢固地结合结直肠癌血清而几乎不结合健康血清。因此,适配体Seq-2具有开发肿瘤诊断试剂盒和检测血清中未知的大肠癌肿瘤标志物的巨大潜力。Zhou等[46]开发了一种基于个人血糖仪(PGM)的便携式结肠直肠癌检测策略(如图 3所示)。使用抗EpCAM涂层磁珠(MBs)作为捕获探针以富集癌细胞,使用核酸适配体修饰和负载有转化酶的氧化石墨烯(GO)作为报告葡萄糖信号的探针,检出限可低至560个细胞,并具有良好的检测特异性,在临床诊断中具有很好的前景。更重要的是,该方法可以实现在室温下的结直肠癌细胞检测,无需任何昂贵和大规模的仪器,而只需一个便携式PGM。因此,这种便携式检测方法在结直肠癌细胞的即时检测方面具有很大的潜力。

    图 3

    图 3.  使用便携式PGM检测结直肠癌细胞方法示意图[46]
    Figure 3.  Schematic representation of the portable detection method for colorectal cancer cells using a PGM[46]

    乳腺癌是女性中最常被诊断出的癌症[47, 48],是公认的对全球女性健康和生命的严重威胁。因此,开发一种早期诊断乳腺癌的方法至关重要。循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTC)已用于肿瘤的诊断和预后[49],但是CTC浓度极低,很难在外周血中直接检测到。许多现有检测方法存在需要昂贵的标记物或操作复杂等缺点。Li等[50]利用核酸适配体构建了一种无标记、无酶、敏感监测乳腺癌中CTC的方法。如图 4所示,利用乳腺癌细胞特异性适配体和互补单链DNA进行靶标检测,当靶细胞存在时,适配体与CTC结合并释放P1,从而触发链置换放大,这一过程产生了三向连接结构DNA,其特定易位信号可通过纳米孔测序法所鉴定。该方法对肿瘤细胞的检测限为5个,还可以进一步降低,并且具有很高的回收率。

    图 4

    图 4.  基于适配体介导的扩增纳米孔传感器检测乳腺癌患者血清中CTCs的方案[50]
    Figure 4.  The scheme of detection of CTCs in serum from breast cancer patients using the nanopore sensor on the basis of aptamer-mediated amplification[50]

    乳腺癌患者中人表皮生长因子2受体(HER2)会大量表达[51],因此HER2成为乳腺癌的研究热点。Borghei等[52]设计了一种纳米金修饰的核酸适配体靶向细胞/肿瘤结构,它可以在紫外线照射下高效地实现HER2阳性细胞/肿瘤靶向成像,此外,基于金纳米粒子的催化活性,他们开发了一种无标记量子点系统,可用于识别HER2阳性细胞/肿瘤,实现对HER2进行早期诊断。为了提高该系统的敏感性,Mohammadinejad等[53]设计了一种基于双适体-纳米粒子共轭复合物(DANP)体系,其由粘蛋白(MUC1)特异性适配体结合金纳米粒子(MUC1 apt-GNPs)以及ATP适配体结合CdTe量子点(ATP apt-qds)组成,可实现MCF-7细胞的特异性检测和可视化。血清中HER2的检测有助于乳腺癌的临床分子诊断[54],杂交链式反应和质谱联用为HER2的监测提供了一种简单、准确、定量的方法[55]。随着研究的不断深入,外泌体[56]也逐渐成为一种非侵入性肿瘤标志物,因此对外泌体的分析也为癌症的诊断提供了一种新思路。An等[57]报道的基于主-客体识别的磁介导电化学传感器可用于同时分析乳腺癌外泌体蛋白。首先利用CD63适配体修饰的磁珠捕获外泌体,分别用MUC1、HER2、EpCAM和CEA适配体修饰二氧化硅纳米颗粒(SiO2 NPs),以鉴定特定的外泌体蛋白质,并修饰上一种二茂铁衍生物作为信号单元。其可敏感性地检测了不同乳腺癌细胞上的4种肿瘤标志物(MCF-7、SH-BR-3、MDA-MB-231和BT474)来源的外泌体。由此可见,核酸适配体在外泌体临床诊断中具有很大的潜力。

    前列腺癌是老年男性最常见的泌尿系统恶性肿瘤,是仅次于肺癌和结直肠癌的导致老年男性患者死亡的第三大癌症死亡原因。前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)是前列腺癌诊断临床中应用最为广泛的血清标志物,其对前列腺癌有很强的预测价值,但也存在假阳性率过高的缺陷。因此需要更多的生物学标志物来辅助进行前列腺癌患者的诊断以及预后的预测。

    RNA适配体A4能够特异性地结合到前列腺癌细胞上[58],在其末端添加脱氧核糖核苷酸,可以更稳定地应对RNA酶污染[59],因此,mA4更适合于前列腺癌的临床应用,具有开发作为前列腺癌诊断系统的潜力。前列腺特异性膜抗原(PSMA)是与前列腺癌和大多数实体瘤的新脉管系统相关的特征明确的肿瘤标志物。Ptacek等[60]开发的PSMA特异性配体可将成像剂或治疗剂递送给癌细胞。Kim等[61]使用双适体开发了一种能够早期诊断前列腺癌的快速适体传感器,该双适体由PSA适体和血红素适体组成,并由5个腺嘌呤相连接。固定在顺磁珠表面的双适体能够在室温下与人血清中的PSA竞争性结合,检出限可低至0.1ng/mL。Ibau等[62]开发了一种叉指电极生物传感器(如图 5所示),其可通过法拉第电化学阻抗谱(EIS)模式定量PSA,检测范围0.5~5000 ng/mL,血清中PSA的检测限为0.51ng/mL。此外,该传感器在血清中的检测范围包括4ng/mL的临床阈值和4~10 ng/mL的关键诊断“灰色区域”。并且,该传感器方案具有作为便携式前列腺癌生物传感器的巨大潜力,也可以作为生物分子传感的通用平台,具有多功能性。

    图 5

    图 5.  采用叉指电极生物传感器检测PSA示意图[62]
    Figure 5.  Schematic representation of the detection method for PSA using a single-masked gold interdigitated triple-microelectrodes biosensor[62]

    核酸适配体作为一种分子探针,目前已经在肺癌、胃癌、结直肠癌等癌症方面有了很广泛的应用(表 1),本文阐明了核酸适配体作为探针从细胞检测到血清检测中的作用,证实核酸适配体作为一种靶向工具,能够与纳米材料的复合物结合应用于癌症肿瘤标志物的识别,为癌症的早期诊断提供了可能。但是目前核酸适配体在实际应用方面还有很多问题需要克服,例如,核酸适配体相对分子质量和体积均较小,极易被降解,可从肾脏被过滤掉,影响其在组织内快速分布,从而导致其在体内诊断的应用受限。因此,在实际应用过程中需要对核酸适配体不断修饰与改造,在保证不影响其特异性的前提下,尽可能使其体积缩小。此外,核酸适配体作为一种核酸分子,对其毒性研究实验很少,需不断对其在体内等方面的毒性深入研究。

    表 1

    表 1  核酸适配体在癌症诊断中的应用
    Table 1.  Application of aptamers in cancer diagnosis
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    癌症类型 核酸适配体 识别靶标 参考文献
    肺癌 syn-RA16 NCI-H460 [25]
    AP-74 M-545 Galectin-1 [29]
    LC-18 血浆相关蛋白 [30]
    LC-17, 18, 110, 183, 224 血清CTCs [26]
    S6 A549 [31]
    胃癌 PDGC21-T 胃癌组织 [19]
    NCL-Apt JAK-2 [36]
    Seq-3, Seq-6, Seq-19, Seq-54 血清 [37]
    Aptamer 外泌体 [39]
    Ep1 EpCAM [34]
    结直肠癌 ApC1 Caco-2 [42]
    W3 LoVo [43]
    Seq-2 血清 [45]
    乳腺癌 HCR HER2阳性细胞 [52]
    P1 CTCs [50]
    RNA aptamer 血清HER2 [54]
    MUCI 外泌体 [57]
    前列腺癌 PSA-aptamer/hemin aptamer 血清PSA [61]
    Wy5a PC-3 [62]
    A9g PSMA [60]

    相信随着SELEX技术的不断进步与发展,核酸适配体所存在的缺陷终能被逐一解决,其优势也将日益凸显。充分利用核酸适配体的靶向识别能力,将其与纳米粒子等复合材料结合,实现多手段、多层面、多方法联合检测,核酸适配体必将在分子诊断领域发挥更加重要的作用。


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  • 图 1  trans-RA16或syn-RA16适配体对NCI-H460细胞抑制活性[25]

    Figure 1  Inhibitory activity of trans-RA16 or syn-RA16 aptamers towards NCI-H460 cells[25]

    (A)标准细胞计数Kit-8 (CCK-8)分析NCI-H460细胞;(B)显微镜分析;(C) IC50曲线;(D) 标准细胞计数Kit-8 (CCK-8)分析HeLa细胞

    图 2  胃癌全血清消减SELEX过程示意图[37]

    Figure 2  Schematic of the whole-serum subtractive SELEX process for gastric cancer serum[37]

    图 3  使用便携式PGM检测结直肠癌细胞方法示意图[46]

    Figure 3  Schematic representation of the portable detection method for colorectal cancer cells using a PGM[46]

    图 4  基于适配体介导的扩增纳米孔传感器检测乳腺癌患者血清中CTCs的方案[50]

    Figure 4  The scheme of detection of CTCs in serum from breast cancer patients using the nanopore sensor on the basis of aptamer-mediated amplification[50]

    图 5  采用叉指电极生物传感器检测PSA示意图[62]

    Figure 5  Schematic representation of the detection method for PSA using a single-masked gold interdigitated triple-microelectrodes biosensor[62]

    表 1  核酸适配体在癌症诊断中的应用

    Table 1.  Application of aptamers in cancer diagnosis

    癌症类型 核酸适配体 识别靶标 参考文献
    肺癌 syn-RA16 NCI-H460 [25]
    AP-74 M-545 Galectin-1 [29]
    LC-18 血浆相关蛋白 [30]
    LC-17, 18, 110, 183, 224 血清CTCs [26]
    S6 A549 [31]
    胃癌 PDGC21-T 胃癌组织 [19]
    NCL-Apt JAK-2 [36]
    Seq-3, Seq-6, Seq-19, Seq-54 血清 [37]
    Aptamer 外泌体 [39]
    Ep1 EpCAM [34]
    结直肠癌 ApC1 Caco-2 [42]
    W3 LoVo [43]
    Seq-2 血清 [45]
    乳腺癌 HCR HER2阳性细胞 [52]
    P1 CTCs [50]
    RNA aptamer 血清HER2 [54]
    MUCI 外泌体 [57]
    前列腺癌 PSA-aptamer/hemin aptamer 血清PSA [61]
    Wy5a PC-3 [62]
    A9g PSMA [60]
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  • 发布日期:  2021-01-18
  • 收稿日期:  2020-07-11
  • 接受日期:  2020-09-02
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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