English

• 生物酶、抗体等生物试剂的化学本质都是蛋白质，其结构和性质容易受到物理和化学等环境因素的影响，在高温、强酸强碱、电磁波、光照等条件下，会导致其天然的立体结构或肽键形态遭到破坏和改变，从而导致蛋白质变性^{[1, 2]}。蛋白质变性后生物活性将大大降低或完全丧失，不能完成催化或临床治疗疾病的目的。寻求一些有效的方法保持蛋白质功能和结构的稳定性是亟需解决的关键问题之一。

  两性离子聚合物具有优异的生物相容性，近年来引起了国内外的广泛关注^[3]。两性离子聚合物表面含有两性离子基团或阴阳离子基团，带电官能团的溶剂化作用和氢键作用能使两性离子聚合物表面形成水合层，这种基于静电作用形成的水合层表面可有效阻抗非特异性蛋白吸附、细菌粘附等^{[4, 5]}。常见的两性离子化合物主要有磷铵、磺铵、羧铵三类，这类聚合物的结构特点是聚合物分子链中同时含有阴离子基团和阳离子基团，而且正负电荷总数相等，具有“反聚电解质效应溶液行为”^[6]，其独特的带电基团的结构能使其在大分子或聚合物表面形成水合层，这种基于静电作用形成的水合层表面赋予其优异的生物相容性，对维持蛋白质的空间结构具有较好的作用^[7~9]。两性离子化合物在保持蛋白质的稳定性和生物活性领域有着巨大的潜在应用价值。相比较另外两种两性离子化合物而言，羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(CBMA)由于其合成方法简单、稳定性良好以及便于功能化等优点引起了研究者的重点关注，并广泛应用于医学药物领域^[10~13]。

  葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，全称β-D-吡喃型葡萄需氧脱氢酶，简称GOD)是食品工业中常用的一种酶，在罐头、调料、油炸食品中加入一定量的GOD可快速除氧，防止食物氧化变质，是一种无公害的天然食品添加剂^{[14, 15]}。GOD在高温下易失活，本文通过自由基聚合制备了羧基甜菜碱两性离子聚合物，并以GOD为模型酶，考察该聚合物在高温下对酶活性维持的性能。

  1   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  甲基丙烯酸二甲氨基乙基酯(DMAEM)(99%)、丙酮(分析纯)、乙醚(分析纯)、β-丙内酯(98.5%)、过硫酸铵(APS)、亚硫酸氢钠(NaHSO₃)均为市售化学试剂。

  Bruker 300 ULTRA SHIELD (300MHz)核磁共振谱仪(布鲁克公司)；Wyatt凝胶渗透色谱仪(美国Waters公司)；UV-3600紫外分光光度计(岛津公司)。

  1.2   聚羧酸甜菜碱酯的制备与表征

  1.2.1   CBMA的制备

  根据文献报道的方法^[16]合成CBMA，具体为：将1.57g(10mmol)DMAEM溶于50mL无水丙酮中，逐滴加入0.87g(12mmol)β-丙内酯的无水丙酮溶液，氮气保护下15℃反应8h，可观察到有白色沉淀生成。将所得白色沉淀用50mL无水丙酮和100mL无水乙醚分别洗涤3次，得到羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(CBMA)，真空干燥箱中干燥后，置于2~8℃下的干燥环境中保存。CBMA的合成路线见图式1。

  图式1  CBMA单体的合成路线 图式1.  Synthesis route of CBMA monomer

  图选项

  下载全尺寸图像

  下载幻灯片

  1.2.2   PCBMA的制备

  将1.5g CBMA溶于3mL水中，以APS为引发剂、亚硫酸氢钠为还原剂，在80℃下进行自由基聚合反应，8h后得浅黄色黏稠状溶液。将聚合物的水溶液进一步浓缩，使体系中的水基本蒸干，加入50mL乙醇沉淀，以除去未反应的单体和引发剂，得到浅黄色的粗产物。用5mL水溶解粗产物后，再次用50mL乙醇沉淀。重复以上溶解-沉淀的过程3次，烘干水分后得到无色固体。

  采用¹H NMR对CBMA、PCBMA进行结构表征。通过凝胶渗透色谱(GPC)对PCBMA进行分子量及分子量分布表征。

  1.3   PCBMA对GOD活性维持的研究

  1.3.1   标准曲线的绘制

  用容量瓶精确配制0.0645mg/mL的GOD水溶液及84mg/mL的葡萄糖溶液。GOD标准曲线的绘制方法如下^[17]：准确移取不同体积的GOD溶液，加入0.5mL葡萄糖溶液，将混合液于35℃反应15min，加入0.26mL靛蓝胭脂红溶液(10^-3mol/L)于100℃反应13min后冰水冷却，定容至5mL。以蒸馏水作参比，检测其波长611nm处的吸光度A。以lg(A₀/A)对GOD浓度作图，得标准曲线。标准曲线线性回归方程为y=0.0298x+0.1249，根据此回归方程，由lg(A₀/A)可推算出相应的酶的活性浓度。

  1.3.2   GOD活性浓度的测定

  配制0.123mg/mL的GOD溶液，移取1mL GOD溶液与0.009g PCBMA聚合物混合，50℃下避光培养12h。定时取样0.5mL，加入0.5mL葡萄糖溶液，之后操作与绘制标准曲线的方法一致，检测其波长611nm处的吸光度A，根据GOD标准曲线，计算GOD的活性浓度。

  2   结果与讨论

  2.1   CBMA及PCBMA的结构表征

  采用¹H NMR分别对CBMA单体及其聚合物PCBMA的结构进行了表征，结果见图 1。CBMA单体的¹H NMR(300MHz，D₂O)数据如下：δ 6.04(S，1H，=CH)，5.66(S，1H，=CH)，4.53(t，2H，OCH₂)，3.69(t，2H，CH₂N)，3.56(t，2H，NCH₂)，3.08(S，6H，NCH₃)，2.62(t，2H，CH₂COO)，1.83(S，3H，=CCH₃)，与文献[16]报道的数据相吻合。而PCBMA聚合物的谱图中，δ 6.04和5.66附近的双键特征峰几乎完全消失，说明PCBMA聚合比较完全。

  图 1  CBMA及PCBMA的核磁氢谱图 Figure 1.  ¹H NMR of monomer CBMA and PCBMA in D₂O

  图选项

  下载全尺寸图像

  下载幻灯片

  采用GPC对PCBMA的分子量进行测定，结果见表 1。因CBMA单体的分子量为229，根据图表定量分析得到实际的引发剂:单体=1:95，对比理论比值1:100可以看出，聚合单体组成和理论摩尔含量基本保持了一致性。

  表 1  聚合物PCBMA的分子量与分布 Table 1.  The molecular weight and distribution of PCBMA determined from GPC

  表选项

  导出Excel

  下载全尺寸表图像

  Polymer	Mn/kDa	Mw/kDa	PDI(Mw/Mn)
  PCBMA	15	22	1.41

  2.2   PCBMA对GOD活性维持的研究

  以GOD为模型，分别对添加和未添加羧基甜菜碱两性离子聚合物的GOD进行活性研究。一般条件下，GOD的生物活性在45℃以上随着环境温度的升高而下降。本文分别测定50、55、60、65℃下添加与未添加PCBMA的GOD溶液在611nm处的吸光度，并与标准曲线相比较，得到不同取样时间下的GOD活性浓度，测定其对葡萄糖的分解能力，研究PCBMA对GOD的活性保持的效果，结果见图 2。从图中可以看出，在初始阶段，不同温度下添加PCBMA的GOD活性浓度是对照样GOD的112%。添加PCBMA的GOD活性浓度和未添加聚合物的GOD活性浓度随着时间的延长都会逐渐降低，但是在0~1 h内，未添加PCBMA的GOD酶活性降低很快。在相同时间下，添加PCBMA的GOD活性浓度均高于未添加PCBMA的对照样，即PCBMA可有效保持GOD的活性。

  图 2  不同温度下时间对GOD活性浓度的影响 Figure 2.  Effect of time on GOD activity concentration under different temperature

  图选项

  下载全尺寸图像

  下载幻灯片

  图 3为在50、55、60、65℃四种温度下，添加与未添加PCBMA的GOD分别停留1h和12h后的活性浓度对比图。从图中可以看出，50℃条件下经过1h，添加了PCBMA的GOD活性浓度较未添加PCBMA的活性浓度提升了66%；经过12h后，GOD活性浓度均明显下降，未添加PCBMA的GOD活性浓度下降为原来活性浓度的44%，而添加PCBMA的GOD依然保持较好的活性，其活性浓度是未添加PCBMA的GOD在1h时活性浓度的92%。65℃条件下，经过1h，添加了PCBMA的GOD活性浓度较未添加PCBMA的样品提升了36%；经过12h后，GOD活性浓度均明显下降，未添加PCBMA的GOD活性浓度下降为原来活性浓度的35%，而添加PCBMA的GOD活性浓度是未添加体系1h时GOD活性浓度的103%。以上结果表明，PCBMA可以很好地保持GOD的活性。

  图 3  不同温度下添加与未添加PCBMA的GOD在停留1h和12h后的活性浓度对比图 Figure 3.  The activity concentration of GOD with and without PCBMA for 1h and 12h under different temperatures

  图选项

  下载全尺寸图像

  下载幻灯片

  酶的本质是蛋白质，蛋白质本身就是一种两性物质，其表面带有大量正负电荷，所以离子化合物可以对酶分子构象和活性进行一定程度的调节。本文中合成的羧酸甜菜碱两性聚合物由于具有很强的亲水性，有助于维持酶分子的自然构象，进而保持酶的活性。

  3   结论

  采用自由基聚合工艺成功制备了羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯两性离子聚合物，并通过用核磁氢谱和凝胶渗透色谱对单体和聚合物结构进行了定性与定量分析，结果表明聚合物PCBMA具有预期的结构组成。50℃条件下经过12h后，添加PCBMA后的GOD活性浓度是未添加PCBMA体系1h时活性浓度的92%，而对照样经过12h后，活性浓度仅为1h时的44%。在65℃条件下，12h后，添加PCBMA的GOD活性浓度是对照样1h时活性浓度的103%，而对照样12h后GOD活性浓度仅为1h时的35%。这表明两性离子聚合物PCBMA可以很好地保持GOD的活性。此外，羧酸甜菜碱两性聚合物可能对保持大部分酶的活性具有一定普适性，但尚需要进一步深入研究。

• 1. [1]

     M Claude, R Lupi, G Bouchaud et al. Food Chem., 2016, 203:136~144.

  2. [2]

     W G Dai, L C Dong. Int. J. Pharm., 2007, 336(1):58~66.

  3. [3]

     S Y Jiang, Z Q Cao. Adv. Mater., 2010, 22(9):920~932.

  4. [4]

     Z Zhang, H Vaisocherova, G Cheng et al. Biomacromolecules, 2008, 9(10):2686~2692.

  5. [5]

     J Ladd, Z Zhang, S Chen et al. Biomacromolecules, 2008, 9(5):1357~1361.

  6. [6]

     何晓燕, 周文瑞, 徐晓君等. 化学进展, 2013, 25(6):1023~1030.

  7. [7]

     M C Parrott, J M Desimone. Nat. Chem., 2011, 4(1):13~16.

  8. [8]

     Y Y Jiang, H X Lu, F Chen et al. Biomacromolecules, 2016,17(3):807~808.

  9. [9]

     A J Keefe, S Y Jiang. Nat. Chem., 2011, 4(1):59~63.

  10. [10]

      S Kudaibergenov, W Jaeger, A Laschewsky. Polymeric betaines:synthesis, characterization, and application[M]//Supramolecular polymers polymeric betains oligomers. Springer Berlin Heidelberg, 2006:157~224.

  11. [11]

      S Y Liu, S Y Jiang. Nano Today, 2016, 11:285~291.

  12. [12]

      Q Shao, S Y Jiang. Adv. Mater., 2015, 27(1):15~26.

  13. [13]

      M C Sin, P T Lou, C H Cho et al. Colloid. Surf. B, 2015, 127:54~64.

  14. [14]

      纪璎. 浙江大学硕士学位论文, 2012.

  15. [15]

      梅丛笑, 方元超. 江苏食品与发酵, 2000, (1):22~25.

  16. [16]

      Z Zhang, T Chao, S Y Jiang et al. Langmuir, 2006, 22(24):10072~10077.

  17. [17]

      周建芹, 陈韶华, 王剑文. 实验技术与管理, 2008, 25(12):58~60.

• 

  图式1  CBMA单体的合成路线

  Scheme 1  Synthesis route of CBMA monomer

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 1  CBMA及PCBMA的核磁氢谱图

  Figure 1  ¹H NMR of monomer CBMA and PCBMA in D₂O

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 2  不同温度下时间对GOD活性浓度的影响

  Figure 2  Effect of time on GOD activity concentration under different temperature

  a：65℃；b：60℃；c：55℃；d：50℃

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 3  不同温度下添加与未添加PCBMA的GOD在停留1h和12h后的活性浓度对比图

  Figure 3  The activity concentration of GOD with and without PCBMA for 1h and 12h under different temperatures

  A: 50℃，B: 55℃，C: 60℃，D: 65℃

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  表 1  聚合物PCBMA的分子量与分布

  Table 1.  The molecular weight and distribution of PCBMA determined from GPC

  Polymer	Mn/kDa	Mw/kDa	PDI(Mw/Mn)
  PCBMA	15	22	1.41

  下载: 导出CSV
•