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• 当今世界恶性肿瘤正成为威胁人类健康的头号疾病，其发病率和死亡率均较高，仅次于心脑血管疾病，居于第二^{[1, 2]}。目前，肿瘤治疗的药物主要分两种类型：一种是细胞毒类药物，由于缺乏作用特异性，因而其对正常组织和肿瘤组织也有一定的毒、副作用；第二种属于分子靶向类药物，它们对肿瘤细胞的选择性高，药物的毒、副作用均较低^[3]。

  表皮生长因子受体(EGFR)及其同源蛋白HER2、HER3、HER4是调控细胞生长与分化的重要酪氨酸激酶受体。在正常组织中，其调控细胞的生长、分裂、分化，这些受体的突变或过表达会引起癌变。越来越多的研究表明，EGFR是抗肿瘤药物的重要靶点，开发新型小分子EGFR抑制剂已成为药物化学的研究热点。在肿瘤细胞中，像卵巢癌、胃癌、直肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌及恶性胶质瘤等恶性肿瘤，EGFR处于过度表达，在增进血管生成、肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移的同时，抑制肿瘤细胞的凋亡^[4~6]。因此，EGFR的过表达直接影响肿瘤患者的生存，由此EGFR靶向药物的研究成为抗肿瘤药物研发领域的热点^{[7, 8]}。

  哌嗪是药物化学中广泛使用的一类含氮杂环的碱性基团，以其为骨架，药物分子的水溶性、碱性有效增强，抗癌活性好^[9~11]。本文以EGFR为药物靶点，基于已有的活性结构，使用Discovery Studio^TM 3.5软件(简称DS 3.5)进行基于结构和基于小分子的药物设计模块来筛选药效基团(譬如咪唑、喹啉衍生物)，分析药物构效关系，设计筛选靶向EGFR抑制剂类新型抗肿瘤药物。以溴乙酸为起始原料，设计合成了一系列含哌嗪骨架的2-巯基苯并咪唑衍生物，并将其目标物进行抗癌活性测试，以期获得一类具有明显抗癌活性的化合物，为开发新型、高效、低毒的抗癌药物提供参考。化合物的合成路线见图式 1。

  图式 1

  

  图式 1.  目标化合物的合成路线

  Scheme 1.  Synthetic route of the target compounds

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  1.   实验部分

  1.1   主要仪器与试剂

  Bruker的DPX400型核磁共振谱仪(瑞士Bruker公司)；Olympus IX71型倒置荧光显微镜(日本Olympus)；Heracel CO₂培养箱(美国Kendro)，美国BD流式细胞仪；Sunrise型扫描酶标仪(奥地利TECAN)等。

  哌嗪及取代哌嗪购自天津筠凯化工有限公司；其他各种原料均购自阿拉丁公司；溶剂购自南京化学试剂厂；以上试剂均为分析纯或化学纯级。新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人肝癌细胞(HepG2)、人非小细胞肺癌细胞(A549)均购于中国科学院上海细胞生物学研究所。

  1.2   化合物的合成

  1mmol溴乙酸与1mmol各种哌嗪反应，1-羟基苯并三唑(HOBT)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)作催化剂，二氯甲烷为溶剂，50℃回流反应10~12 h，反应完毕后过滤，滤液中加入水，二氯甲烷萃取，减压蒸干溶剂。所得物与2-巯基苯并咪唑摩尔比1:1反应，碳酸钾为催化剂，丙酮作溶剂，60℃回流约10h，过滤，经柱层析得目标化合物4a~4q。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(2-氟苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4a)：白色固体，产率37%，熔点120~121℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.57(s，1H，NH)，7.44(s，2H，ArH)，7.04~7.13(m，6H，ArH)，4.46(s，2H，CH₂)，3.65~3.74(d，J=7.8Hz，4H，CH₂CH₂)，2.98~3.08(d，J=3.84Hz，4H，CH₂CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：166.21，156.26，154.64，150.24，139.98，125.38，123.36，123.31，121.88，120.03，116.56，116.43，50.74，50.41，46.06，42.14，40.09，39.95，39.81；TOF MS m/z：C₁₉H₁₉FN₄OS，理论值370.45；实测值371.1377 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4b)：白色固体，产率35%，熔点185~186℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.57(s，1H，NH)，7.44(s，2H，ArH)，7.06~7.11(m，4H，ArH)，6.96~6.99(m，2H，ArH)，4.46(s，2H，CH₂)，3.71~3.73(t，J=6.98Hz，2H，CH₂)，3.61~3.63(t，J=7.20Hz，2H，CH₂)，3.16(t，J=4.72Hz，2H，CH₂)，3.05~3.07(t，J=7.34Hz，2H，CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：166.16，157.54，155.98，150.22，148.11，144.05，135.87，118.24，118.19，115.92，115.77，110.79，49.82，45.83，41.94，40.23，40.10，39.96，39.82；TOF MS m/z：C₁₉H₁₉FN₄OS，理论值370.45；实测值371.1377 [M+1]⁺。

  2- ((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(3-(三氟甲基)苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4c)：白色固体，产率36%，熔点159~160℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆) δ：12.57(s，1H，NH，7.39~7.44(m，3H，ArH)，7.23~7.25(t，J=6.16Hz，2H，ArH)，7.11 (d，J=7.16 Hz，3H，ArH)，4.47(s，2H，CH₂)，3.63~3.74(d，J=8.32Hz，4H，CH₂CH₂)，3.34~3.36(d，J=7.68Hz，4H，CH₂CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆)δ：164.54，149.66，148.47，142.31，134.14，128.80，120.36，119.87，117.81，116.00，113.75，110.04，46.44，46.15，43.82，40.01，38.36，38.22，38.08，33.69；TOF MS m/z：C₂₀H₁₉F₃N₄OS，理论值420.45；实测值421.1303 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(双(4-氟苯基)甲基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4d)：白色固体，产率45%，熔点168~170℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.52(s，1H，NH)，7.43~7.46(m，6H，ArH)，7.10~7.15(m，6H，ArH)，4.44(s，1H，CH)，4.35(s，2H，CH₂)，3.59(s，2H，CH₂)，3.49(d，J=7.04Hz，2H，CH₂)，2.34(s，2H，CH₂)，2.26(d，J=4.44Hz，2H，CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆)：165.99，162.38，160.77，150.18，138.77，138.75，129.95，129.90，121.83，115.94，115.80，79.97，51.77，51.31，45.97，42.15，40.23，40.09，39.95，39.81，39.67，35.36；TOF MS m/z：C₂₆H₂₄F₂N₄OS，理论值478.56；实测值479.1739 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(3, 4-二氯苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4e)：白色固体，产率30%，熔点168~170℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.51(s，1H，NH)，7.43~7.45(m，3H，ArH)，7.10~7.15(m，4H，ArH)，4.44(s，2H，CH₂)，3.48~3.58(m，4H，CH₂CH₂)，2.25~2.33(m，4H，CH₂CH₂)；¹³C NMR (101MHz，DMSO-d₆) δ：166.27，150.84，150.21，132.01，131.00，122.11，121.62，120.40，117.75，117.02，116.02，110.81，48.08，47.72，45.43，41.59，40.09，39.95，39.81；TOF MS m/z：C₁₉H₁₈Cl₂N₄OS，理论值421.34；实测值422.0678 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(2, 3-二氯苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4f)：淡黄色固体，产率：40%，熔点194~195℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.57(s，1H，NH)，7.49~7.51(t，J=6.16Hz，1H，ArH)，7.37~7.39(m，1H，ArH)，7.33~7.38(m，3H，ArH)，7.11~7.14(m，3H，ArH)，4.48(s，2H，CH₂)，3.74(t，J=6.34Hz，2H，CH₂)，3.65(s，2H，CH₂)，3.05~3.07(t，J=4.28Hz，2H，CH₂)，2.95~2.97(t，J=4.52Hz，2H，CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：166.32，151.19，150.21，144.07，135.87，133.12，129.04，125.32，122.10，120.37，117.75，110.80，51.52，51.17，46.22，42.29，40.09，39.95，39.82；TOF MS m/z：C₁₉H₁₈Cl₂N₄OS，理论值421.34；实测值422.0678 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(2-氯苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4g)：白色固体，产率32%，熔点155~156℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.57(s，1H，NH)，7.32~7.43(m，4H，ArH)，7.08~7.13(m，4H，ArH)，4.47(s，2H，CH₂)，3.74(s，2H，CH₂)，3.65(s，2H，CH₂)，3.04(s，2H，CH₂)，2.95(s，2H，CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：166.29，150.23，149.04，144.07，130.84，128.63，128.92，124.82，122.10，121.60，117.74，110.80，51.46，51.12，46.27，42.34，40.09，39.95，39.82；TOF MS m/z：C₁₉H₁₉ClN₄OS，理论值386.90；实测值387.3852 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(3-氯苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4h)：白色固体，产率：30%，熔点154~155℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.57(s，1H，NH)，7.40~7.49(d，J=37.56Hz，2H，ArH)，7.13~7.24(m，3H，ArH)，6.84~6.97(m，3H，ArH)，4.47(s，2H，CH₂)，3.62~3.64(d，J=8.12Hz，4H，CH₂CH₂)，3.20~3.36 (m，4H，CH₂CH₂)；¹³C NMR (101MHz，DMSO-d₆) δ：166.21，152.36，150.21，144.07，135.87，134.32，130.98，122.08，121.60，118.91，115.38，114.49，110.80，48.28，47.95，45.59，40.09，39.95，39.82；TOF MS m/z：C₁₉H₁₉ClN₄OS，理论值386.90；实测值387.3869 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-((4-氯苯基)(苯基)甲基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4i)：浅黄色固体，产率：35%，熔点135~136℃；¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：12.52(s，1H，NH)，7.31~7.46(m，10H，ArH)，7.21~7.23(t，J=7.36Hz，1H，ArH)，7.10~7.12(m，2H，ArH)，4.39(s，1H，CH)，4.35(t，J=3.6Hz，2H，CH₂)，3.59(s，2H，CH₂)，3.49 (s，2H，CH₂)，2.27~2.29(t，J=8.26Hz，4H，CH₂CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：165.99，150.19，144.03，142.30，141.92，135.86，131.93，129.91，129.16，129.05，128.10，127.64，122.09，121.61，117.73，110.78，74.04，56.50，51.85，51.39，45.97，42.16，40.23，39.95，39.81，39.68；TOF MS m/z：C₂₆H₂₅ClN₄OS，理论值477.02；实测值478.1545 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(4-硝基苯基)哌嗪基)乙-1-酮(4j)：黄色固体，产率：34%，熔点219~220℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.56(s，1H，NH)，8.09(d，J=9.44Hz，2H，ArH)，7.50(d，J=7.28Hz，1H，ArH)，7.37(d，J=7.24Hz，1H，ArH)，7.11~7.13(m，2H，ArH)，7.03(d，J=9.48Hz，2H，ArH)，4.47(s，2H，CH₂)，3.79(t，J=4.16Hz，2H，CH₂)，3.64(t，J=4Hz，4H，CH₂CH₂)，3.51(t，J=5.44Hz，2H，CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：166.49，154.77，150.22，144.05，137.42，135.88，126.24，122.10，121.61，117.73，113.00，110.80，46.37，46.17，45.04，41.46，40.09，39.95，39.81；TOF MS m/z：C₁₉H₁₉N₅O₃S，理论值397.45；实测值398.1271 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-苯基哌嗪-1-基)乙-1-酮(4k)：白色固体，产率38%，熔点180~181℃；¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：12.56(s，1H，NH)，7.38~7.50(m，2H，ArH)，7.22~7.25(t，J=11.92Hz，2H，ArH)，7.10~7.12(m，2H，ArH)，6.96(d，J=8.00Hz，2H，ArH)，6.80~6.82(t，J=10.86Hz，1H，ArH)，4.46 (s，2H，CH₂)，3.72 (t，J=7.02Hz，2H，CH₂)，3.62(t，J=7.44Hz，2H，CH₂)，3.22(d，J=4.56Hz，2H，CH₂)，3.12(t，J=4.72Hz，2H，CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：166.16，151.20，150.24，144.06，135.88，129.48，122.09，121.61，119.82，117.74，116.34，110.79，48.99，48.62，45.79，41.93，40.09，39.95，38.82；TOF MS m/z：C₁₉H₂₀N₄OS，理论值352.46；实测值353.1430 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-二苯甲基哌嗪-1-基)乙-1-酮(4l)：白色固体，产率36%，熔点186~187℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.52(s，1H，NH)，7.43(d，J=7.16Hz，5H，ArH)，7.30(t，J=7.56Hz，5H，ArH)，7.10~7.19(m，4H，ArH)，4.39(s，2H，CH₂)，4.34(s，1H，CH)，3.50~3.53(d，J=12.13Hz，4H，CH₂CH₂)，2.28~2.30(t，J=8.32Hz，4H，CH₂CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：165.99，150.18，144.02，142.90，135.85，129.07，128.08，127.45，122.09，121.60，117.73，110.78，75.09，51.99，51.53，45.97，42.18，40.23，40.09，39.96，39.82，39.68，35.40；TOF MS m/z：C₂₆H₂₆N₄OS，理论值442.58；实测值443.1899 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-苄基哌嗪-1-基)乙-1-酮(4m)：浅黄色固体，产率42%，熔点156~157℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.54(s，1H，NH)，7.48(t，J=5.84Hz，1H，ArH)，7.26~7.35(m，6H，ArH)，7.10~7.12(t，J=5.56Hz，2H，ArH)，4.39(s，2H，CH₂)，3.56(t，J=4.68Hz，2H，CH₂)，3.47~3.49(t，J=10.82Hz，4H，CH₂CH₂)，2.42(t，J=6.80Hz，2H，CH₂)，2.32(t，J=7.06Hz，2H，CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：166.00，150.23，138.25，129.37，128.70，127.51，72.74，62.28，60.70，53.06，52.53，45.98，42.11，40.23，40.10，39.95，39.81，39.67，35.48；TOF MS m/z：C₂₀H₂₂N₄OS，理论值366.48；实测值385.1539 [M+18]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(2-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4n)：浅黄色固体，产率43%，熔点138~140℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.56(s，1H，NH)，7.49~7.51(t，J=7.16Hz，1H，ArH)，7.36~7.38(t，J=7.26Hz，1H，ArH)，7.11~7.13(m，2H，ArH)，6.95~6.98(m，2H，ArH)，6.88(d，J=3.36Hz，2H，ArH)，4.45(s，2H，CH₂)，3.80(s，3H，CH₃)，3.70(t，J=4.36Hz，2H，CH₂)，3.61(t，J=4.32Hz，2H，CH₂)，3.01(t，J=4.16Hz，2H，CH₂)，2.92(t，J=4.56 Hz，2H，CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：166.14，152.47，150.24，144.06，141.15，135.87，123.42，121.28，118.75，117.74，112.32，110.80，55.82，50.74，50.41，46.27，42.34，40.09，39.95；TOF MS m/z：C₂₀H₂₂N₄O₂S，理论值382.48；实测值383.1530 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(3-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4o)：白色固体，产率43%，熔点138~140℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.56(s，1H，NH)，7.38~7.41(d，J=12.04Hz，2H，ArH)，7.12~7.14(m，3H，ArH)，6.40~6.56(m，3H，ArH)，4.46(s，2H，CH₂)，3.72(s，3H，CH₃)，3.61~3.70(m，4H，CH₂CH₂)，3.23(t，J=4.68Hz，2H，CH₂)，3.12(t，J=4.92Hz，2H，CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：166.17，160.66，152.54，150.23，144.05，135.87，130.18，117.74，110.80，108.89，105.09，102.45，55.37，48.92，48.57，45.75，41.89，40.09，39.95，39.82；TOF MS m/z：C₂₀H₂₂N₄O₂S，理论值382.48；实测值383.1530 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(4-甲氧基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4p)：白色固体，产率42%，熔点177~178℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.56(s，1H，NH)，7.38~7.40(d，J=8.28Hz，2H，ArH)，7.11~7.12(dd，J=6.02Hz，2H，ArH)，6.83~6.93(m，4H，ArH)，4.45(s，2H，CH₂)，3.71(s，3H，CH₃)，3.62~3.69(m，4H，CH₂CH₂)，3.08(t，J=4.48Hz，2H，CH₂)，2.98(t，J=4.76Hz，2H，CH₂)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：166.12，153.78，150.25，145.55，135.88，122.09，121.62，118.52，117.74，114.74，110.80，55.63，50.55，50.14，45.99，42.08，40.09，39.95，39.81，35.47；TOF MS m/z：C₂₀H₂₂N₄O₂S，理论值382.48；实测值383.1530 [M+1]⁺。

  2-((1H-苯并[d]咪唑-2-基)硫基)-1-(4-(2, 4-二甲基苯基)哌嗪-1-基)乙-1-酮(4q)：浅黄色固体，产率44%，熔点169~170℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.56(s，1H，NH)，7.38~7.50(m，2H，ArH)，7.11~7.12(dd，J=5.52Hz，2H，ArH)，6.88~6.97(m，3H，ArH)，4.46(s，2H，CH₂)，3.61~3.70(m，4H，CH₂CH₂)，2.75~2.84(m，4H，CH₂CH₂)，2.24(s，3H，CH₃)，2.21(s，3H，CH₃)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆) δ：166.19，150.25，148.89，132.57，132.25，131.96，127.44，122.08，119.40，117.73，110.79，52.16，51.82，46.58，42.65，40.23，40.09，39.95，39.82，39.68，35.61；TOF MS m/z：C₂₁H₂₄N₄OS，理论值380.51；实测值381.1745 [M+1]⁺。

  1.3   生物活性实验

  1.3.1   抗增殖活性测试

  取刚刚长成完整单层的细胞一瓶，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液台盼蓝(Trypan Blue)染色，于显微镜下计数活细胞数目(死细胞数目不得超过5%)，用完全培养液调整细胞数目至1×10⁵个细胞/mL。于96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液，将培养板置于CO₂培养箱中培养12h，取出培养板后于每孔中加100μL含不同浓度被测样品的溶液，使得药物终浓度分别为10.0、20.0、50、100 μmol/L，每个浓度设6个平行孔，另设6孔细胞不加被测药作为正常对照孔。置于CO₂培养箱中继续培养24h。取出培养板，每孔加入15μL 5mg/mL的MTT液，振荡混匀，继续培养4h。酶标仪490nm测定各孔吸光值(OD)，计算药物对细胞增殖的IC₅₀值。

  1.3.2   细胞毒性实验

  同抗肿瘤细胞增殖实验。使用的细胞是人源胚胎肾上皮细胞293T，测定方法为：取对数生长期293T细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为10⁵个/mL，每孔100μL，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。药物组中加入不同浓度梯度的待测药物后，再加入LPS(终浓度为1mg/L)刺激细胞共孵育24h，每组处理重复6孔。

  上述各处理组细胞孵育24h后，各孔加入15μL 5mg/mL MTT，37℃、5% CO₂培养箱中继续培养4h后终止培养，弃去孔内液体，然后加入150μL DMSO，震荡10min，使细胞内结晶充分溶解，酶标仪490nm波长处测定各孔吸光值(OD)。计算出CC₅₀值。

  1.3.3   EGFR蛋白抑制活性实验

  2-巯基苯并咪唑类衍生物对EGFR的抑制活性，设置溶剂对照组、空白对照组、实验组三组对照实验，EGFR用缓冲液稀释、底物和显色发生剂，使稀释之后的溶液浓度为原溶液浓度的50%、2.5%和1%，同时将药品和阳性对照药物用缓冲液稀释成不同浓度梯度。依次加入缓冲液、药品溶液、酶溶液和底物溶液共50μL于96孔板中，各溶液之间的比例依次为2:2:1:5，设置空白对照孔，依次加入25μL缓冲液和25μL底物溶液；对照孔加20μL缓冲液、5μL酶溶液和25μL底物溶液，37℃下放置30min后，向96孔板的每个孔中加入显色剂50μL，37℃下15min后，酶标仪450nm波长下测试OD值。

  1.3.4   AV/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡

  利用Annexin V-FITC/PI双染色荧光显微镜检测细胞的凋亡。HepG2细胞以10⁵个/mL浓度接种于6孔板中，12h后加药4l，终浓度为10、20、40 μmol/L，空白对照加等量细胞培养基。48h后处理细胞，PBS漂洗后悬浮于500μL Binding Buffer，然后加入5μL Annexin V-FITC/PI和5μL PI，轻轻混匀，避光室温反应10min，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

  1.3.5   分子对接研究

  EGFR晶体结构从PDB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org)中获得，(PDB code：3CD8)使用的分子对接软件为Discovery studio 3.5中的CDOCKER分子对接程序，

  2.   结果与讨论

  2.1   目标化合物的合成

  目标化合物4a~4q的合成以溴乙酸为原料与哌嗪反应，得中间化合物3a~3q，再与2-巯基苯并咪唑反应，得目标产物4即4a~4q。目标化合物的结构均经¹H NMR、¹³C NMR确证，其中化合物4b经单晶X射线晶体学进一步证实(图 1)。

  图 1

  

  图 1.  化合物4b的晶体结构图(CCDC：1582726)

  Figure 1.  Crystal structure diagram of compound of 4b (CCDC: 1582726)

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  2.2   分子对接

  EGFR晶体结构从PDB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org)中获得，(PDB code：3CD8)。为了更好的理解活性化合物4l与EGFR的作用模式和作用机制，并指导进一步的构效关系分析，利用Discovery studio 3.5软件对化合物4l与蛋白EGFR(PDB ID：3CD8)的活性位点进行了分子对接，对接结果如图 2所示。在2D和3D模型中，化合物4l跟蛋白EGFR的活性位点结合，一个氢键是由一个羟基的氮原子和LYS A的氨基氢形成的，赖氨酸:1161键长：C—N…H=2.32Å，键角：C—N…H=159.08°)。另一个是在氧原子和一个羟基的碳原子和META:1160的氨基氢之间形成的(键长：C＝O…H=2.28Å，键角：C＝O…H=142.07°)。

  图 2

  

  图 2.  (a) 化合物4l与EGFR对接的2D图；(b)化合物4l和EGFR之间的相互作用3D模型

  Figure 2.  (a) 2D molecular docking model of compound 4l with EGFR; Fig. 2 (b) 3D model of the interaction between compound 4l and EGFR

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  从图 2(b)中可以发现，化合物4l通过氢键和电荷相互作用与蛋白EGFR的活性口袋很好的结合，这种结合方式是利用活性口袋的疏水效应，采用比较大的疏水基团插入到活性口袋的深处，然后由咪唑环对活性口袋进行牢固的结合，从而达到很好的抑制蛋白的作用。

  2.3   目标化合物的抗肿瘤活性

  所有目标化合物在10、20、50、100 μmol/L浓度下应用Hela、MCF-7、HepG2和A549肿瘤细胞株进行体外抗增殖活性测验，结果见表 1。

  表 1

  

  表 1  化合物4a~4q对4种癌细胞的体外抗增值活性

  Table 1.  Antiproliferative activities in vitro of target compounds 4a~4q against four cancer cell lines

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  化合物	IC50±SD/(μmol/L)
  	Hela	MCF-7	HepG2	A549
  4a	28.78±1.94	31.33±1.18	27.66±0.87	33.98±0.74
  4b	26.29±1.01	29.52±1.28	24.48±0.63	31.14±0.42
  4c	25.80±0.89	>50	38.33±0.99	35.81±0.94
  4d	22.96±1.03	25.70±1.38	20.61±0.91	>50
  4e	23.19±0.74	26.35±1.72	32.84±0.28	30.60±0.81
  4f	28.01±0.52	28.84±1.07	34.74±0.88	34.88±0.23
  4g	>50	34.39±0.78	>50	37.42±1.22
  4h	31.89±0.63	32.42±0.52	>50	>50
  4i	20.79±0.91	22.34±1.71	19.05±1.05	35.50±1.26
  4j	29.98±0.62	31.89±1.06	35.98±0.60	33.42±0.41
  4k	26.82±0.65	28.28±0.63	30.42±0.06	30.22±1.02
  4l	18.98±0.76	20.86±0.36	12.62±0.78	24.63±0.41
  4m	30.23±0.43	30.74±0.86	25.45±0.95	27.86±0.71
  4n	27.95±0.27	25.75±0.73	23.14±0.68	>50
  4o	>50	28.64±1.09	27.51±0.35	>50
  4p	25.78±1.20	22.56±0.78	21.81±0.87	34.02±0.81
  4q	29.88±0.89	>50	>50	30.77±0.43
  Gefitinib	14.28±0.65	17.52±1.01	9.72±.038	16.84±0.75
  IC50值是三次重复的平均值

  从表 1中可以看出，绝大多数化合物具有很显著的抗细胞增殖活性，化合物对Hela、MCF-7和HepG2细胞的抗增殖活性要比A549细胞要好。17个化合物中，4l化合物对Hela、MCF-7、HepG2表现出较强的细胞抗增殖活性，IC₅₀值分别为18.98、20.86、12.62 μmol/L，与对照药Gefitinib的值接近。带甲氧基结构的化合物的活性顺序对位>邻位>间位。单取代的卤素原子化合物的活性顺序F>Cl，对位>邻位。带两个苯基的化合物活性高于带一个苯基的化合物。

  2.4   目标化合物抑制细胞毒性

  将17种化合物对293T的细胞毒性进行测试，结果见表 2，以Gefitinib作为阳性对照，每个化合物的毒性用抑制T细胞存活率到50%时的浓度CC₅₀来表示。从表 2中可以看出这些化合物几乎没有细胞毒性，属于潜在的毒性较低的药物。

  表 2

  

  表 2  化合物4a~4q对人肾上皮细胞(293T)的细胞毒性

  Table 2.  Inhibition of cytotoxicity assay by compounds 4a-4q

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  化合物	CC50/(μmol/L)c	化合物	CC50/(μmol/L)c
  4a	126.84±1.50	4j	121.40±1.27
  4b	104.81±1.97	4k	213.58±1.52
  4c	177.30±1.16	4l	229.60±1.63
  4d	157.58±1.85	4m	194.31±1.16
  4e	123.60±1.44	4n	243.05±1.37
  4f	158.49±2.13	4o	144.54±3.12
  4g	114.82±1.35	4p	165.95±1.23
  4h	124.24±1.52	4q	199.53±1.67
  4i	194.98±1.36	Gefitinib	213.42±2.46
  3次平行试验的结果取平均值，误差在5%~10%之间

  2.5   EGFR蛋白抑制活性实验

  目标化合物在体外对EGFR蛋白的抑制活性实验结果显示，绝大多数化合物的EGFR蛋白抑制活性与抗肿瘤细胞增殖活性相关，化合物4l表现出最强的EGFR蛋白抑制活性，其IC₅₀值为9.36μmol/L(见表 3)。2-巯基苯并咪唑类衍生物的抗肿瘤细胞增殖活性与这些化合物对EGFR的亲和作用密切相关，即该系列化合物通过与EGFR蛋白结合从而抑制酪氨酸激酶活性很可能是该系列化合物具有抗肿瘤效果的主要原因。

  表 3

  

  表 3  化合物4a~4q对EGFR蛋白的抑制活性

  Table 3.  Inhibitory activity of compound 4a~4q against EGFR protein

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  化合物	IC50/(μmol/L)	化合物	IC50/(μmol/L)d
  4a	20.12±1.07	4j	32.56±1.75
  4b	14.76±1.38	4k	23.49±0.38
  4c	17.54±1.98	4l	9.36±0.78
  4d	15.67±0.72	4m	18.35±1.55
  4e	11.87±2.14	4n	13.06±0.97
  4f	20.34±1.35	4o	25.32±2.01
  4g	30.48±1.21	4p	21.75±1.45
  4h	24.39±0.87	4q	27.34±0.87
  4i	19.67±1.73	Gefitinib	1.05±1.23
  MTT法检测EGFR抑制活性(3次试验的平均值), 误差在5%~10%之间

  2.6   细胞凋亡实验

  利用Annexin V-FITC/PI双染色流失细胞仪检测4l化合物对HepG2细胞的凋亡，实验结果如图 3所示，对照组细胞发生凋亡的数量很少，细胞生长状况良好，凋亡和死亡的细胞较少；未经4l处理, 10.98%的细胞发生凋亡(图 3a)；使用10μmol/L 4l处理HepG2细胞，发生凋亡的细胞数量增加为14.17%(图 3b)；使用15μmol/L 4l处理HepG2细胞，发生凋亡的细胞数量继续增长，为16.17%(图 3c)；使用15μmol/L 4l处理HepG2细胞，发生凋亡的细胞数量为23.81%(图 3d)；Annexin V-FITC/PI双染色的实验结果，说明化合物4l能够有效诱导细胞凋亡，随着浓度的增大发生凋亡的细胞数量增多，且凋亡细胞占死亡细胞比例较大。

  图 3

  

  图 3.  HepG2细胞株经过化合物4l不同药物浓度(0、10、15、20μmol/L)培养48h后的细胞凋亡

  Figure 3.  Apoptosis of HepG2 cell line after 48 h incubation with compound 4l at different drug concentrations (0, 10, 15, 20μmol/L)

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  3.   结论

  本文以哌嗪为骨架，根据药代动力学原理设计合成了17个2-巯基苯并咪唑衍生物。在对四种癌细胞进行体外抗肿瘤细胞的测试中，大多数化合物都有较明显的抗增值活性。尤其化合物4l的活性最好，对HepG2的抗增值作用略低于阳性对照药Gefitinib。每个化合物的毒性用抑制293T细胞存活率50%时的浓度来表示，可以看出它们对293T细胞毒性较低。化合物4l通过氢键和电荷相互作用与蛋白EGFR的活性口袋很好地结合，其具有潜在的抗肿瘤活性。

  
  
• 1. [1]

     A S El-Azab, M A Al-Omar, Abdel-Aziz et al. Eur. J. Med. Chem. 2010, 45(9):4188~4198. doi: 10.1016/j.ejmech.2010.06.013

  2. [2]

     A Jemal, F Bray, M M Center et al. CA-Cancer J. Clin., 2011, 61:69~90. doi: 10.3322/caac.20107

  3. [3]

     M T Kuo. Antioxid Redox Sign, 2009, 11:99~133. doi: 10.1089/ars.2008.2095

  4. [4]

     J Capdevila, E Elez, T Macarulla et al. Cancer Treat. Rev., 2009, 35(4):354~363. doi: 10.1016/j.ctrv.2009.02.001

  5. [5]

     M Gao, X J Liang, Zhang Z S et al. Asian Pac. J. Trop. Med., 2013, 6(4):260~264. doi: 10.1016/S1995-7645(13)60054-1

  6. [6]

     S Temraz, D Mukherji, A Shamseddine. Crit. Rev. Oncol. Hemat., 2016, 101:151~157. doi: 10.1016/j.critrevonc.2016.03.009

  7. [7]

     S Giordano, A Petrelli. Curr. Med. Chem., 2008, 15:422~432. doi: 10.2174/092986708783503212

  8. [8]

     C B Sangani, J A Makawana, Y T Duan et al. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2014, 24:4472~4476. doi: 10.1016/j.bmcl.2014.07.094

  9. [9]

     L Yurttas, S Demirayak, S Ilgin et al. Bioorg. Med. Chem., 2014, 22(22):6313~6323. doi: 10.1016/j.bmc.2014.10.002

  10. [10]

      R Zhang, X Wu, J C Yalowich et al. Bioorg. Med. Chem., 2011, 19(23):7023~7032. doi: 10.1016/j.bmc.2011.10.012

  11. [11]

      A A Yadav, G L Chee, X Wu et al. Bioorg. Med. Chem., 2015, 23(13) 3542~3551. doi: 10.1016/j.bmc.2015.04.022

• 

  图式 1  目标化合物的合成路线

  Scheme 1  Synthetic route of the target compounds

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  图 1  化合物4b的晶体结构图(CCDC：1582726)

  Figure 1  Crystal structure diagram of compound of 4b (CCDC: 1582726)

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  图 2  (a) 化合物4l与EGFR对接的2D图；(b)化合物4l和EGFR之间的相互作用3D模型

  Figure 2  (a) 2D molecular docking model of compound 4l with EGFR; Fig. 2 (b) 3D model of the interaction between compound 4l and EGFR

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  图 3  HepG2细胞株经过化合物4l不同药物浓度(0、10、15、20μmol/L)培养48h后的细胞凋亡

  Figure 3  Apoptosis of HepG2 cell line after 48 h incubation with compound 4l at different drug concentrations (0, 10, 15, 20μmol/L)

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  表 1  化合物4a~4q对4种癌细胞的体外抗增值活性

  Table 1.  Antiproliferative activities in vitro of target compounds 4a~4q against four cancer cell lines

  化合物	IC50±SD/(μmol/L)
  	Hela	MCF-7	HepG2	A549
  4a	28.78±1.94	31.33±1.18	27.66±0.87	33.98±0.74
  4b	26.29±1.01	29.52±1.28	24.48±0.63	31.14±0.42
  4c	25.80±0.89	>50	38.33±0.99	35.81±0.94
  4d	22.96±1.03	25.70±1.38	20.61±0.91	>50
  4e	23.19±0.74	26.35±1.72	32.84±0.28	30.60±0.81
  4f	28.01±0.52	28.84±1.07	34.74±0.88	34.88±0.23
  4g	>50	34.39±0.78	>50	37.42±1.22
  4h	31.89±0.63	32.42±0.52	>50	>50
  4i	20.79±0.91	22.34±1.71	19.05±1.05	35.50±1.26
  4j	29.98±0.62	31.89±1.06	35.98±0.60	33.42±0.41
  4k	26.82±0.65	28.28±0.63	30.42±0.06	30.22±1.02
  4l	18.98±0.76	20.86±0.36	12.62±0.78	24.63±0.41
  4m	30.23±0.43	30.74±0.86	25.45±0.95	27.86±0.71
  4n	27.95±0.27	25.75±0.73	23.14±0.68	>50
  4o	>50	28.64±1.09	27.51±0.35	>50
  4p	25.78±1.20	22.56±0.78	21.81±0.87	34.02±0.81
  4q	29.88±0.89	>50	>50	30.77±0.43
  Gefitinib	14.28±0.65	17.52±1.01	9.72±.038	16.84±0.75
  IC50值是三次重复的平均值

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  表 2  化合物4a~4q对人肾上皮细胞(293T)的细胞毒性

  Table 2.  Inhibition of cytotoxicity assay by compounds 4a-4q

  化合物	CC50/(μmol/L)c	化合物	CC50/(μmol/L)c
  4a	126.84±1.50	4j	121.40±1.27
  4b	104.81±1.97	4k	213.58±1.52
  4c	177.30±1.16	4l	229.60±1.63
  4d	157.58±1.85	4m	194.31±1.16
  4e	123.60±1.44	4n	243.05±1.37
  4f	158.49±2.13	4o	144.54±3.12
  4g	114.82±1.35	4p	165.95±1.23
  4h	124.24±1.52	4q	199.53±1.67
  4i	194.98±1.36	Gefitinib	213.42±2.46
  3次平行试验的结果取平均值，误差在5%~10%之间

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  表 3  化合物4a~4q对EGFR蛋白的抑制活性

  Table 3.  Inhibitory activity of compound 4a~4q against EGFR protein

  化合物	IC50/(μmol/L)	化合物	IC50/(μmol/L)d
  4a	20.12±1.07	4j	32.56±1.75
  4b	14.76±1.38	4k	23.49±0.38
  4c	17.54±1.98	4l	9.36±0.78
  4d	15.67±0.72	4m	18.35±1.55
  4e	11.87±2.14	4n	13.06±0.97
  4f	20.34±1.35	4o	25.32±2.01
  4g	30.48±1.21	4p	21.75±1.45
  4h	24.39±0.87	4q	27.34±0.87
  4i	19.67±1.73	Gefitinib	1.05±1.23
  MTT法检测EGFR抑制活性(3次试验的平均值), 误差在5%~10%之间

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