English

• 作为以肽键为主链的仿生高分子，聚氨基酸(poly(α-amino acid)s)具有丰富的侧链结构、优异的生物相容性和生物可降解性^[1~4]。α-氨基酸-N-羧基内酸酐(N-carboxyanhydrides，NCA)的开环聚合是目前制备聚氨基酸最为简单、高效的方法^[5~9]。得益于氨基酸单体的手性结构，聚氨基酸可通过主链氢键有规则地折叠形成类似于蛋白质的二级结构(如α-螺旋、β-折叠、无规卷曲等)，使其成为模拟蛋白质结构和功能的理想合成高分子材料。

  二级结构本身及其刺激响应性转变赋予了聚氨基酸不同于传统聚合物(如聚烯烃、聚酯、聚醚等)的一些特殊性能。Higashi等^[10]利用α-螺旋二级结构来精确控制金片表面自组装单分子层中的氧化还原位点。Rodríguez-Hernández等^[11]依据不同pH条件下聚谷氨酸和聚赖氨酸二级结构的同步可逆转变，得到核壳相互转换的“schizophrenic”型胶束。Kramer等^[12]利用糖基化聚半胱氨酸侧链中硫醚的H₂O₂氧化性实现二级结构由α-螺旋向无规卷曲的转变。Cheng等^[13]研究发现温敏型凝胶中β-折叠结构含量的增加能够降低其溶胶-凝胶转变温度。Chen等^[14]发现二级结构对温敏型聚氨基酸材料的临界相转变温度具有较大的影响。Wang等^[15]研究发现Y-型寡聚乙二醇侧链有助于聚氨基酸主链α-螺旋结构的稳定。此外，Baumgartner等^[16]利用侧链含有高密度引发位点的聚降冰片烯引发NCA单体的开环聚合，研究发现，α-螺旋偶极矩的协同作用可以显著增加聚合反应速率。Chen等^[17]研究表明，α-螺旋聚氨基酸交联的凝胶比无规卷曲交联的表现出较高的拉伸强度、韧性和恢复速率。

  在生物功能方面，Yin等在该领域进行了大量开创性的研究，他们通过精巧的聚氨基酸结构设计，实现了α-螺旋与无规卷曲两种二级结构之间的转变，发现二级结构在调节基因转染^[18]、膜活性^[19]、抗菌效率^[20]等方面发挥重要作用。Mochida等^[21]研究发现聚谷氨酸与顺铂作用时会在胶束的内核形成聚氨基酸的α-螺旋簇(α-helical bundles)，从而增强胶束的稳定性并改善药物在体内的药代动力学和治疗效果。Ma等^[22]则研究报道了右手螺旋(L-型)聚谷氨酸苄酯涂层比左手螺旋(D-型)和无规卷曲(DL-型)的涂层表面更有利于细胞的黏附和增殖。一系列研究均已表明，聚氨基酸的二级结构在生物医药领域蕴藏着巨大应用潜力。

  本文简要综述了笔者课题组近年来关于聚氨基酸二级结构的研究结果，侧重讨论了二级结构在材料科学及生物医药领域中的结构效应，包括增强涂层防污性能、调节纳米颗粒-细胞膜相互作用以及蛋白质药物改性。聚氨基酸二级结构的设计、合成和在其他领域的应用，读者亦可参考其他优秀的综述文献^[23~26]。

  1.   聚氨基酸二级结构在表面防污涂层中的效应

  防污聚合物(Antifouling polymer)能够有效降低或避免材料表面的生物污染——即蛋白质、血小板、细胞和微生物等的非特异性吸附——因而在医用植入材料、生物传感、药物载体、蛋白质药物改性等领域中至关重要^{[27, 28]}。作为被广泛研究和使用的防污聚合物，聚乙二醇(PEG)存在着性质单一、生物降解慢和功能化修饰困难等缺陷^[29]。因此，发展具有优异生物相容性和生物可降解性的防污高分子涂层具有十分重要的意义。另一方面，近期研究发现，树枝状^[30]、环型^[31]和圆型^[32]聚合物由于具有受限的空间构象，其形成表面涂层中的聚合物链具有较高的空间稳定性和链排斥作用，表现出比柔性链更优异的抗污性能。

  为了探究聚氨基酸二级结构在防污涂层中的效应，笔者课题组合成了侧链为三缩乙二醇单甲醚的聚谷氨酸酯(P(EG₃Glu))，将用于表面锚定的巯基分别置于聚合物的C-或N-端，主链则分别具有L-右手螺旋或DL-无规卷曲二级结构：P(_L-EG₃Glu)-C-SH (L-C)，P(_L-EG₃Glu)-N-SH (L-N)，P(_DL-EG₃Glu)-C-SH (DL-C)和P(_DL-EG₃Glu)-N-SH (DL-N)(图 1(a))^[33]。研究发现，相比于无规卷曲柔性链的DL-C和DL-N，由于α螺旋的刚性和构象受限的二级结构更有利于聚合物链末端巯基的暴露和克服表面已接枝聚合物的位阻效应，L-C和L-N在金片表面的自组装速率较快且形成的涂层更为致密(图 1(b))。有趣的是，等摩尔比混合的L-C/L-N在基底表面的反向平行排列方式比单独的L-C或L-N表现出更高的表面吸附速率，并可形成更致密的聚氨基酸涂层，而无规卷曲的DL-体系却无此方向依赖的现象。这可能得益于L-C/L-N的反平行排列有效地消除了平行排列中的螺旋偶极矩互斥。防污实验结果证实，与无规卷曲结构相比，α螺旋聚氨基酸形成的涂层具有更加优异的防污性能(图 1(c))，并且可通过反平行锚定螺旋聚氨基酸来进一步提高表面防污性能。以上结果表明，聚氨基酸的二级结构及锚定方向对其防污性能均具有较为重要的影响，这为后续防污聚氨基酸的分子设计和构效关系阐明奠定了基础。

  图 1

  

  图 1.  (a) 四种端基为巯基、侧链为寡聚乙二醇、主链为聚谷氨酸的化学结构和二级结构示意图；(b)具有不同二级结构和巯基端基的聚氨基酸在基底表面形成的涂层示意图；(c)牛血清白蛋白(BSA)在不同聚氨基酸涂层表面的吸附情况；涂层的制备调节：聚氨基酸浓度分别采用0.1和1.0mg/mL，时间12h；其中聚乙二醇涂层制备的浓度为1.0mg/mL；图中的百分比为相对于蛋白BSA在裸金片表面的吸附量^[33]

  Figure 1.  (a) Chemical and secondary structures of the four P(EG₃Glu)s used (L-C, L-N, DL-C, and DL-N). (b) Cartoon illustration of different PαAAs adlayers on gold surfaces. (c) BSA adsorption on different PαAAs adlayers prepared at 0.1 and 1.0mg/mL adsorbate concentration for 12h, respectively. PEG coating was prepared with 1.0mg/mL adsorbate. The percentage was calculated by normalization of the adsorbed protein on each polymer adlayer to that on the bare gold surface^[33]

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  2.   聚氨基酸二级结构调节纳米颗粒的细胞内吞

  纳米颗粒的细胞摄取是其在生物传感^[34]、成像^[35]、药物输送^[36~38]、生物安全^[39]等方面应用的重要参数。通过精确调节纳米颗粒的理化性质来控制纳米颗粒与细胞膜的相互作用不仅对于优化细胞靶向和药物转运具有重要意义，而且有助于设计与发展安全有效的纳米医药材料^{[40, 41]}。研究表明，纳米颗粒与细胞的相互作用受其尺寸^[42]、形状^[43]、表面电荷及分布^[44]、刚柔性^[45]以及表面亲疏水性^[46]等的影响。随着聚氨基酸作为生物医用材料的不断发展，深入了解聚氨基酸与细胞膜的作用变得尤其重要。早期研究发现，细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)的螺旋结构对其功能的发挥具有十分重要的作用^[47]。这促使人们进一步探究聚氨基酸的二级结构与细胞膜之间的相互作用。

  笔者课题组与孙聆东等合作，将上述四种具有不同构型和锚点取向的聚氨基酸进一步修饰到金纳米颗粒(AuNPs)表面(图 2(a))^[48]。研究发现，修饰有聚氨基酸的AuNPs在蛋白质溶液中均表现出较好的稳定性。其中，具有刚性α螺旋二级结构的L-C和L-N在AuNPs表面的接枝密度高于无规卷曲的DL-型聚氨基酸，并且等摩尔比混合的L-C/L-N体系进一步提高了AuNPs表面的聚合物接枝密度。这与上一节中该聚氨基酸在平面基底表面修饰的结果一致。此外，(L-C)-AuNPs中聚氨基酸的C-端(偶极矩负极)连接在AuNPs表面，而N-端(偶极矩正极)位于最外层，使其表现出较高的Zeta电势和HeLa细胞摄取量(2.0~2.5倍于其他聚氨基酸修饰的AuNPs)(图 2(b)，图 2(c))。在表面修饰有聚氨基酸的金纳米棒(AuNRs)和聚合物胶束等体系中也得到了类似的结果。计算模拟表明，(L-C)-AuNPs由于正偶极矩一致朝外的聚氨基酸平行排列以及其刚性表面，在与磷脂双分子层的相互作用中可以在细胞膜表面粘附后诱导细胞膜对其快速包覆。这种通过改变偶极矩取向(或锚定取向)来调节细胞内吞作用的研究不仅拓展了聚氨基酸二级结构在生物医药领域的应用并且为细胞内吞行为的探究和纳米医药的指导设计提供了新的思路。

  图 2

  

  图 2.  (a) 表面修饰有不同二级结构和锚定去向的聚氨基酸的金纳米颗粒示意图，箭头表示偶极矩的方向，δ⁺和δ^-分别表示偶极矩的正极和负极；(b, c)孵育6h和12h后细胞对右手螺旋聚氨基酸(b)和无规卷曲聚氨基酸(c)分别以不同取向修饰得到金纳米颗粒的摄取情况^[48]

  Figure 2.  (a) Schematic illustration of AuNPs modified with P(EG₃Glu)s with different secondary structures and/or anchoring orientations. Arrows indicate the moment of the helix macrodipole. δ⁺ and δ^- indicate the partially positive and negative dipole ends of the helices, respectively. (b, c) The internalization level of AuNPs coated with the right-handed helical PαAAs (b) or unstructured PαAAs (c) anchoring from different orientations after 6 and 12 h incubation^[48]

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  3.   二级结构在蛋白质药物改性中的应用

  蛋白质药物的聚乙二醇化(PEGylation)可有效改善其药代动力学及降低抗药物抗体的产生(Anti-Drug Antibody，ADA)。然而临床研究发现，PEG自身具有一定的免疫原性，反复注射会引起机体的免疫反应，造成蛋白质药物在血液中的加速清除(Accelerated Blood Clearance，ABC)^[49~51]。在众多潜在的PEG替代高分子中，由于多数聚合物为无规卷曲的构象，并且难以有效拆分一级结构与二级结构各自的生物效应，聚合物二级结构在蛋白质修饰与改性中的影响研究几近空白^[52]。

  笔者课题组通过使用单一手性的L-氨基酸或外消旋DL-氨基酸为单体原料，制备了分子量为20kDa的α-螺旋型聚氨基酸_L-P(EG₃Glu)和无规卷曲聚氨基酸聚氨基酸_DL-P(EG₃Glu)。通过定点偶联技术^{[53, 54]}，将以上两种聚氨基酸和PEG分别与药物蛋白干扰素-α2b(IFN)偶联，得到了三种同系物L_20K-IFN、DL_20K-IFN和PEG_20k-IFN(图 3a)^[55]。大鼠体内的免疫实验结果表明，修饰了α-螺旋聚氨基酸的L_20K-IFN在重复给药后引起的免疫反应最为微弱，具体表现为血液中抗干扰素与抗聚氨基酸的抗体滴度均较低(图 3(b)，3(c))。此外，这一结论在另一个药物蛋白模型生长激素(GH)-聚氨基酸偶联物中得到了进一步的验证。以上研究表明，α-螺旋型聚氨基酸对蛋白质的修饰可有效抑制ADA的产生，且效果显著优于无规卷曲聚氨基酸和PEG链的修饰，这与聚氨基酸P(EG₃Glu)螺旋结构改善其表面抗污性能的结论基本一致。以上研究为设计新一代隐身高分子及低免疫原性蛋白质药物提供了新的切入点。

  图 3

  

  图 3.  (a) 采用自然化学连接技术制备N-端特异性偶联的干扰素(或生长激素)-聚氨基酸(或聚乙二醇)偶联物示意图(聚氨基酸和聚乙二醇的分子量均在20 kDa左右)；(b，c)四次免疫后的抗蛋白抗体免疫球蛋白IgG(b)和IgM(c)的滴度水平^[55]

  Figure 3.  (a) The synthesis of site-specific conjugation of PαAAs or PEG to IFN and GH via native chemical ligation; the molecular weight (M_n) of all polymers are ~20 kDa; (b-c) Antiprotein antibody titers (IgG) (b) and IgM (c) after the fourth immunization^[55]

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  4.   结语

  构效关系的阐明是材料化学永恒的主题。相比于无规卷曲的柔性高分子链，α-螺旋聚氨基酸的刚性结构和偶极矩的存在使其在表面修饰、细胞内吞调节、蛋白质药物免疫原性的降低、纳米药物载体和聚合物自组装形貌的调控等方面得到研究与应用。虽然目前科研工作者在二级结构的生物医药应用方面取得了长足的进展，但是结论的普适性以及不同层次的作用机制尚不明确，有待进一步深入探索。未来的研究中，聚氨基酸二级结构可作为材料科学和生命科学的桥梁，帮助人们更好地进行分子设计以及模拟蛋白质生理功能。与此同时，发展聚氨基酸的聚合方法学、设计具有二级结构可逆转变的新颖聚氨基酸分子、合成序列可控的聚氨基酸链、研究二级结构在聚氨基酸链折叠中的效应以及拓展聚氨基酸二级结构在其他领域的应用(如组织工程、包装领域、液晶材料、功能膜材料、纳米催化等)也是值得深入探索的方向^[56~63]。

  
  ^#中国化学会“中国青年化学家元素周期表”活动特约稿件
  
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  57. [57]

      Yuan J, Zhang Y, Sun Y, et al. Biomacromolecules, 2018, 19(6):2089~2097. doi: 10.1021/acs.biomac.8b00204

  58. [58]

      Xiong W, Fu X, Wan Y, et al. Polym. Chem., 2016, 7(41):6375~6382. doi: 10.1039/C6PY01364C

  59. [59]

      Gharakhanian E G, Bahrun E, Deming T J. J. Am. Chem. Soc. 2019, 141(37):14530~14533. doi: 10.1021/jacs.9b07223

  60. [60]

      Liu H, Wang R, Wei J, et al. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140(21):6604~6610 doi: 10.1021/jacs.8b01873

  61. [61]

      Grazon C, Salas-Ambrosio P, Ibarboure E, et al. Angew. Chem. Int. Ed., 2020, 59(2):622~626. doi: 10.1002/anie.201912028

  62. [62]

      Zhao W, Lv Y, Li J, et al. Nat. Commun., 2019, 10:3590. doi: 10.1038/s41467-019-11524-y

  63. [63]

      Zhao L, Wang X, Sun L, et al. Polym. Chem., 2019, 10(38):5206~5214. doi: 10.1039/C9PY01040H

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  图 1  (a) 四种端基为巯基、侧链为寡聚乙二醇、主链为聚谷氨酸的化学结构和二级结构示意图；(b)具有不同二级结构和巯基端基的聚氨基酸在基底表面形成的涂层示意图；(c)牛血清白蛋白(BSA)在不同聚氨基酸涂层表面的吸附情况；涂层的制备调节：聚氨基酸浓度分别采用0.1和1.0mg/mL，时间12h；其中聚乙二醇涂层制备的浓度为1.0mg/mL；图中的百分比为相对于蛋白BSA在裸金片表面的吸附量^[33]

  Figure 1  (a) Chemical and secondary structures of the four P(EG₃Glu)s used (L-C, L-N, DL-C, and DL-N). (b) Cartoon illustration of different PαAAs adlayers on gold surfaces. (c) BSA adsorption on different PαAAs adlayers prepared at 0.1 and 1.0mg/mL adsorbate concentration for 12h, respectively. PEG coating was prepared with 1.0mg/mL adsorbate. The percentage was calculated by normalization of the adsorbed protein on each polymer adlayer to that on the bare gold surface^[33]

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  图 2  (a) 表面修饰有不同二级结构和锚定去向的聚氨基酸的金纳米颗粒示意图，箭头表示偶极矩的方向，δ⁺和δ^-分别表示偶极矩的正极和负极；(b, c)孵育6h和12h后细胞对右手螺旋聚氨基酸(b)和无规卷曲聚氨基酸(c)分别以不同取向修饰得到金纳米颗粒的摄取情况^[48]

  Figure 2  (a) Schematic illustration of AuNPs modified with P(EG₃Glu)s with different secondary structures and/or anchoring orientations. Arrows indicate the moment of the helix macrodipole. δ⁺ and δ^- indicate the partially positive and negative dipole ends of the helices, respectively. (b, c) The internalization level of AuNPs coated with the right-handed helical PαAAs (b) or unstructured PαAAs (c) anchoring from different orientations after 6 and 12 h incubation^[48]

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  图 3  (a) 采用自然化学连接技术制备N-端特异性偶联的干扰素(或生长激素)-聚氨基酸(或聚乙二醇)偶联物示意图(聚氨基酸和聚乙二醇的分子量均在20 kDa左右)；(b，c)四次免疫后的抗蛋白抗体免疫球蛋白IgG(b)和IgM(c)的滴度水平^[55]

  Figure 3  (a) The synthesis of site-specific conjugation of PαAAs or PEG to IFN and GH via native chemical ligation; the molecular weight (M_n) of all polymers are ~20 kDa; (b-c) Antiprotein antibody titers (IgG) (b) and IgM (c) after the fourth immunization^[55]

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