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• 姜黄素是从姜黄植物中分离出来的一种天然植物多酚类化合物，主要是作为香料、着色剂、化妆品添加剂及传统医学治疗剂。最近，科学家发现姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等重要的药理活性^[1~4]。除此之外，姜黄素对人体消化系统和心血管系统也具有保健作用。姜黄素分子是由两个阿魏酸残基通过亚甲基连接而成，其苯环上的羟基、烯烃上的双键以及二酮基被认为是姜黄素的主要活性基团^[5]。虽然姜黄素在治疗和预防各种炎症和疾病方面都有显著的效果，但是由于其超低的生物利用度，姜黄素作为一种有效治疗剂的实际临床应用却受到了严重限制^[6]。研究发现，经口服后姜黄素出现在人体血浆中的含量极少，绝大多数姜黄素会迅速在人体胃肠道分解代谢，最后由粪便及尿液排出体外。主要原因是姜黄素难溶于酸性和中性pH的水溶液，这会导致姜黄素在人体胃肠系统的吸收率极低。在碱性条件下，姜黄素容易降解为阿魏酸、阿魏酸甲烷、香草醛和顺式6-(4′-羟基-3′-甲氧基苯基)-2, 4-二氧-5-己烯醛^{[7, 8]}。

  许多研究者发现蛋白质能够通过疏水、氢键等弱相互作用对姜黄素等进行包载，从而可以有效提高姜黄素的水溶性、稳定性和生物利用度^[9~11]。但是，蛋白质自身存在稳定性问题。在某些pH、盐及温度等条件下，蛋白质容易发生聚集，进而会影响其对姜黄素的包载效果。另一方面，蛋白质与多糖可以通过静电吸引作用生成蛋白质/多糖复合物^[12]。蛋白质与多糖之间的静电吸引作用会受到蛋白质和多糖的分子结构、pH、离子强度等条件的影响。伍敏晖等^[13]曾使用高压微射流均质方法制备了乳清蛋白稳定的姜黄素乳液。McClements等^[14]在蛋白质稳定的乳液体系中加入多糖作为稳定剂，发现蛋白质与多糖之间的静电吸引作用会进一步提高乳液体系的稳定性。最近，笔者课题组使用牛血清蛋白(BSA)/ι-卡拉胶复合物包载姜黄素，发现BSA与ι-卡拉胶之间的静电吸引作用能够使姜黄素的缔合常数增大并提高姜黄素的稳定性和抗氧化性^[15]。

  BSA是从牛血清中分离出来的一种球蛋白，通常被用作模型试验蛋白质。卡拉胶是一类从海洋红藻中提取的阴离子多糖，是由硫酸基化的或非硫酸基化的半乳糖和3, 4-脱水半乳糖通过α-1, 3和β-1, 4糖苷键交替连接而成。目前，市场上常见的卡拉胶有κ-、ι-、λ-三种类型，其二糖单元分别含有1、2、3个硫酸基。在本研究中，选择κ-卡拉胶和λ-卡拉胶与BSA通过静电吸引作用共同构筑了BSA/卡拉胶复合物，研究了BSA/卡拉胶复合物包载姜黄素的溶解度、稳定性、紫外及荧光性质、缔合常数和pK_a1，重点考察了不同卡拉胶电荷量对BSA/卡拉胶复合物包载姜黄素的影响规律。

  1.   实验部分

  1.1   试剂

  BSA(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，κ-卡拉胶(TCI(上海)化成工业发展有限公司)，λ-卡拉胶和姜黄素(Sigma-Aldrich(中国)贸易有限公司)。其他试剂均为市售分析纯级，水为重蒸水。

  1.2   BSA/卡拉胶复合物的制备

  使用pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液，将κ-卡拉胶和λ-卡拉胶分别加入到BSA溶液中，获得BSA/κ-卡拉胶复合物和BSA/λ-卡拉胶复合物。样品中，BSA浓度为0.5g/L，卡拉胶浓度为0~0.5 g/L。

  1.3   Zeta电位的测定

  使用Nano ZS动态光散射仪(英国马尔文公司)测定BSA/卡拉胶复合物的Zeta电位。将仪器温度设置到25℃后预热30min，样品在25℃下恒温5min后开始测量，每个样品至少测量3次。

  1.4   姜黄素的溶解度测定

  向BSA/卡拉胶复合物溶液中加入姜黄素。磁力搅拌1h后，将样品以10000r/min离心20min，除去未溶解的姜黄素。取一定量姜黄素溶液和乙醇混合，利用姜黄素在乙醇中的溶解度标准曲线计算姜黄素在BSA/卡拉胶复合物溶液中的溶解度。

  1.5   姜黄素的稳定性测定

  将姜黄素加入到BSA/卡拉胶复合物溶液中，姜黄素浓度为10μmol/L。在25℃下，使用Shimadzu UV-1800型紫外光谱仪测定不同样品中姜黄素的紫外吸收光谱，根据424nm处姜黄素紫外吸收强度随时间的变化考察姜黄素的稳定性。比较了游离姜黄素、姜黄素在纯BSA以及BSA/卡拉胶复合物中的稳定性。

  1.6   姜黄素的紫外、荧光光谱测定

  在25℃下，测定游离姜黄素、姜黄素在纯BSA以及BSA/卡拉胶复合物中的紫外吸收光谱。紫外波长扫描范围为300~500 nm。同时，使用Shimadzu RF-5301荧光光谱仪测定不同姜黄素样品在500~700 nm之间的荧光发射光谱。

  1.7   姜黄素的缔合常数测定

  利用姜黄素对BSA的荧光猝灭作用，测定姜黄素对BSA/卡拉胶复合物的缔合常数。测定BSA在300~420 nm之间的荧光发射光谱，考察加入不同浓度姜黄素时BSA荧光强度的变化。根据公式(1)计算姜黄素与BSA/卡拉胶复合物的缔合常数^[16]。

  $ \log \frac{\left(F_{0}-F\right)}{F}=\log K_{\mathrm{b}}+n \log [\text { Curcumin }] $

  (1)

  式中，F₀是未加入姜黄素时BSA在335nm处的荧光强度，F是加入不同浓度姜黄素时BSA在335nm处的荧光强度，K_b是缔合常数，n是缔合位点数，[Curcumin]是姜黄素的浓度。

  1.8   姜黄素的pK_a1测定

  采用pH滴定方法测定姜黄素的最低酸离解常数(pK_a1)^[17]。使用浓HCl或浓NaOH将游离姜黄素、BSA/卡拉胶复合物包载姜黄素样品的pH从2到12依次调节。分别测定不同pH条件下姜黄素在300~600 nm范围内的紫外吸收光谱，根据公式(2)计算平均吸收波长(λ)。将平均吸收波长对pH作图，从拟合得到Sigmoidal型曲线的中点对应的pH获得姜黄素的pK_a1。

  $ \bar{\lambda}=\frac{\sum\limits_{\lambda=300 \mathrm{nm}}^{\lambda=600{\rm nm}} \mathrm{OD}(\lambda) \times \lambda}{\sum\limits_{\lambda=300 \mathrm{nm}}^{\lambda=600 \mathrm{nm}} \mathrm{OD}(\lambda)} $

  (2)

  式中，OD为姜黄素在波长λ处的紫外吸收强度。

  2.   结果与讨论

  2.1   BSA/卡拉胶复合物的制备

  在pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，纯BSA(0.5g/L)的Zeta电位为-7.7mV。虽然BSA同时含有带正电荷的氨基和带负电荷的羧基，由于pH 7.0高于BSA的等电点(pH 4.5~4.8)，所以在pH 7.0条件下纯BSA整体显示负电荷。另一方面，纯κ-卡拉胶和λ-卡拉胶(0.5g/L)的Zeta电位分别为-40.2mV和-74.6mV。在稀溶液中，两种卡拉胶的Zeta电位主要取决于其糖链所携带的硫酸基数目。κ-卡拉胶的二糖单元只有1个硫酸基，而λ-卡拉胶的二糖单元带有3个硫酸基。所以，λ-卡拉胶比κ-卡拉胶带有更高的负电荷。

  当向BSA溶液中加入阴离子卡拉胶时，生成的BSA/κ-卡拉胶复合物和BSA/λ-卡拉胶复合物(BSA和卡拉胶浓度均为0.5g/L)的Zeta电位分别为-25.6mV和-37.2mV。这些Zeta电位绝对值比纯BSA要大，而比纯κ-卡拉胶和λ-卡拉胶要小。这说明卡拉胶带负电荷的硫酸基与BSA带正电荷的氨基能够产生静电吸引作用，从而生成BSA/卡拉胶复合物^[15]。由于λ-卡拉胶有更多带负电荷的硫酸基，因此BSA/λ-卡拉胶复合物比BSA/κ-卡拉胶复合物具有更大的Zeta电位绝对值。同时，BSA/卡拉胶复合物的Zeta电位绝对值比纯BSA要明显增大。这说明BSA/卡拉胶复合物之间存在较强的电荷排斥作用，使BSA/卡拉胶复合物具有明显提高的稳定性^[18]。在25℃下放置一周，纯BSA溶液会出现明显相分离现象，而两种BSA/卡拉胶复合物溶液还能够保持初始状态，它们的Zeta电位基本保持不变。

  2.2   姜黄素在BSA/卡拉胶复合物溶液中的溶解度

  由于分子中含有苯环、双键等多个疏水基团，姜黄素几乎不溶于酸性和中性的水溶液。文献报道姜黄素在水中溶解度只有11μg/L^[19]。通过溶解度实验，测定姜黄素在纯BSA溶液中的溶解度为3mg/L，比游离姜黄素的溶解度提高了270多倍。这是由于姜黄素的疏水基团能够缔合于BSA的疏水微区，从而显著提高了姜黄素的溶解度。图 1为姜黄素在BSA/卡拉胶复合物溶液中的溶解度。随着κ-卡拉胶的浓度从0增加到0.5g/L，姜黄素的溶解度从3mg/L增加到3.4mg/L。在BSA/λ-卡拉胶复合物溶液中，姜黄素的溶解度更高。当加入0.5g/L λ-卡拉胶时，姜黄素的溶解度可达到4.7mg/L。曾经有报道指出姜黄素的缔合会使蛋白质的肽链展开^[9]，从而在一定程度上破坏蛋白质的疏水微区。卡拉胶是通过静电吸引作用与BSA表面的氨基结合，并没有直接与BSA疏水微区的氨基酸残基发生作用。但是，卡拉胶能够稳定BSA的折叠结构，促进BSA为姜黄素提供疏水的缔合微环境^[15]。因此，BSA/卡拉胶复合物能够提高姜黄素的溶解度。相比κ-卡拉胶，与BSA结合后λ-卡拉胶的Zeta电位绝对值减小得更多。这说明带有更高负电荷的λ-卡拉胶与BSA存在更强的静电吸引作用，这可以更大程度保护BSA的疏水微区，从而更加显著地增大姜黄素的溶解度。

  图 1

  

  图 1.  姜黄素在BSA/卡拉胶复合物溶液中的溶解度

  Figure 1.  Solubility of curcumin in the solution of BSA/Carrageenan complexes

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  2.3   姜黄素在BSA/卡拉胶复合物溶液中的稳定性

  通过测定姜黄素的最大紫外吸收峰强度随时间的变化来考察姜黄素的稳定性^[8]。图 2比较了游离姜黄素、纯BSA以及BSA/卡拉胶复合物包载姜黄素的稳定性结果。在pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，超过50%的游离姜黄素在10h内发生降解。姜黄素在水溶液中的降解主要是由于其酮-烯醇结构的不稳定性，姜黄素分子上的活泼碳原子容易失去质子，导致姜黄素共轭结构的破坏^[20]。当使用纯BSA包载姜黄素时，只有大约37%的姜黄素在10h内发生降解。这是由于姜黄素分子可以缔合于BSA的疏水微区，从而提高了姜黄素的共轭二烯结构的稳定性。BSA/卡拉胶复合物可以进一步提高姜黄素的稳定性。姜黄素的稳定性顺序为：BSA/λ-卡拉胶复合物>BSA/κ-卡拉胶复合物>纯BSA。这表明带有更高负电荷的λ-卡拉胶与BSA生成的BSA/λ-卡拉胶复合物能够为姜黄素提供更好的疏水缔合微环境，减弱姜黄素的共轭二烯结构与水的接触，从而使姜黄素表现出更高的稳定性。

  图 2

  

  图 2.  姜黄素在不同样品中的稳定性

  Figure 2.  Stability of curcumin in different samples

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  2.4   姜黄素与BSA/卡拉胶复合物的缔合常数

  BSA通常在335nm处表现出特征发射荧光，这主要来源于含有芳香基团的色氨酸。兰瑞家^[21]曾经使用荧光法研究了姜黄素与BSA之间的缔合过程，发现姜黄素会对BSA的荧光产生静态猝灭。通过测定不同浓度姜黄素对BSA荧光的猝灭作用，可以确定姜黄素与BSA/卡拉胶复合物的缔合常数^[16]。图 3给出了加入不同浓度姜黄素时BSA的荧光光谱。随着姜黄素浓度的增加，BSA在335nm处的荧光强度出现逐渐下降的趋势，此结果可以为姜黄素缔合于BSA的疏水微区提供证据。通过对log(F₀-F)/F-log[Curcumin]曲线的线性拟合，可以得到姜黄素与BSA/卡拉胶复合物的缔合常数(K_b)。姜黄素与纯BSA的缔合常数为2×10^5[15]，姜黄素与BSA/κ-卡拉胶复合物和BSA/λ-卡拉胶复合物的缔合常数分别为4.6×10⁷和8.8×10⁷。在这三种蛋白质体系中，姜黄素与BSA/λ-卡拉胶复合物的缔合常数最大，这与姜黄素的溶解度和稳定性结果一致。带有更高负电荷的λ-卡拉胶通过静电吸引作用吸附于BSA表面，能够最大程度稳定BSA的折叠结构，使BSA为姜黄素提供更加疏水的缔合微环境，从而使BSA/λ-卡拉胶复合物表现出对姜黄素更高的缔合能力。

  图 3

  

  图 3.  不同姜黄素浓度时BSA/卡拉胶复合物中BSA的荧光发射光谱

  1~12姜黄素浓度分别为0, 0.7, 2.1, 3.4, 4.8, 6.1, 6.8, 8.2, 9.5, 10.6, 11.6, 12.5μmol/L

  Figure 3.  Fluorescence spectra of BSA in BSA/Carrageenan complexes at different curcumin concentrations

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  2.5   BSA/卡拉胶复合物包载姜黄素的紫外吸收光谱与荧光发射光谱

  姜黄素的紫外吸收光谱和荧光发射光谱可以用来考察姜黄素与BSA/卡拉胶复合物的缔合行为。

  如图 4所示，游离姜黄素分别在415和578 nm处有最大吸收峰和荧光发射峰。纯BSA包载的姜黄素比游离姜黄素的紫外吸收强度略微变大，而纯BSA包载的姜黄素的荧光强度约是游离姜黄素的4.6倍。游离姜黄素处于一个极性较大的水环境中，其荧光基团相当不稳定，而且易受到溶剂成分的猝灭作用^[22]。当纯BSA对姜黄素包载时，姜黄素缔合于BSA的疏水微区，其所处的环境从亲水变为疏水，这会大大提高姜黄素荧光基团的稳定性^[11]。在BSA/卡拉胶复合物溶液中，姜黄素的紫外吸收强度和荧光强度通常会随着卡拉胶浓度的增大而进一步增强。这说明卡拉胶与BSA的静电结合能够抑制姜黄素对蛋白质折叠结构的破坏作用，为姜黄素提供更加疏水的缔合微环境。由于λ-卡拉胶比κ-卡拉胶与BSA具有更强的静电吸引作用，所以BSA/λ-卡拉胶复合物会更加显著地提高姜黄素的紫外和荧光强度。另外，当卡拉胶浓度大于0.3g/L时，姜黄素在BSA/卡拉胶复合物中的荧光强度会略有下降。这是高浓度姜黄素产生的自猝灭效应导致的结果^[23]。

  图 4

  

  图 4.  (a) 游离姜黄素的紫外吸收光谱和荧光光谱；(b)姜黄素在BSA/卡拉胶复合物中的紫外吸收强度变化曲线；(c)姜黄素在BSA/卡拉胶复合物中的荧光强度变化曲线

  Figure 4.  (a) Absorption and fluorescence spectra of free curcumin; (b) Change of absorbance intensity of curcumin in BSA/Carrageenan complexes as a function of carrageenan concentration; (c) Change of fluorescence intensity of curcumin in BSA/Carrageenan complexes as a function of carrageenan concentration

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  2.6   BSA/卡拉胶复合物包载姜黄素的pK_a1

  为了进一步理解BSA/卡拉胶复合物对姜黄素的包载作用，采用pH滴定方法测定了姜黄素的最低酸离解常数(pK_a1)。图 5给出了纯BSA和BSA/卡拉胶复合物包载姜黄素的平均吸收波长随pH的变化曲线。由Sigmoidal型pH滴定曲线的中点即可确定姜黄素的pK_a1^[17]。姜黄素的pK_a1对应于其烯醇基团去质子反应Curcumin=Curcumin^- + H⁺。文献报道游离姜黄素的pK_a1为8.38^[24]，而纯BSA、BSA/κ-卡拉胶复合物、BSA/λ-卡拉胶复合物包载姜黄素的pK_a1分别为7.27、7.45和7.81。相比游离姜黄素，被包载姜黄素pK_a1的明显降低主要是由于BSA的疏水微区能够增大姜黄素的溶解度，使姜黄素的去质子化平衡向右移动，从而生成更多的姜黄素负离子。但是，相比纯BSA，BSA/κ-卡拉胶复合物和BSA/λ-卡拉胶复合物包载的姜黄素的pK_a1分别增大了0.18和0.54。这说明卡拉胶的负电荷在一定程度上会抑制姜黄素的去质子化，促进姜黄素的去质子化平衡向左移动，最终使姜黄素的pK_a1呈现增大的趋势^[25]。姜黄素的pK_a1越大，说明缔合于BSA疏水微区的中性姜黄素成分就越多。在三种蛋白质体系中，BSA/λ-卡拉胶复合物包载姜黄素具有最大的pK_a1，与姜黄素在BSA/λ-卡拉胶复合物溶液中具有最高的溶解度和稳定性相一致。

  图 5

  

  图 5.  纯BSA和BSA/卡拉胶复合物包载姜黄素的pH滴定曲线

  Figure 5.  pH titration curves of curcumin in pure BSA and BSA/Carrageenan complexes

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  3.   结论

  本文研究了两种不同结构的卡拉胶对BSA/卡拉胶复合物包载姜黄素的增强作用。相比纯BSA，BSA/卡拉胶复合物能够显著提高姜黄素的溶解度、稳定性和缔合能力。姜黄素的紫外吸收光谱和荧光发射光谱表明姜黄素主要通过疏水作用缔合于BSA的疏水微区。虽然卡拉胶没有直接与BSA的疏水微区发生作用，但是卡拉胶能够稳定BSA的折叠结构，促进BSA为姜黄素提供更加疏水的缔合微环境。相比κ-卡拉胶，带有更高负电荷的λ-卡拉胶与BSA生成的BSA/λ-卡拉胶复合物对姜黄素表现出更大的包载性能。姜黄素的pK_a1结果表明卡拉胶可以抑制姜黄素的去质子化，使姜黄素的去质子化平衡向左移动。在BSA/λ-卡拉胶复合物中，姜黄素存在最大比例的中性成分。BSA/卡拉胶复合物具有稳定性高、结构可控、生物相容性好等优点。因此，由天然大分子通过静电吸引作用构筑的蛋白质/多糖复合物有望作为一种高效微胶囊载体应用于疏水性药物分子的包载、输送及性能调控。

  
  
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  图 1  姜黄素在BSA/卡拉胶复合物溶液中的溶解度

  Figure 1  Solubility of curcumin in the solution of BSA/Carrageenan complexes

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  图 2  姜黄素在不同样品中的稳定性

  Figure 2  Stability of curcumin in different samples

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  图 3  不同姜黄素浓度时BSA/卡拉胶复合物中BSA的荧光发射光谱

  Figure 3  Fluorescence spectra of BSA in BSA/Carrageenan complexes at different curcumin concentrations

  1~12姜黄素浓度分别为0, 0.7, 2.1, 3.4, 4.8, 6.1, 6.8, 8.2, 9.5, 10.6, 11.6, 12.5μmol/L

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  图 4  (a) 游离姜黄素的紫外吸收光谱和荧光光谱；(b)姜黄素在BSA/卡拉胶复合物中的紫外吸收强度变化曲线；(c)姜黄素在BSA/卡拉胶复合物中的荧光强度变化曲线

  Figure 4  (a) Absorption and fluorescence spectra of free curcumin; (b) Change of absorbance intensity of curcumin in BSA/Carrageenan complexes as a function of carrageenan concentration; (c) Change of fluorescence intensity of curcumin in BSA/Carrageenan complexes as a function of carrageenan concentration

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  图 5  纯BSA和BSA/卡拉胶复合物包载姜黄素的pH滴定曲线

  Figure 5  pH titration curves of curcumin in pure BSA and BSA/Carrageenan complexes

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