English

• 三价铬(Cr³⁺)是人体中重要的微量元素, 一般情况下由人类和自然资源释放到环境中的过渡金属通过食物链在人体中积累.其中, Cr³⁺离子对维持有效的碳水化合物、脂质和蛋白质的代谢起着重要的作用.然而, Cr³⁺离子却被认为是一种致癌物质, 对人类的健康具有极大的危害^[3].世界卫生组织(WHO)规定饮用水中Cr³⁺离子的最大浓度为50 μg/L, 正常人每天需要吸收25~35 μg的Cr³⁺离子以改善葡萄糖和脂肪的代谢.人体内Cr³⁺离子含量的增加会导致患心血管疾病和糖尿病的风险, 而过量摄入Cr³⁺离子也会对细胞的结构产生不良影响^[9].此外, 由于近些年各种工业和农业活动的大规模增加, Cr³⁺离子已经成为了一种主要的污染物, 其主要存在于CrO₄^2-和Cr₂O₇^2-中并且最终被还原为Cr³⁺离子^[10].目前, 测定Cr³⁺离子的常用方法包括分光光度法、电化学方法、原子吸收光谱法(AAS)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-MS)^[18].虽然AAS和ICP-MS快速准确, 但其价格昂贵.电化学传感器一般需要经过长时间的准备, 并且频繁校准, 不适合长期操作.分光光度法通常检测极限都比较差.而荧光测定法由于其具有合成简单、高灵敏度和即时响应等众多优点而引起了众多科研工作者的广泛关注.近些年来探索新型荧光探针的合成与检测重金属离子和过渡金属离子已经在超分子化学、有机化学、药物输送、生物化学和环境化学等研究领域展现其诱人的前景^[20].因此, 用荧光测定法检测环境和生物样品中的Cr³⁺离子显得至关重要.但是, 目前很少有关于Cr³⁺离子荧光检测的报道.这可能是由于Cr³⁺离子的顺磁性特征和检测环境的复杂性, 使得大部分荧光探针是荧光猝灭型的, 而在实际样品和细胞中增强型探针普遍具有更加优良的性能.因此, 开发荧光增强型探针成为一项具有挑战性的任务.目前, 有多种电子跃迁机制用于开发新型荧光增强型探针, 例如螯合增强荧光(CHEF)、荧光共振能量转移(FRET)、光诱导电子转移(PET)、光诱导质子转移(PPT)、激发态分子间质子转移(ESIPT)、分子间电荷转移(ICT)、C＝N异构化等^[21].在所提到的机制中, 基于ICT机制的探针已被广泛应用.于是, 我们设计了一种以8-羟基喹啉醛与硫代碳酰肼缩合得到的新型荧光探针(图 1).加入Cr³⁺离子后, 探针L显示出肉眼可见的颜色变化和显著的荧光增强, 并且一些常见金属离子包括Na⁺, K⁺, Ba²⁺, Hg²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Fe³⁺和Al³⁺等对其荧光几乎没有影响.

  图 1

  

  图 1.  化合物L的合成

  Figure 1.  Synthetic route of compound L

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  1.   结果与讨论

  1.1   探针L的设计、合成

  席夫碱是一类含有C＝N双键的化合物, 大多数能够与金属离子螯合形成一种具有荧光特征的“平面、刚性和大共轭π键”的配合物.尤其是当席夫碱与金属离子配位后C＝N双键的构型会产生变化, 导致光谱产生变化, 从而实现对特定离子或分子的选择性识别.因此, 我们通过在硫代碳酰肼中引入2个8-羟基喹啉荧光团得到了化合物L.其产率较高, 并通过IR, ¹H NMR, ¹³C NMR谱和质谱以及元素分析表征了其结构.

  1.2   荧光和吸收光谱研究

  由于络合型荧光探针容易受到其他金属离子的影响, 我们通过荧光光谱检测法做了探针L对18种常见金属离子的选择性实验.以296 nm作为激发波长来检测探针L对金属离子的选择性.在CH₃CN/H₂O混合溶液(V:V＝1:2, Tris缓冲液50 mmol/L, pH＝7.3)中探针L的荧光发射光谱, 如图 2所示.探针L在296 nm的激发波长下表现出较弱的荧光.向探针L (3.33×10^-5 mol/L)中分别加入18种常见金属离子(3.33×10^-4 mol/L), 如Li⁺, Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺, Ag⁺, Pb²⁺, Hg²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺, Mn²⁺, Ba²⁺, Co²⁺, Cd²⁺, Ni²⁺, Al³⁺和Fe³⁺, 其荧光强度几乎不发生变化.然而, Cr³⁺的加入显着增强了探针L在430 nm处的荧光发射强度, 这可能是由于探针L分子结构中的N—N键发生旋转, 同时C—N—N键角改变, 与C＝S键形成的空腔恰好与Cr³⁺发生配位作用.根据之前的文献报道, 具有酰胺、亚胺基团的探针可以与金属离子配位, 特别是与Cr³⁺离子配位^{[18, 19]}.这些结果表明, 我们设计的探针L具有选择性检测Cr³⁺的性能.

  图 2

  

  图 2.  探针L (3.33×10^-5 mol/L)在CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris buffer 50 mmol/L, pH＝7.3)溶液中对不同金属离子(3.33×10^-4 mol/L)的荧光响应(激发波长296 nm)

  Figure 2.  Fluorescence responses of probe L (3.33×10^-5 mol/ L) in CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris buffer 50 mmol/L, pH＝7.3) solution upon the addition of various metal ions (3.33×10^-4 mol/L) (λ_ex＝296 nm)

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  为了更精确地理解探针L与Cr³⁺的络合模式, 在CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris buffer 50 mmol/L, pH＝7.3)溶液中进行了荧光滴定实验.如图 3a所示, 随着Cr³⁺的浓度增加, 溶液的颜色从无色变为浅黄色, 探针L的荧光强度在430 nm处成梯度升高.当Cr³⁺浓度增加到2.05倍后其荧光强度不再发生变化.

  图 3

  

  图 3.  (a) 在CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris缓冲液50 mmol/L, pH＝7.3)溶液中滴加0~2.05 equiv. Cr³⁺时探针L (3.33×10^-5 mol/L)的荧光发射光谱和(b)探针L在430 nm处荧光强度与Cr³⁺的线性关系

  Figure 3.  (a) Fluorescence emission spectra of probe L (3.33×10^-5 mol/L) in CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris buffer 50 mmol/L, pH＝7.3) upon the addition of Cr³⁺, and (b) linear relationship of fluorescence intensity at 430 nm of probe L as a function of Cr³⁺

  (a) Inset: Fluorescence intensity of probe L as the concentration of Cr³⁺ increase, solid line is a nonlinear fitting curve, R²＝0.99125. (b) (3S/ρ)＝2.85×10^-7

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  通过绘制非线性拟合曲线(如图 3a插图), 计算出结合常数K_a＝1.00×10⁵ L/mol, 其相关系数(R²)大于0.98, 表明探针L与Cr³⁺形成1:1复合物.同时, Job曲线和质谱检测也显示出探针L与Cr³⁺是1:1络合, 质谱检测发现探针L与Cr³⁺络合后的离子峰m/z为466.32, 与理论值466.34几乎一致.又根据荧光滴定实验进一步计算出Cr³⁺离子的检出限为2.85×10^-7 mol/L (图 3b).其检出限低于环境保护局和世界卫生组织(WHO)设定的饮用水中Cr³⁺离子(20 μmol/L)的最大允许值^[22].这些结果表明, 探针L具有较高灵敏度, 可以用于检测水中的Cr³⁺的浓度.

  为了研究其他金属离子对Cr³⁺检测的影响, 我们进行了干扰性实验.实验结果显示, Cr³⁺离子(6.66×10^-4 mol/L)与其他金属离子(6.66×10^-4 mol/L)混合物引起的探针L (3.33×10^-5 mol/L)荧光增强与单独使用Cr³⁺引起的荧光增强相似(图 4).这些金属离子的存在不会干扰探针L对Cr³⁺离子的检测, 表明探针L是具有高度选择性的Cr³⁺离子荧光探针^[21].其次, pH对探针L荧光强度的影响实验表明, 探针L可以用作在弱碱性环境或生物条件下检测有效的Cr³⁺.

  图 4

  

  图 4.  在CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris缓冲液50 mmol/L, pH＝7.3)溶液中加入各种金属离子(6.66×10^-4 mol/L)后L (3.33×10^-4 mol/L)的荧光强度

  Figure 4.  Fluorescence intensity of L (3.33×10^-4 mol/L) upon addition of various metal ions (6.66×10^-4 mol/L) in CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris buffer 50 mmol/L, pH＝7.3) solution

  The red bars: L with competing ion, blue bars: L with competing ion and Cr³⁺

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  1.3   络合模式研究

  为了研究探针L对Cr³⁺的结合模式, 我们进行了UV-Vis滴定实验.未加入Cr³⁺时探针L在260, 310和350 nm处的三个吸收峰为π-π*电荷转移^[24], 随着Cr³⁺浓度的增加, 探针L在260 nm的吸收峰逐渐减弱, 在310和350 nm处的吸收峰增加, 231和300, 334 nm处的三个等吸收点的存在和继续增加Cr³⁺后探针L的UV-Vis不再发生变化表明探针L与Cr³⁺形成了稳定的络合物. IR实验也对比了探针L与其Cr³⁺络合物的光谱变化, 探针L在1537和1499 nm处的N—C＝S键的吸收峰, 较探针L的相同位置吸收峰有一定的减弱, 这也表明C＝S键参与了形成络合物.

  为了更好的验证探针L与Cr³⁺在溶液中的配位行为, ¹H NMR (图 5)实验表明, 在0.001 mol/L的探针L的DMSO-d₆中, 加入1.0 equiv. Cr³⁺后, 探针L在δ 10.10处的羟基的信号强度明显减弱, 这表明在络合过程中OH基团参与了络合.探针L的NH (δ 12.78和12.34)与芳香区信号(δ 8.58, 8.53, 7.66和7.33)向高场移动.这些结果表明, 探针L与Cr³⁺的结合是通过与席夫碱的氮、喹啉的氮、羟基氧和硫代碳酰肼的硫的螯合反应形成刚性体系.

  图 5

  

  图 5.  探针L (0.001 mol)和L/Cr(NO₃)₃在DMSO-d₆中的氢谱(0~1.5 equiv. Cr³⁺)

  Figure 5.  ¹H NMR spectra of probe L (0.001 mol) with Cr(NO₃)₃ in DMSO-d₆ (0~1.5 equiv. Cr³⁺)

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  1.4   DFT计算

  最后, 为了更深入地了解探针L与Cr³⁺的结合机制.我们通过密度泛函理论(DFT)计算成功优化了探针L的结构及其与Cr³⁺络合物的结构(图 6).计算过程中C, H, O, N, S元素使用B3LYP/6-31G基组, Cr元素使用LANL2DZ赝势基组.我们都知道最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占分子轨道(LUMO)被称为前沿分子轨道(FMO), 它们被广泛用于更好地理解化学传感器及其复合物的光谱性质.通常情况下, 光谱性质与HOMO-LUMO间隙和电子分布密切相关.如图 6所示, 与探针L的能隙值ΔE＝2.6003 eV相比, L-Cr³⁺络合物的能隙值ΔE＝1.4728 eV, 降低了1.1275 eV, 说明Cr³⁺配位后轨道间相互作用使得配体与金属之间产生电荷转移效应, 整个分子体系的能量降低, 分子趋于更加稳定, 探针L向L-Cr³⁺络合物的转化变得更加容易^[23].根据优化后L-Cr³⁺络合物的结构可知, Cr原子到硫代碳酰肼的S原子、N原子和喹啉N原子、羟基O原子的距离分别是2.4, 1.9和1.9, 2.1 Å, 这表明羟基O原子和其中一个喹啉的N原子与硫代碳酰肼的S, N原子之间形成的空间结构恰好可以提供一个适当的螯合中心来络合Cr³⁺.此外, 该图也揭示了从HOMO向LUMO转变时电子密度分布的显着变化.探针L的HOMO轨道的π电子主要分布在硫代碳酰肼长链上, 而LUMO轨道则分布在喹啉环的一侧上.对于络合物L-Cr³⁺, HOMO轨道和LUMO轨道的π电子主要位于喹啉环的一侧.我们都知道, 喹啉环是2个荧光团, 它们之间通过硫代碳酰肼长链进行桥接, 当被激发时, 分子内的电荷会在其中移动.加入Cr³⁺后, 喹啉N的孤对电子与Cr³⁺离子紧紧纠缠在一起.因此, 改变了整个分子系统的推拉电子能力, 并且π电子结构重新分布.这就导致了络合时荧光发射强度增加, 光谱向长波方向移动的现象.说明探针L对Cr³⁺络合是通过ICT过程实现的^[25].

  图 6

  

  图 6.  探针L和L-Cr³⁺的前线分子轨道密度分布图和能隙

  Figure 6.  Electron density maps of the frontier molecular orbital structures and band gap energies of probe L and L-Cr³⁺

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  1.5   细胞成像及形态学应用研究

  为了进一步拓展探针L在生物系统中的应用, 将PC-12细胞在37 ℃下孵育30 min后在Dulbecco's modified Eagle's medium培养基进行了细胞成像实验^[26].探针L的浓度在0~20 μmol/L范围内存活率能达到85%以上.如图 7所示, 用探针L (20 μmol/L)处理PC-12细胞, 在培养基中孵育30 min后, 在倒置荧光显微镜下只能观察到明场细胞的完整形态(图 7a), 观察不到细胞的荧光(图 7b).此外, 当PC-12细胞与探针L (20 μmol/L) Cr³⁺ (20 μmol/L)在培养基共同孵育30 min后, 可以观察到明显的蓝色荧光(图 7d), 表明探针L和Cr³⁺可以进入细胞内, 并形成络合物.同时在明亮的视野中, 细胞的形态是完整的(图 7a和7c), 表明探针L可用于检测活细胞中的Cr^{3+[27, 28]}.

  图 7

  

  图 7.  HeLa细胞的明场图像和荧光图像

  Figure 7.  Bright field image and fluorescence image of HeLa cells

  Bright field image HeLa cells incubated with L (20 μmol) for 30 min at 35 ℃. (b) Fluorescence image of HeLa cells incubated with L (20 μmol/ L). (c) Bright field image of L (20 μmol/L) treated HeLa cells again incubated with Cr³⁺ (20 μmol). (d) Fluorescence image of L (20 μmol/L) treated HeLa cells and with Cr³⁺ (20 μmol/L)

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  探针L及其铬(Ⅲ)配合物的形貌特征如图 8所示.只有探针L存在时, 其形貌是交联在一起形成的枝条状结构, 引入铬(Ⅲ)后, 枝条型结构被破坏, 形成块状和胶束型结构.明显的形态学变化表明, 铬(Ⅲ)对探针L的协调作用在一定程度上对探针L在材料方面的性能有一定的影响.

  图 8

  

  图 8.  L和复合物L-Cr³⁺的SEM图像

  Figure 8.  SEM image of L and their complex with Cr³⁺

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  2.   结论

  设计并合成了一种新型席夫碱荧光探针L, 在其他金属离子存在下, 探针L对Cr³⁺具有显着荧光增强作用, 溶液的颜色由无色变为浅黄色.荧光滴定和Job曲线等研究结果表明, 探针L与Cr³⁺形成1:1络合物.结合常数K_a为1.00×10⁵ L/mol, 检测限(LOD)为2.85× 10^-7 mol/L, 探针L和Cr³⁺的络合为ICT机制.通过DFT计算优化了探针L及L-Cr³⁺的合理结构.活细胞成像实验研究结果表明, 探针L对活细胞具有低毒性, 对细胞膜具有高渗透性, 可以用于检测活细胞内的Cr³⁺.因此, 该探针具有潜在地应用于检测自然环境或生物体内的Cr³⁺的性能.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  熔点用MEL-TEMP型熔点仪测定; 荧光光谱使用F-7000型荧光光谱仪; 核磁共振氢谱、碳谱使用BrukerAV-400型核磁共振波谱仪测定; 质谱用Esquier 3000型LC-MS质谱仪测定; 在Nicolet6710-FT-IR分光光度计上记录; 元素分析使用德国Elementar Vario EL cube元素分析仪; SEM图像使用蔡司GEMINI-SEM 500扫描电子显微镜记录.实验所用试剂均为市售分析纯试剂, 所有溶剂使用前均使用标准方法纯化.

  3.2   实验方法

  3.2.1   二-(8-羟基喹啉-2-基)-硫代碳酰肼的合成

  将0.50 g (2.80 mmol) 8-羟基喹啉醛置于50 mL圆底烧瓶中, 加入10 mL甲醇完全溶解.用恒压漏斗将10 mL水+10 mL甲醇完全溶解0.15 g (1.40 mmol)的硫代碳酰肼溶液滴入圆底烧瓶中, 在65 ℃回流下反应6 h, 析出浅黄色沉淀.滤出沉淀经甲醇反复洗涤和真空干燥后收集产物1.13 g, 产率96%. m.p. 264.1~265.6 ℃; ¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 12.78 (s, 1H), 12.34 (s, 1H), 10.10 (s, 2H), 8.58 (s, 2H), 8.53 (s, 2H), 7.70~7.62 (m, 6H), 7.33 (s, 2H); ¹³C NMR (DMSO-d₆) δ: 176.09, 153.96, 151.71, 138.53, 137.03, 129.37, 128.84, 118.33, 112.67; IR (KBr) v: 3483, 3357, 2982, 1537 cm^-1; ESI-MS m/z: 417.24 ([M+H]⁺). Anal. calcd for C₂₁H₁₆N₆O₂S: C 60.57, H 3.87, N 20.18; found C 60.51, H 3.91, N 20.13.

  3.2.2   荧光光谱测定

  制备Na⁺, K⁺, Ba²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Ag⁺, Pb²⁺, Hg²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Cr³⁺, Cd²⁺, Fe³⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, Al³⁺的硝酸盐储备液.将化合物L溶解在V(CH₃CN)/V(H₂O)＝1/2, 50 mmol/L Tris缓冲液, pH＝7.3)中, 再将3 mL探针原液置于1 cm石英比色皿, 然后使用微量移液枪加入10 μL各金属离子原液, 制备试验溶液.荧光激发波长为296 nm(狭缝宽度为5 nm).

  3.2.3   理论计算

  使用Gaussian 09软件进行量子化学计算.用于获得探针的能量最小优化结构.通过密度泛函理论(DFT)以B3LYP/6-31G**基组进行了计算^[29].通过检查振动频率的真实最小值, 没有发现虚频.从探针L的优化结构获得最高占据分子轨道(HOMO)和最低未占分子轨道(LUMO)的电子分布图.

  3.2.4   细胞成像测试

  HeLa细胞在Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)培养基中生长, 补充10%牛血清和1%青霉素-链霉素, 在5% CO₂和95%空气的湿润气氛下于37 ℃温育24 h^[30].通过倒置荧光显微镜, 将细胞接种在培养皿上, 用于荧光显微镜成像.

  3.2.5   SEM成像实验

  使用具有1 kV加速电压的ZEISS GEMINI-SEM 500扫描电子显微镜(SEM)研究探针L的微观形态.将溶解了探针L (0.1 mol/L)和L+Cr³⁺(0.1 mol/L)的乙醇悬浮液分别置于小载玻片上, 然后在真空下蒸发溶剂来制备用于SEM研究的样品^[31].

  辅助材料(Supporting Information)  合成的新化合物的核磁氢谱、碳谱, 质谱以及探针测试的紫外光谱, 红外光谱和pH实验, JOB曲线, 细胞毒性等数据.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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  图 1  化合物L的合成

  Figure 1  Synthetic route of compound L

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  图 2  探针L (3.33×10^-5 mol/L)在CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris buffer 50 mmol/L, pH＝7.3)溶液中对不同金属离子(3.33×10^-4 mol/L)的荧光响应(激发波长296 nm)

  Figure 2  Fluorescence responses of probe L (3.33×10^-5 mol/ L) in CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris buffer 50 mmol/L, pH＝7.3) solution upon the addition of various metal ions (3.33×10^-4 mol/L) (λ_ex＝296 nm)

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  图 3  (a) 在CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris缓冲液50 mmol/L, pH＝7.3)溶液中滴加0~2.05 equiv. Cr³⁺时探针L (3.33×10^-5 mol/L)的荧光发射光谱和(b)探针L在430 nm处荧光强度与Cr³⁺的线性关系

  Figure 3  (a) Fluorescence emission spectra of probe L (3.33×10^-5 mol/L) in CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris buffer 50 mmol/L, pH＝7.3) upon the addition of Cr³⁺, and (b) linear relationship of fluorescence intensity at 430 nm of probe L as a function of Cr³⁺

  (a) Inset: Fluorescence intensity of probe L as the concentration of Cr³⁺ increase, solid line is a nonlinear fitting curve, R²＝0.99125. (b) (3S/ρ)＝2.85×10^-7

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  图 4  在CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris缓冲液50 mmol/L, pH＝7.3)溶液中加入各种金属离子(6.66×10^-4 mol/L)后L (3.33×10^-4 mol/L)的荧光强度

  Figure 4  Fluorescence intensity of L (3.33×10^-4 mol/L) upon addition of various metal ions (6.66×10^-4 mol/L) in CH₃CN/H₂O (V:V＝1:2, Tris buffer 50 mmol/L, pH＝7.3) solution

  The red bars: L with competing ion, blue bars: L with competing ion and Cr³⁺

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  图 5  探针L (0.001 mol)和L/Cr(NO₃)₃在DMSO-d₆中的氢谱(0~1.5 equiv. Cr³⁺)

  Figure 5  ¹H NMR spectra of probe L (0.001 mol) with Cr(NO₃)₃ in DMSO-d₆ (0~1.5 equiv. Cr³⁺)

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  图 6  探针L和L-Cr³⁺的前线分子轨道密度分布图和能隙

  Figure 6  Electron density maps of the frontier molecular orbital structures and band gap energies of probe L and L-Cr³⁺

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  图 7  HeLa细胞的明场图像和荧光图像

  Figure 7  Bright field image and fluorescence image of HeLa cells

  Bright field image HeLa cells incubated with L (20 μmol) for 30 min at 35 ℃. (b) Fluorescence image of HeLa cells incubated with L (20 μmol/ L). (c) Bright field image of L (20 μmol/L) treated HeLa cells again incubated with Cr³⁺ (20 μmol). (d) Fluorescence image of L (20 μmol/L) treated HeLa cells and with Cr³⁺ (20 μmol/L)

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  图 8  L和复合物L-Cr³⁺的SEM图像

  Figure 8  SEM image of L and their complex with Cr³⁺

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