新型香豆素类白藜芦醇衍生物的合成及其生物活性研究

李敏欣 黎勇坤 刘蓓 尹芃程 高慧 毛泽伟

引用本文: 李敏欣, 黎勇坤, 刘蓓, 尹芃程, 高慧, 毛泽伟. 新型香豆素类白藜芦醇衍生物的合成及其生物活性研究[J]. 化学通报, 2019, 82(11): 1043-1046. shu
Citation:  Li Minxin, Li Yongkun, Liu Bei, Yin Pengcheng, Gao Hui, Mao Zewei. Synthesis and Biological Evaluation of New Coumarin-Resveratrol Derivatives[J]. Chemistry, 2019, 82(11): 1043-1046. shu

新型香豆素类白藜芦醇衍生物的合成及其生物活性研究

    通讯作者: 毛泽伟, 男, 副教授。E-mail:maozw@ynutcm.edu.cn
  • 基金项目:

    国家自然科学基金项目(81560620)、云南省科学技术厅-云南中医药大学应用基础研究联合专项(2017FF117(-023))和云南中医药大学大学生创新创业训练计划项目(2018008)资助

摘要: 白藜芦醇是一种具有广泛生物活性的茋类化合物。为了寻找活性较强的新型分子,以白藜芦醇为原料出发,经Vilsmeier甲酰化和Knoevenagel缩合,合成了3个未见文献报道的香豆素类白藜芦醇衍生物(E)-7-羟基-5-(4-羟基苯乙烯基)香豆素衍生物(3a~3c),其结构经1H NMR、13C NMR和HRMS确证。抗炎和抗氧化活性研究发现,化合物3a具有与地塞米松相当的抗炎活性,并对超氧阴离子和羟基自由基有较强的清除作用,可做进一步研究。

English

  • 白藜芦醇(Resveratrol)又称为芪三酚,是一种非常具有代表性的茋类化合物,广泛存在于葡萄、花生和虎杖等药用植物中[1~3],具有良好的抗氧化、抗白细胞突变、抗炎、保护心血管和抗肿瘤等诸多生理活性[4~7]。因白藜芦醇独特的化学结构和低毒性的特点,研究人员期望通过对其进行化学修饰,从而寻找更加安全有效的药物。目前对白藜芦醇的研究与开发已成为药物化学的一个研究热点[8~10]。本文以白藜芦醇为原料出发,经Vilsmeier甲酰化和Knoevenagel缩合,合成了3个未见文献报道的香豆素类白藜芦醇衍生物(合成路线如图式 1所示),并对其体外抗炎和抗氧化活性进行了研究。

    图式 1

    图式 1.  (E)-3-乙酰基-7-羟基-5-(4-羟基苯乙烯基)香豆素衍生物的合成
    Scheme 1.  Synthesis of (E)-3-acetyl-7-hydroxy-5-(4-hydroxystyryl)coumarin derivatives

    Bruker AM 400核磁共振谱仪(TMS为内标);YANACO显微熔点仪(温度未校正);Thermo-Fisher二氧化碳培养箱;Epoch连续波长酶标仪;UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津)。试剂和溶剂均为市售分析纯级。

    称取4.56g (20mmol)白藜芦醇于100mL圆底烧瓶中,加入100mL干燥的CH3CN和1.61g(22mmol)N, N-二甲基甲酰胺(DMF),并置于冰水浴上搅拌。缓慢滴加4.60g(30mmol)三氯氧磷,0.5h后升至室温,继续搅拌3h。将反应物倒入300mL冷水中,在水浴60℃搅拌1h。冷却,有黄绿色固体析出,抽滤,滤饼用水洗涤3次后干燥,得黄色固体。熔点211~213℃;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:12.10(s,1H),10.74(s,1H),10.28(s,1H),9.70(s,1H),7.68(d,J=16.3Hz,1H),7.48(d,J=8.4Hz,2H),7.03(d,J=16.4Hz,1H),6.77(d,J=8.3Hz,2H),6.61(s,1H),6.22(s,1H)。

    称取2.56g(10mmol)化合物2和2.6g(20mmol)乙酰乙酸乙酯置于100mL圆底烧瓶中,加入40mL无水乙醇和0.17g(2mmol)哌啶,加热回流反应6h。反应结束后冷却至室温,真空抽滤,滤饼经无水乙醇洗涤(10mL×3)后干燥,得到2.07g棕黄色固体,收率64%。熔点217~219℃;1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ:8.90(s,1H),7.94(s,1H),6.72(s,1H),6.71(s,1H),6.68(d,J=16.5Hz,1H),6.31(d,J=15.8Hz,1H),6.21(s,1H),5.96(s,1H),5.94(s,1H),5.78(s,1H),1.70(s,3H);13C NMR (101MHz,DMSO-d6) δ:195.26,164.09,159.30,158.69,158.41,144.47,141.26,135.00,129.45,127.94,119.23,119.07,116.07,110.30,109.24,101.45,30.55;HRMS-ESI m/z:C19H14O5Na[M+Na]+,理论值345.0733,实测值345.0735。

    化合物3b3c的制备方法类似于3a

    化合物3b:淡褐色固体,收率70%,熔点202~204℃;1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:11.04 (br,1H),9.75(s,1H),7.50~7.61(m,4H),7.19(d,J=16.0Hz,1H),7.09(s,1H),6.83(d,J=8.4Hz,2H),6.64~6.66(dd,J=2.0、2.0 Hz,1H),4.32(q,J=7.1Hz,2H),1.33(t,J=7.0Hz,3H);13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ:164.97,163.94,163.87,163.81,158.67,158.22,158.13,156.77,145.89,140.61,134.93,129.44,127.98,119.29,127.98,119.29,116.05,112.58,112.40,110.16,109.06,108.85,101.50,61.40,14.62。

    化合物3c:黄褐色固体,收率75%,熔点236~238℃;1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ:9.78(br,1H),8.81(s,1H),7.56(d,J=8.6Hz,2H),7.50(d,J=16.0Hz,1H),7.28~7.32(m,2H),7.22~7.24(m,3H),7.16(d,J=16.0Hz,1H),7.07(d,J=2.2Hz,1H),6.81(d,J=8.6Hz,2H),6.64(s,1H),4.36(s,2H);13C NMR (101MHz,DMSO-d6)δ:195.38,164.19,159.17,158.69,158.36,144.96,141.95,135.47,134.93,130.30,129.42,128.62,127.93,126.92,119.14,118.77,116.06,110.27,109.28,101.46,48.03。

    采用细菌脂多糖诱导小鼠巨噬细胞炎症模型[11],以地塞米松为阳性对照药,测试化合物的抗炎活性。将对数期生长的RAW 264.7细胞(1×106个/mL)接种于96孔培养板中,先用噻唑蓝法测定化合物不同浓度的细胞毒性。确定无毒浓度后,取对数期生长的RAW264.7细胞(2×106个/mL)接种于96孔培养板中,设空白对照组、LPS(脂多糖)模型组和待测化合物组(同时加入药物和终浓度为1.5μg/mL的LPS)以及地塞米松组(终浓度为1.5μg/mL LPS),于37℃、5% CO2培养24h后,收集上清液,检测NO含量,并计算IC50,结果见表 1

    表 1

    表 1  化合物的体外抗炎活性
    Table 1.  in vitro anti-inflammatory activity of compounds
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    Compd. NO generation (IC50, μmol/L)
    1 16.22
    2 27.18
    3a 9.52
    3b 20.15
    3c >40
    Dexamethasone 10.80

    采用邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子,以维生素C为阳性对照,测定不同浓度样品溶液对超氧阴离子的清除率。

    自氧化管:在10mL比色管中,加入3mL 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)和3mL纯净水,摇匀,25℃水浴中保温20min,取出后立即加入25℃预热的0.45mL 3mmol/L邻苯三酚,迅速摇匀,随后倒入比色皿中,测定325nm处的吸光度,每隔30s记录一个数据,共记录20min。

    参比溶液:3mL缓冲溶液+3mL纯净水+0.45mL纯净水,混匀后倒入比色皿中。

    样品管:将3mL纯净水改为3mL不同浓度的样品溶液,按照上述步骤添加试剂同样操作,测定325nm处的吸光度。

    计算自氧化管线性范围内每分钟吸光度的增加值,即为邻苯三酚的自氧化速率ΔA自氧化,再计算样品管中每分钟吸光度的增加值,即为加入样品后的邻苯三酚的自氧化速率ΔA样品,超氧阴离子的清除率按式(1)计算。

    ${\rm{超氧阴离子清除率 = }}\frac{{\mathit{\Delta }{\mathit{A}_{{\rm{自氧化}}}} - \mathit{\Delta }{A_{{\rm{样品}}}}}}{{\mathit{\Delta }{A_{{\rm{自氧化}}}}}} \times 100\% $

    (1)

    准确称取一定质量1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),用乙醇溶解定容。在10mL比色管中加入3.5mL DPPH溶液,再加入1.5mL无水乙醇,混匀后于暗处放置20min,以无水乙醇为参比,测定517nm处吸光度,即为对照管的吸光度A对照。将1.5mL无水乙醇改为相同体积的不同浓度的样品溶液,与3.5mL DPPH溶液混匀后,暗处反应50min,以3.5mL无水乙醇与样品溶液混匀液作参比,测定517nm处吸光度,此即为样品管的吸光度A样品。样品溶液对DPPH自由基的清除率按式(2)计算:

    ${\rm{DPPH清除率 = }}\frac{{\mathit{\Delta }{\mathit{A}_{{\rm{对照}}}} - \mathit{\Delta }{A_{{\rm{样品}}}}}}{{\mathit{\Delta }{A_{{\rm{对照}}}}}} \times 100\% $

    (2)

    在10mL比色管中,加入0.3mL 7.5mmol/L邻菲咯啉水溶液和0.3mL 7.5mmol/L FeSO4溶液,混匀,再加入3mL无水乙醇,混匀,再加入1mL 0.3%的H2O2溶液,用无水乙醇定容至10mL,摇匀。在37℃水浴中反应60min,以1.6mL蒸馏水与无水乙醇定容至10mL的混匀液为参比,测定510nm处的吸光度[4, 5],此即为损伤管的吸光度A损伤

    不加H2O2溶液,其他试剂及操作同上,所得为未损伤管的吸光度A未损伤

    在加入H2O2溶液之前,加入一定浓度的样品溶液3.0mL,混匀。其他试剂及操作同上,所得为加药管的吸光度A加药管

    在10mL比色管中,加入3.0mL不同浓度的样品溶液和1.6mL蒸馏水,用无水乙醇定容至刻度,混匀。于510nm处测得吸光度为样品溶液本底的吸光度A本底。羟自由基清除率按式(3)计算。

    $ \cdot {\rm{OH清除率 = }}\frac{{{A_{{\rm{加药管}}}} - {A_{{\rm{本底}}}} - {A_{{\rm{损伤}}}}}}{{{A_{{\rm{未损伤}}}} - {A_{{\rm{损伤}}}}}} \times 100\% $

    (3)

    参照文献的方法,白藜芦醇经Vilsmeier反应生成(E)-2-甲酰基白藜芦醇(2)后,再通过Knoevenagel缩合得到(E)-7-羟基-5-(4-羟基苯乙烯基)香豆素衍生物(3)。Knoevenagel缩合一般采用有机碱作催化剂,常用的有机碱有吡啶和哌啶等。为了提高产物3的反应收率,以3a的合成为例,对Knoevenagel缩合的反应条件进行了优化,考察了不同有机碱和溶剂及温度对反应的影响,结果如表 2所示。

    表 2

    表 2  化合物3a的合成条件优化
    Table 2.  Optimization of reaction conditions for the synthesis of 3a
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    Entry Basea Solvent T/℃b Yield/%
    1 DBU Ethanol reflux 45
    2 DBU Ethanol 60 31
    3 DBU Pyridine 80 40
    4 DBU Pyridine reflux 27
    5 Piperidine Ethanol reflux 64
    6 Piperidine Ethanol 60 48
    7 Piperidine Pyridine 80 52
    8 Piperidine Pyridine reflux 42
    9 DABCO Ethanol reflux 50
    10 DABCO Ethanol 60 22
    11 DABCO Pyridine 80 38
    12 DABCO Pyridine reflux 41
    a0.2eq base, b6 h.

    表 2可以看出,虽然整体上反应收率不是很高,但有机碱、溶剂和温度对反应产率的影响还较大。当以哌啶作催化剂时,反应效果最好,1, 8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)次之,1, 4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)反应效果最差。另外,乙醇作溶剂时反应效果要优于吡啶,并且当以乙醇作溶剂时,升高温度有助于反应的进行,而以吡啶作溶剂时,升高温度会降低反应收率。因此,采用哌啶作催化剂、乙醇加热回流的条件下反应,目标产物3a~3c的收率为64%~75%。

    表 1可以看出,化合物3a具有较好的体外抗炎活性(IC50值为9.52μmol/L),优于白藜芦醇,与阳性对照品地塞米松的活性相当;而化合物3b3c的抗炎活性较弱。从结构上来看,香豆素结构单元与二苯乙烯酚类片段均能提高化合物的抗炎活性,且香豆素3位上含酰基时活性较优。

    图 1可以看出,4个样品(4c除外)对超氧阴离子的清除作用都很强,均与相同浓度的VC接近。由图 2可知,5个样品溶液均具备一定的清除DPPH自由基的能力,但均较VC弱。由图 3可知,化合物3a清除羟基自由基的IC50为112.3mg/L,化合物1清除羟基自由基的IC50为157.2mg/L,均低于文献[12]报道的VC清除羟自由基的IC50,表明化合物1和化合物3a清除羟自由基的能力均比VC强,而化合物3b和3c清除羟自由基的能力均低于VC。

    图 1

    图 1.  化合物对超氧阴离子的清除活性
    Figure 1.  Scavenging rate of compounds on

    图 2

    图 2.  化合物对DPPH自由基的清除活性
    Figure 2.  Scavenging rate of compounds on DPPH

    图 3

    图 3.  化合物对羟基自由基的清除活性
    Figure 3.  Scavenging rate of compounds on OH·

    本文通过Vilsmeier甲酰化和Knoevenagel缩合反应合成得到3个结构新颖的香豆素类白藜芦醇衍生物,并发现该类化合物具有较好的抗炎活性和抗氧化活性。为了研究不同官能团和取代基对该化合物生物活性的影响,更多衍生物的制备及活性研究正在进行中。


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  • 图式 1  (E)-3-乙酰基-7-羟基-5-(4-羟基苯乙烯基)香豆素衍生物的合成

    Scheme 1  Synthesis of (E)-3-acetyl-7-hydroxy-5-(4-hydroxystyryl)coumarin derivatives

    图 1  化合物对超氧阴离子的清除活性

    Figure 1  Scavenging rate of compounds on

    图 2  化合物对DPPH自由基的清除活性

    Figure 2  Scavenging rate of compounds on DPPH

    图 3  化合物对羟基自由基的清除活性

    Figure 3  Scavenging rate of compounds on OH·

    表 1  化合物的体外抗炎活性

    Table 1.  in vitro anti-inflammatory activity of compounds

    Compd. NO generation (IC50, μmol/L)
    1 16.22
    2 27.18
    3a 9.52
    3b 20.15
    3c >40
    Dexamethasone 10.80
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    表 2  化合物3a的合成条件优化

    Table 2.  Optimization of reaction conditions for the synthesis of 3a

    Entry Basea Solvent T/℃b Yield/%
    1 DBU Ethanol reflux 45
    2 DBU Ethanol 60 31
    3 DBU Pyridine 80 40
    4 DBU Pyridine reflux 27
    5 Piperidine Ethanol reflux 64
    6 Piperidine Ethanol 60 48
    7 Piperidine Pyridine 80 52
    8 Piperidine Pyridine reflux 42
    9 DABCO Ethanol reflux 50
    10 DABCO Ethanol 60 22
    11 DABCO Pyridine 80 38
    12 DABCO Pyridine reflux 41
    a0.2eq base, b6 h.
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  • 收稿日期:  2019-06-16
  • 接受日期:  2019-08-04
  • 网络出版日期:  2019-11-01
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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