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• 白藜芦醇(Resveratrol)又称为芪三酚，是一种非常具有代表性的茋类化合物，广泛存在于葡萄、花生和虎杖等药用植物中^[1~3]，具有良好的抗氧化、抗白细胞突变、抗炎、保护心血管和抗肿瘤等诸多生理活性^[4~7]。因白藜芦醇独特的化学结构和低毒性的特点，研究人员期望通过对其进行化学修饰，从而寻找更加安全有效的药物。目前对白藜芦醇的研究与开发已成为药物化学的一个研究热点^[8~10]。本文以白藜芦醇为原料出发，经Vilsmeier甲酰化和Knoevenagel缩合，合成了3个未见文献报道的香豆素类白藜芦醇衍生物(合成路线如图式 1所示)，并对其体外抗炎和抗氧化活性进行了研究。

  图式 1

  

  图式 1.  (E)-3-乙酰基-7-羟基-5-(4-羟基苯乙烯基)香豆素衍生物的合成

  Scheme 1.  Synthesis of (E)-3-acetyl-7-hydroxy-5-(4-hydroxystyryl)coumarin derivatives

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  1.   实验部分

  Bruker AM 400核磁共振谱仪(TMS为内标)；YANACO显微熔点仪(温度未校正)；Thermo-Fisher二氧化碳培养箱；Epoch连续波长酶标仪；UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津)。试剂和溶剂均为市售分析纯级。

  1.1   (E)-2, 4-二羟基-6-(4-羟基苯乙烯基)苯甲醛(2)的合成^[10]

  称取4.56g (20mmol)白藜芦醇于100mL圆底烧瓶中，加入100mL干燥的CH₃CN和1.61g(22mmol)N, N-二甲基甲酰胺(DMF)，并置于冰水浴上搅拌。缓慢滴加4.60g(30mmol)三氯氧磷，0.5h后升至室温，继续搅拌3h。将反应物倒入300mL冷水中，在水浴60℃搅拌1h。冷却，有黄绿色固体析出，抽滤，滤饼用水洗涤3次后干燥，得黄色固体。熔点211~213℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：12.10(s，1H)，10.74(s，1H)，10.28(s，1H)，9.70(s，1H)，7.68(d，J=16.3Hz，1H)，7.48(d，J=8.4Hz，2H)，7.03(d，J=16.4Hz，1H)，6.77(d，J=8.3Hz，2H)，6.61(s，1H)，6.22(s，1H)。

  1.2   (E)-3-乙酰基-7-羟基-5-(4-羟基苯乙烯基)香豆素(3a)的合成

  称取2.56g(10mmol)化合物2和2.6g(20mmol)乙酰乙酸乙酯置于100mL圆底烧瓶中，加入40mL无水乙醇和0.17g(2mmol)哌啶，加热回流反应6h。反应结束后冷却至室温，真空抽滤，滤饼经无水乙醇洗涤(10mL×3)后干燥，得到2.07g棕黄色固体，收率64%。熔点217~219℃；¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：8.90(s，1H)，7.94(s，1H)，6.72(s，1H)，6.71(s，1H)，6.68(d，J=16.5Hz，1H)，6.31(d，J=15.8Hz，1H)，6.21(s，1H)，5.96(s，1H)，5.94(s，1H)，5.78(s，1H)，1.70(s，3H)；¹³C NMR (101MHz，DMSO-d₆) δ：195.26，164.09，159.30，158.69，158.41，144.47，141.26，135.00，129.45，127.94，119.23，119.07，116.07，110.30，109.24，101.45，30.55；HRMS-ESI m/z：C₁₉H₁₄O₅Na[M+Na]⁺，理论值345.0733，实测值345.0735。

  化合物3b和3c的制备方法类似于3a。

  化合物3b：淡褐色固体，收率70%，熔点202~204℃；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ：11.04 (br，1H)，9.75(s，1H)，7.50~7.61(m，4H)，7.19(d，J=16.0Hz，1H)，7.09(s，1H)，6.83(d，J=8.4Hz，2H)，6.64~6.66(dd，J=2.0、2.0 Hz，1H)，4.32(q，J=7.1Hz，2H)，1.33(t，J=7.0Hz，3H)；¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆)δ：164.97，163.94，163.87，163.81，158.67，158.22，158.13，156.77，145.89，140.61，134.93，129.44，127.98，119.29，127.98，119.29，116.05，112.58，112.40，110.16，109.06，108.85，101.50，61.40，14.62。

  化合物3c：黄褐色固体，收率75%，熔点236~238℃；¹H NMR (400MHz，DMSO-d₆)δ：9.78(br，1H)，8.81(s，1H)，7.56(d，J=8.6Hz，2H)，7.50(d，J=16.0Hz，1H)，7.28~7.32(m，2H)，7.22~7.24(m，3H)，7.16(d，J=16.0Hz，1H)，7.07(d，J=2.2Hz，1H)，6.81(d，J=8.6Hz，2H)，6.64(s，1H)，4.36(s，2H)；¹³C NMR (101MHz，DMSO-d₆)δ：195.38，164.19，159.17，158.69，158.36，144.96，141.95，135.47，134.93，130.30，129.42，128.62，127.93，126.92，119.14，118.77，116.06，110.27，109.28，101.46，48.03。

  1.3   抗炎活性

  采用细菌脂多糖诱导小鼠巨噬细胞炎症模型^[11]，以地塞米松为阳性对照药，测试化合物的抗炎活性。将对数期生长的RAW 264.7细胞(1×10⁶个/mL)接种于96孔培养板中，先用噻唑蓝法测定化合物不同浓度的细胞毒性。确定无毒浓度后，取对数期生长的RAW264.7细胞(2×10⁶个/mL)接种于96孔培养板中，设空白对照组、LPS(脂多糖)模型组和待测化合物组(同时加入药物和终浓度为1.5μg/mL的LPS)以及地塞米松组(终浓度为1.5μg/mL LPS)，于37℃、5% CO₂培养24h后，收集上清液，检测NO含量，并计算IC₅₀，结果见表 1。

  表 1

  

  表 1  化合物的体外抗炎活性

  Table 1.  in vitro anti-inflammatory activity of compounds

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  Compd.	NO generation (IC50, μmol/L)
  1	16.22
  2	27.18
  3a	9.52
  3b	20.15
  3c	>40
  Dexamethasone	10.80

  1.4   对超氧阴离子的清除作用

  采用邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子，以维生素C为阳性对照，测定不同浓度样品溶液对超氧阴离子的清除率。

  自氧化管：在10mL比色管中，加入3mL 0.05mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)和3mL纯净水，摇匀，25℃水浴中保温20min，取出后立即加入25℃预热的0.45mL 3mmol/L邻苯三酚，迅速摇匀，随后倒入比色皿中，测定325nm处的吸光度，每隔30s记录一个数据，共记录20min。

  参比溶液：3mL缓冲溶液+3mL纯净水+0.45mL纯净水，混匀后倒入比色皿中。

  样品管：将3mL纯净水改为3mL不同浓度的样品溶液，按照上述步骤添加试剂同样操作，测定325nm处的吸光度。

  计算自氧化管线性范围内每分钟吸光度的增加值，即为邻苯三酚的自氧化速率ΔA_自氧化，再计算样品管中每分钟吸光度的增加值，即为加入样品后的邻苯三酚的自氧化速率ΔA_样品，超氧阴离子的清除率按式(1)计算。

  ${\rm{超氧阴离子清除率 = }}\frac{{\mathit{\Delta }{\mathit{A}_{{\rm{自氧化}}}} - \mathit{\Delta }{A_{{\rm{样品}}}}}}{{\mathit{\Delta }{A_{{\rm{自氧化}}}}}} \times 100\% $

  (1)

  1.5   对DPPH自由基的清除作用

  准确称取一定质量1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，用乙醇溶解定容。在10mL比色管中加入3.5mL DPPH溶液，再加入1.5mL无水乙醇，混匀后于暗处放置20min，以无水乙醇为参比，测定517nm处吸光度，即为对照管的吸光度A_对照。将1.5mL无水乙醇改为相同体积的不同浓度的样品溶液，与3.5mL DPPH溶液混匀后，暗处反应50min，以3.5mL无水乙醇与样品溶液混匀液作参比，测定517nm处吸光度，此即为样品管的吸光度A_样品。样品溶液对DPPH自由基的清除率按式(2)计算：

  ${\rm{DPPH清除率 = }}\frac{{\mathit{\Delta }{\mathit{A}_{{\rm{对照}}}} - \mathit{\Delta }{A_{{\rm{样品}}}}}}{{\mathit{\Delta }{A_{{\rm{对照}}}}}} \times 100\% $

  (2)

  1.6   对羟基自由基的清除作用

  在10mL比色管中，加入0.3mL 7.5mmol/L邻菲咯啉水溶液和0.3mL 7.5mmol/L FeSO₄溶液，混匀，再加入3mL无水乙醇，混匀，再加入1mL 0.3%的H₂O₂溶液，用无水乙醇定容至10mL，摇匀。在37℃水浴中反应60min，以1.6mL蒸馏水与无水乙醇定容至10mL的混匀液为参比，测定510nm处的吸光度^{[4, 5]}，此即为损伤管的吸光度A_损伤。

  不加H₂O₂溶液，其他试剂及操作同上，所得为未损伤管的吸光度A_未损伤。

  在加入H₂O₂溶液之前，加入一定浓度的样品溶液3.0mL，混匀。其他试剂及操作同上，所得为加药管的吸光度A_加药管。

  在10mL比色管中，加入3.0mL不同浓度的样品溶液和1.6mL蒸馏水，用无水乙醇定容至刻度，混匀。于510nm处测得吸光度为样品溶液本底的吸光度A_本底。羟自由基清除率按式(3)计算。

  $ \cdot {\rm{OH清除率 = }}\frac{{{A_{{\rm{加药管}}}} - {A_{{\rm{本底}}}} - {A_{{\rm{损伤}}}}}}{{{A_{{\rm{未损伤}}}} - {A_{{\rm{损伤}}}}}} \times 100\% $

  (3)

  2.   结果与讨论

  2.1   目标化合物的合成

  参照文献的方法，白藜芦醇经Vilsmeier反应生成(E)-2-甲酰基白藜芦醇(2)后，再通过Knoevenagel缩合得到(E)-7-羟基-5-(4-羟基苯乙烯基)香豆素衍生物(3)。Knoevenagel缩合一般采用有机碱作催化剂，常用的有机碱有吡啶和哌啶等。为了提高产物3的反应收率，以3a的合成为例，对Knoevenagel缩合的反应条件进行了优化，考察了不同有机碱和溶剂及温度对反应的影响，结果如表 2所示。

  表 2

  

  表 2  化合物3a的合成条件优化

  Table 2.  Optimization of reaction conditions for the synthesis of 3a

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  Entry	Basea	Solvent	T/℃b	Yield/%
  1	DBU	Ethanol	reflux	45
  2	DBU	Ethanol	60	31
  3	DBU	Pyridine	80	40
  4	DBU	Pyridine	reflux	27
  5	Piperidine	Ethanol	reflux	64
  6	Piperidine	Ethanol	60	48
  7	Piperidine	Pyridine	80	52
  8	Piperidine	Pyridine	reflux	42
  9	DABCO	Ethanol	reflux	50
  10	DABCO	Ethanol	60	22
  11	DABCO	Pyridine	80	38
  12	DABCO	Pyridine	reflux	41
  a0.2eq base, b6 h.

  从表 2可以看出，虽然整体上反应收率不是很高，但有机碱、溶剂和温度对反应产率的影响还较大。当以哌啶作催化剂时，反应效果最好，1, 8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)次之，1, 4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)反应效果最差。另外，乙醇作溶剂时反应效果要优于吡啶，并且当以乙醇作溶剂时，升高温度有助于反应的进行，而以吡啶作溶剂时，升高温度会降低反应收率。因此，采用哌啶作催化剂、乙醇加热回流的条件下反应，目标产物3a~3c的收率为64%~75%。

  2.2   抗炎活性

  从表 1可以看出，化合物3a具有较好的体外抗炎活性(IC₅₀值为9.52μmol/L)，优于白藜芦醇，与阳性对照品地塞米松的活性相当；而化合物3b和3c的抗炎活性较弱。从结构上来看，香豆素结构单元与二苯乙烯酚类片段均能提高化合物的抗炎活性，且香豆素3位上含酰基时活性较优。

  2.3   抗氧化活性

  由图 1可以看出，4个样品(4c除外)对超氧阴离子的清除作用都很强，均与相同浓度的VC接近。由图 2可知，5个样品溶液均具备一定的清除DPPH自由基的能力，但均较VC弱。由图 3可知，化合物3a清除羟基自由基的IC₅₀为112.3mg/L，化合物1清除羟基自由基的IC₅₀为157.2mg/L，均低于文献^[12]报道的VC清除羟自由基的IC₅₀，表明化合物1和化合物3a清除羟自由基的能力均比VC强，而化合物3b和3c清除羟自由基的能力均低于VC。

  图 1

  

  图 1.  化合物对超氧阴离子的清除活性

  Figure 1.  Scavenging rate of compounds on

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  图 2

  

  图 2.  化合物对DPPH自由基的清除活性

  Figure 2.  Scavenging rate of compounds on DPPH

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  图 3

  

  图 3.  化合物对羟基自由基的清除活性

  Figure 3.  Scavenging rate of compounds on OH·

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  3.   结论

  本文通过Vilsmeier甲酰化和Knoevenagel缩合反应合成得到3个结构新颖的香豆素类白藜芦醇衍生物，并发现该类化合物具有较好的抗炎活性和抗氧化活性。为了研究不同官能团和取代基对该化合物生物活性的影响，更多衍生物的制备及活性研究正在进行中。

  
  
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  图式 1  (E)-3-乙酰基-7-羟基-5-(4-羟基苯乙烯基)香豆素衍生物的合成

  Scheme 1  Synthesis of (E)-3-acetyl-7-hydroxy-5-(4-hydroxystyryl)coumarin derivatives

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  图 1  化合物对超氧阴离子的清除活性

  Figure 1  Scavenging rate of compounds on

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  图 2  化合物对DPPH自由基的清除活性

  Figure 2  Scavenging rate of compounds on DPPH

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  图 3  化合物对羟基自由基的清除活性

  Figure 3  Scavenging rate of compounds on OH·

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  表 1  化合物的体外抗炎活性

  Table 1.  in vitro anti-inflammatory activity of compounds

  Compd.	NO generation (IC50, μmol/L)
  1	16.22
  2	27.18
  3a	9.52
  3b	20.15
  3c	>40
  Dexamethasone	10.80

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  表 2  化合物3a的合成条件优化

  Table 2.  Optimization of reaction conditions for the synthesis of 3a

  Entry	Basea	Solvent	T/℃b	Yield/%
  1	DBU	Ethanol	reflux	45
  2	DBU	Ethanol	60	31
  3	DBU	Pyridine	80	40
  4	DBU	Pyridine	reflux	27
  5	Piperidine	Ethanol	reflux	64
  6	Piperidine	Ethanol	60	48
  7	Piperidine	Pyridine	80	52
  8	Piperidine	Pyridine	reflux	42
  9	DABCO	Ethanol	reflux	50
  10	DABCO	Ethanol	60	22
  11	DABCO	Pyridine	80	38
  12	DABCO	Pyridine	reflux	41
  a0.2eq base, b6 h.

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