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• 活性化合物是一类对人体健康存在影响的必需化合物或非必需化合物(如维生素、多酚类化合物)^[1]。这类化合物通常作为次级代谢产物以较少的量存在于食品中，但因其具有重要的生理作用，如抗心血管疾病、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗菌等，其价值又远超出食品的基本营养价值^[1~5]。因此，制药行业、药妆品及化妆品行业、食品行业对这类活性化合物格外地重视^[5~8]。2017年全球生物活性成分市场价值为298.31亿美元，预计到2022年将以6.61%的复合年增长率增长，达到410.81亿美元的市场规模。但是，该类化合物通常结构复杂，分离提取难度大，传统的化学合成方法收率通常较低^[9]，易残留有毒溶剂及催化剂中的重金属，对人体造成危害。漆酶作为近年来新兴的生物催化剂，在催化合成活性化合物方面优势明显。首先漆酶对催化位点的选择性较高；其次，漆酶具有广泛的底物谱，如苯酚、苯胺等；最后，漆酶催化的反应条件温和、绿色，在这一过程中水是唯一的副产物^[10]。此前，已有一些报道从不同的方面对漆酶在有机合成中的应用进行了介绍^{[11, 12]}，但是这些报道较少涉及到漆酶在催化合成活性化合物中的应用。

  本文结合近十年来有关漆酶的报道，对漆酶的结构及作用机制进行了说明，并着重总结了近十年来漆酶在催化合成活性化合物中的应用，并指出应用中存在的一些不足，提出了未来研究应关注的主要方向。

  1.   漆酶

  漆酶(Laccase EC 1.10.3.2)是一种含有4个铜原子的多酮氧化酶，主要存在于植物、动物、真菌及细菌中^{[13, 14]}。与植物抗坏血酸氧化酶、哺乳动物血浆铜蓝蛋白及酿酒酵母中的Fet3p铁氧化酶等同属于铜蓝氧化酶家族^[15]，它能够将O₂作为电子受体氧化多种化合物，如苯酚、苯胺、氨基酚、芳香胺及烷基胺等，在这一过程中水是唯一的副产物^{[10, 16]}。

  1.1   漆酶的结构特征

  漆酶通常以糖蛋白寡聚化形成的同工酶形式出现，分子量从50kDa到130kDa不等。糖基部分包含甘露糖、乙酰氨基葡萄糖和半乳糖，约占全酶重量的10%~50%^[17]，其可增加酶的亲水性而对酶分子具有稳定化作用^[18]。如图式 1所示，每一个单体酶分子包含4个Cu原子，分别与酶的3个氧化还原位点Type 1、Type 2、Type 3相结合，Type 3位点结合有2个Cu原子，Type 2与Type 3形成一个三核簇，Cu原子中心具有四方形的几何结构^{[19, 20]}。Type1处有一可与底物相契合的宽空腔，直接与底物的氧化相关，是底物电子进入催化位点的关键之处^{[21, 22]}。三核簇在空间上与Type1相分离，之间有一条电子转移链，电子由Type1通过此电子转移链进入三核簇，将一分子氧在三核簇中还原为两分子水^{[14, 21]}。

  图式 1

  

  图式 1.  漆酶的氧化还原位点^[20]

  Scheme 1.  Redox sites of laccase^[20]

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  1.2   漆酶的作用机制

  首先，在漆酶的Type1位点处，4个底物释放出4个电子及4个质子，紧接着电子通过Cu₁-半胱氨酸-组氨酸-Type3 Cu原子途径将电子转移到三核簇中，在三核簇中，O₂被还原为H₂O^[23]。

  图式 2显示了漆酶通过两次连续的电子传递将O₂还原为水的过程^[24]。当氧分子与三核簇结合后，反应由处于完全还原状态的漆酶开始。第一次电子传递是两个电子将氧分子还原为过氧化物，该过氧化中间体中的双氧阴离子关于Type3 Cu原子不对称，一个O与Cu₂、Cu₃离子相结合，另一个O只与Cu₃离子相结合，该步骤是整个电子传递过程中的限速步骤^{[23, 25]}。第二次电子传递导致了过氧键断裂，漆酶由过氧化状态转变为完全氧化形式的原生中间体，原生中间体中存在两个氧配体。对于这两个氧配体的存在方式有两种不同的解释，一种是这两个氧配体关于Type3 Cu原子以对称的方式存在，而另一种解释是这两个氧配体以其他不对称的形式存在^[25~27]。原生中间体可以被4个电子快速地还原，再次形成完全还原的状态，进入下一次催化循环过程，此时有两分子H₂O被释放出来^[23]。在底物缺乏的情况下，该原生中间体可以缓慢地转化成“静息”状态，此时Cu₂从桥接的结构中分离出来^{[26, 28]}。“静息酶”的Type 1位点也能够再次被底物还原，但是该途径的电子传递相当缓慢^[29]。

  图式 2

  

  图式 2.  漆酶将O₂还原为水的作用机制^[25]

  Scheme 2.  The mechanism of reduction of O₂ to water by laccase catalysis^[25]

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  2.   漆酶在催化合成或修饰活性化合物中的应用

  漆酶可将底物中的酚羟基氧化成相应的自由基，然后产生二聚体、齐聚物、高聚物(同分子偶联反应)或交叉偶联产物(异分子偶联反应)(图式 4)。

  图式 3

  

  图式 3.  漆酶催化合成的活性化合物

  Scheme 3.  Bioactive compounds synthesized by laccase catalyzed reactions

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  图式 4

  

  图式 4.  漆酶的催化合成机理^[26]

  Scheme 4.  The catalytic synthesis mechanism of laccase^[26]

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  2.1   木脂素

  木脂素是由苯丙素衍生物聚合而成的天然产物，通常具有抗氧化、抗癌、抗菌及抗病毒等活性^[31]。用漆酶催化香草醛衍生物可以合成多种类型的木脂素^[32]：阿魏酸经漆酶催化偶联可以生成双内酯木脂素；两分子香草醛衍生物经漆酶催化可生成苯并呋喃类木脂素；用三取代的香草醛β-二羰基化合物作为底物可生成联苯类木脂素，反应专一且产率极高。这些反应都是在室温条件下、以水作为溶剂进行，所用酶廉价易得且不需要辅因子^[32]。苯并呋喃骨架是苯并呋喃木脂素主要的母核，其本身也存在多种生理活性，如抗真菌、抗肿瘤、作为环氧化酶抑制剂、钠钾质子泵抑制剂等^[33]。Kevin等^[33]以邻苯二酚和1, 3-二羰基化合物为底物，经漆酶催化合成了14个5, 6-二羟基苯并呋喃化合物(图式 5)，其中化合物1~6(图式 3(a))对UACC62癌细胞具有较强的抑制作用(GI₅₀=0.77~9.76μmol/L)，化合物3和6的活性超过了抗癌药物依托泊苷的活性(GI₅₀₌0.89μmol/L)，而且化合物3和6还对MCF7癌细胞具有较强的抑制作用(GI₅₀₌8.79μmol/L、GI₅₀₌9.30μmol/L)；同时化合物6对TK10癌细胞也存在较强的抑制作用(GI₅₀=9.73μmol/L)。邻苯醌在抗菌、抗癌及抗疟疾等方面具均表现出较强的活性，5, 6-二羟基苯并呋喃化合物带有一个邻苯二酚取代基，研究者推测在细胞内该邻苯二酚结构被氧化成邻苯醌结构而发挥活性作用^[33]。漆酶还可催化合成苯并二氢呋喃酰胺类新木脂素^[34](图式 6)，其中消旋体化合物(±)-7与(±)-8(图式 3(b))对Caco-2、MCF-7及PC-3癌细胞均表现出较强的抗增殖活性，经分离纯化，4个对映体的活性更强(GI₅₀=1.1~5.3μmol/L)。

  图式 5

  

  图式 5.  漆酶催化合成5, 6-二羟基苯并呋喃化合物

  Scheme 5.  Laccase-catalyzed synthesis of 5, 6-dihydroxylated benzo[b]furans

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  图式 6

  

  图式 6.  漆酶催化合成苯并二氢呋喃酰胺类新木脂素

  Scheme 6.  Laccase-catalyzed synthesis of dihydrobenzofuran neolignanamides

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  2.2   抗生素

  Agematu等^[35]首次报道了用漆酶对抗生素进行修饰。他们将青霉素X乙酰化，然后通过漆酶催化形成稳定的二聚体，该工作为抗生素的发展开辟了新的方向。随后，Mikolasch及其合作者进行了大量的实验来研究漆酶在抗生素中的应用。在近十年的研究中，Mikolasch等采用将已有的抗生素与其他活性化合物偶联的方法来生成新的抗菌化合物。在β-内酰胺类抗生素上增加一个邻苯二酚结构可以提高抗生素对细菌细胞壁的渗透能力，并以此来提高抗菌性能^[36]；通过漆酶催化的氨基化反应，将邻苯二酚与氨基β-内酰胺类抗生素(头孢羟氨苄、羟氨苄青霉素、氨苄青霉素)交叉偶联可生成新的抗生素结构^[37]。他们还报道过用漆酶合成具有生物活性的环孢菌素类似物^[38]和吗啉衍生物的方法^[39]。

  但是上述化合物在稳定性与活性上差异很大。基于前期的研究成果，Mikolasch等^[40]认为将具有高抗菌活性及低毒性的芳香化合物与抗生素偶联有很高的概率可以获得活性更高的新化合物。他们从38个1, 2-和1, 4-苯二酚类化合物中筛选出了具有高抗菌活性和低细胞毒性的甲基-1, 4-苯二酚和2, 3-二甲基-1, 4苯二酚。将这两个化合物通过氨基化反应与氨基-β-内酰胺抗生素偶联生成了14个新的头孢菌素、青霉素(图式 3(c))和头孢烯类化合物^[40]。这些新化合物在水溶液中非常稳定并且均对β-内酰胺酶存在抗性，同时这些化合物对包括耐多药的葡萄球菌和肠球菌在内的20种革兰氏阳性菌均表现出更强的抑制作用^[40]。图式 7以2, 3-二甲基对苯二酚为例对该合成方法进行了说明。

  图式 7

  

  图式 7.  漆酶催化2, 3-二甲基对苯二酚与头孢菌素偶联^[55]

  Scheme 7.  Laccase-catalyzed coupling reaction of 2, 3-dimethylhydroquinone with cephalosporin

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  2.3   嘧啶并苯并噻唑

  嘧啶并苯并噻唑衍生物通常具有抗过敏、抗真菌及抗细菌的活性，还有些嘧啶并苯并噻唑衍生物对苯二氮NFD61受体具有较高的亲和力^[41]。然而，目前合成嘧啶并苯并噻唑衍生物的方法还非常有限。将儿茶酚与6-取代的1, 2, 3, 4-四氢-4-氧代-2-硫代-5-嘧啶腈通过漆酶催化的多米诺反应可生成新的嘧啶并苯并噻唑衍生物^[41]。儿茶酚与2, 3-二氢-2-硫代嘧啶-4(1H)-酮通过漆酶催化的多米诺反应生成的嘧啶并苯并噻唑衍生物15、16(图式 3(d))对HepG2癌细胞有抑制作用^[42]。上述两种合成方法绿色温和且收率高。

  2.4   氨基萘醌

  氨基萘醌通常具有抗癌活性。漆酶可被用于合成氨基萘醌^[43]，反应中用芳香伯胺对1, 4-二羟基-2-萘甲酸进行氨基化，漆酶用来促进C-N键的形成。他们合成了8种对UACC62癌细胞具有较强抑制作用(GI₅₀=3.98~7.54μmol/L)的氨基萘醌，其中化合物17、18、19(图式 3(e))对UACC62癌细胞的总抑制率(TGI=7.17~7.94μmol/L)是抗癌药依托泊苷(TGI=52.71μmol/L)的7~8倍。

  2.5   邻苯二酚硫醚

  邻苯二酚硫醚是以儿茶酚为反应底物生成的一类化合物，通常具有抗菌及抗氧化等活性^[44]。漆酶氧化邻苯二酚产生邻苯醌，邻苯醌可以通过亲核加成反应与硫醚产生邻苯二酚硫醚^[45]。将2-巯基苯并噁唑和2-巯基苯并噻唑作为硫醇，在室温、常压和pH=6.0的条件下硫醚的产率可以达到74%~96%^[45]。2, 3-二氢-2-硫代嘧啶-4(1H)-酮与4位取代的邻苯二酚经漆酶催化也可生成邻苯二酚硫醚^[42]，其中化合物20、21(图式 3(f))对HepG2癌细胞系具有较强的抑制作用(GI₅₀=7.77、2.74μmol/L)。

  2.6   磺酰基苯二醇

  用漆酶催化儿茶酚与几种具有不同取代基的苯亚磺酸钠进行氧化偶联反应，在室温及磷酸缓冲溶液条件下，以75%~95%的产率得到了磺酰基苯二醇^[46]。磺酰基苯二醇是多种药物的分子骨架，如抗菌药氨苯砜^[47]、COX-2抑制剂罗非昔布^[48]等，最近的研究发现磺酰基苯二醇还有抑制HIV-1逆转录酶的作用^[49]。

  2.7   香豆雌酚

  漆酶氧化儿茶酚还可合成香豆雌酚。Tozama等^[50]合成的19种香豆雌酚化合物对TK10、UACC62和MCF7癌细胞均具有不同的抑制作用，其中化合物22(图式 3(g))对UACC62和MCF7癌细胞均具有较强的抑制作用(GI₅₀=5.35、7.96μmol/L)。

  2.8   吩嗪及其衍生物

  吩嗪化合物具有抗氧化、抗菌、抗癌等作用^[51]，吩噁嗪酮母核是许多具有生物活性化合物的重要骨架^[52]。Sousa等^[51]使用漆酶催化邻位取代的芳香二胺和邻位取代的芳香羟胺经一步反应合成了新的不对称吩嗪与吩噁嗪酮化合物(图式 8)，该方法与化学氧化法相比条件更温和、反应时间短、产率更高。

  图式 8

  

  图式 8.  漆酶催化合成吩嗪及吩噁嗪酮^[56]

  Scheme 8.  Laccase-catalyzed synthesis of phenazines and phenoxazinones^[56]

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  2.9   双吲哚生物碱

  低产率及昂贵的成本一直限制着双吲哚生物碱的商业化应用。绒毛栓菌漆酶可以将长春碱与文朵灵偶联生成一种双吲哚生物碱——脱水长春碱^[53](图式 3(h))，其是抗肿瘤、抗癌药物中一种重要的活性成分^[54]。漆酶的应用可以为双吲哚生物碱的半合成提供一个经济可行的潜在性选择。

  2.10   其他类化合物

  漆酶还可催化对苯二酚与苯甲酰乙腈的α-芳基化反应生成苄基腈^[55]，苄基腈是多种药物结构中不可缺少的一部分，如阿那曲唑(乳腺癌药物)、维拉帕米和戈洛帕米(抗心律失常药物)、西洛司特(抗炎药)、左卡巴斯汀(过敏性结膜炎药物)等^[56]。

  烯胺酮是合成许多药物的重要中间体，如抗惊厥药物^[57]。Zhang等^[58]首次开发出了漆酶催化合成烯胺酮的新方法，该方法以1, 3二羰基化合物和胺类化合物为原料，在室温条件下、以水为唯一的溶剂进行反应，收率可达83%~95%。

  3.   结语

  漆酶催化具有绿色温和的催化条件、高效的转化能力、广泛的底物谱和可催化某些特殊反应等特点。但是目前也存在许多问题阻碍着漆酶的工业化应用，如缺少充足的漆酶供应源、某些酶促反应所需的反应介质不适合工业化应用等^[59~61]。因此，今后的研究应主要关注以下几点：(1)通过异源表达或蛋白质工程获得大量高稳定性、高活性的漆酶，并且结合固定化技术来延长漆酶的使用时间，以此推动漆酶的大规模生产和工业化应用；(2)开发更加高效经济的反应介质系统的同时不断寻找新的漆酶底物，降低漆酶的应用成本。

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  图式 1  漆酶的氧化还原位点^[20]

  Scheme 1  Redox sites of laccase^[20]

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  图式 2  漆酶将O₂还原为水的作用机制^[25]

  Scheme 2  The mechanism of reduction of O₂ to water by laccase catalysis^[25]

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  图式 3  漆酶催化合成的活性化合物

  Scheme 3  Bioactive compounds synthesized by laccase catalyzed reactions

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  图式 4  漆酶的催化合成机理^[26]

  Scheme 4  The catalytic synthesis mechanism of laccase^[26]

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  图式 5  漆酶催化合成5, 6-二羟基苯并呋喃化合物

  Scheme 5  Laccase-catalyzed synthesis of 5, 6-dihydroxylated benzo[b]furans

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  图式 6  漆酶催化合成苯并二氢呋喃酰胺类新木脂素

  Scheme 6  Laccase-catalyzed synthesis of dihydrobenzofuran neolignanamides

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  图式 7  漆酶催化2, 3-二甲基对苯二酚与头孢菌素偶联^[55]

  Scheme 7  Laccase-catalyzed coupling reaction of 2, 3-dimethylhydroquinone with cephalosporin

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  图式 8  漆酶催化合成吩嗪及吩噁嗪酮^[56]

  Scheme 8  Laccase-catalyzed synthesis of phenazines and phenoxazinones^[56]

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