基于菁染料响应G-四链体结构变化的半胱氨酸检测探针

田佳琦 陈月荣 刘铭 张艳华 孙旭东 付尧 张秀凤 石磊

引用本文: 田佳琦, 陈月荣, 刘铭, 张艳华, 孙旭东, 付尧, 张秀凤, 石磊. 基于菁染料响应G-四链体结构变化的半胱氨酸检测探针[J]. 化学通报, 2020, 83(11): 1025-1030. shu
Citation:  Tian Jiaqi, Chen Yuerong, Liu Ming, Zhang Yanhua, Sun Xudong, Fu Yao, Zhang Xiufeng, Shi Lei. A Cysteine Detection Probe Based on Regulating Cyanine Dye Transformation by G-quardruplex[J]. Chemistry, 2020, 83(11): 1025-1030. shu

基于菁染料响应G-四链体结构变化的半胱氨酸检测探针

    通讯作者: 石磊  E-mail:slbuct@sina.com
  • 基金项目:

    华北理工大学大学生创新创业训练计划项目(X2018166)和国家自然科学基金项目(21807034)资助

摘要: 半胱氨酸是生物体中起着重要作用的还原性氨基酸,其在体内的含量变化可能会诱发机体发生多种病变,因此高选择性、高灵敏度和低成本的半胱氨酸检测技术具有重要意义。本文利用富含鸟嘌呤的DNA链序列在钾、钠等金属离子诱导下形成对汞离子产生特殊响应的二级结构以及菁染料能够对DNA结构进行识别,并由此引起其超分子聚集形式的改变,致使其紫外和可见光谱性质随之变化,通过以Hg2+调控G-四链体与菁染料(ETC)组建传感器,实现对溶液体系中半胱氨酸高选择性检测。

English

  • 半胱氨酸(Cys)等生物硫醇在人的生理活动中起着重要作用。Cys不仅是谷胱甘肽、乙酰辅酶与牛磺酸的前体,同时也是生物体硫铁络合物中硫配体的提供者;人体内的Cys异常会引起生长缓慢、毛发色素褪色、水肿、嗜睡、肝功能损伤以及肥胖、皮肤松弛、身体虚弱等症状[1, 2]。人体内同型Cys浓度过高可能引起心血管病和阿尔茨海默症,并且它在血浆中的总浓度还与某些先天性疾病和老年认知障碍有关[3, 4]。鉴于生物硫醇在生理活动中的重要意义,科学家们对生物和环境样品中小分子硫醇的检测高度关注。

    许多疾病的特征在于各种生物分子表现出的异常活性,这些物质通常在细胞内外显示过表达现象,因此对其灵敏靶向识别可以提供诊断和治疗效用。核酸探针可以在稳定进入细胞的同时,特异性地结合目标物质,通过光学方法检测或通过成像技术标识出来。目前,比较常用的检测方法主要有圆二色谱法[5]、毛细管电泳法、荧光光谱法[6]、高效液相色谱法、质谱法[7]以及表面拉曼增强法[8]等。尽管这些方法在检测Cys方面已比较成熟,但它们对样品的纯度要求高,样品制备过程复杂。相比之下,菁染料核酸探针具有环境友好、检测限低、操作简单等优点。

    核酸探针,是指带有标记物的已知序列的核酸片段,可以和与其互补的核酸序列杂交,形成双链用于待测样品中特定基因序列的检测,或者具有特异性相互作用的分子存在时会导致其构型、构象改变,从而引起信号变化用于化学、生物、医学和药学等领域的靶向分子识别[9, 10]。核酸探针通常是基于由富含G碱基的DNA链通过碱基间形成的Hoogsteen氢键的连接形成的DNA G-四链体[11, 12]。稳定的DNA G-四链体能够诱导菁染料在溶液中的存在形式,而当DNA G-四链体结构被破坏时染料聚集形式发生变化,同时这种响应可以反复循环。利用上述传感机制进行小分子生物硫醇的检测已有文献报道。

    小分子与DNA的相互作用主要涉及DNA的二级结构[13~15],菁染料以非共价方式与DNA双链结合的方式主要有嵌入结合、小沟槽结合和外部静电结合三种。本文使用的菁染料3, 3′, -二(3-磺丙基)-4, 5, 4′, 5′, -二苯并-9-乙基-噻碳菁染料三乙胺盐(ETC,C39H47O6N3S4)的结构如图式 1所示[16]。此类菁染料能响应外界环境因素的变化,可在溶液环境中形成不同形式的聚集体,并因温度、酸度、无机盐浓度[17, 18]和溶剂性质等条件的改变而诱导不同聚集形态之间发生相互转化。单体染料向J-聚集体转化时[19]其吸收光谱红移,而转化为H-聚集形式时[20]发生蓝移,同时菁染料ETC具有合成与纯化方法成熟、生物低毒等优点[21~23]

    图式 1

    图式 1.  ETC(菁染料)的结构
    Scheme 1.  Structure of ETC(cyanine dye)

    据此,本文设计一种易合成、光谱从可见光到近红外可调、检测特异性高的含磺酸基菁染料作为Cys的新型紫外吸收核酸探针,利用Cys与Hg2+和DNA中T碱基与Hg2+的特异性结合,达到识别的目的,得到一种合成简单、特异性好、检测限低的Cys探针。

    UV-9000S紫外-可见吸收光谱仪(上海元析有限公司);F-7000荧光分光光度计(株式会社日立集团);Laborata 4000Heidolph旋涡振荡器(德国海道夫);H 1650-W高速台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);Delta 320 pH计(梅特勒-托利多公司);MilliPore超纯水制备仪(法国MilliPore公司)。

    ETC,分析纯,由中国科学院化学研究所提供;半胱氨酸(Cys)购自北京索莱宝科技有限公司;HgCl2标准溶液(1000μg/mL)购自阿拉丁试剂公司;其他所用试剂均为市售分析纯级。DNA序列,AGRO 100:GGTGGTGGTGGTTGTGGTGG TGGTGG。

    Hepes缓冲液:精确称量Hepes固体0.4774g配制20mmol/L的Hepes缓冲溶液母液,加入50mL超纯水后利用旋涡振荡器混匀溶解。Cys储液(Cys固体粉末储存-20℃,现用现配):精确称量Cys固体粉末加入缓冲溶液配置为200μmol/L的储液,振荡混匀备用。菁染料:精确称量菁染料固体溶于甲醇配置为200μmol/L菁染料母液,用锡纸密封避光储存。KCl母液:精确称量KCl固体,溶于Hepes缓冲溶液中,配成100mmol/L的KCl母液。HgCl2母液:量取HgCl2溶液(1000μg/mL)5μL,加Hepes缓冲溶液配成50μmol/L HgCl2母液。

    先将DNA离心,向其中加入480μL Hepes缓冲溶液(DNA每管50nmol/L),用热循环仪升温至90℃,保持10min,再缓慢降至室温(退火),漩涡振荡混匀(1min),离心(将黏在离心盖上的溶液离心下来),取13μL用Hepes缓冲溶液稀释30倍(缓冲溶液377μL),漩涡振荡混匀,测量其在260nm处的吸光度,根据式(1)计算母液中DNA的浓度。将其配制成100μmol/L的母液备用。

    $ {c_{{\rm{DNA}}}} = \left( {33 \times {A_{260}} \times 30 \times 1000} \right)/{M_W} $

    (1)

    式中,cDNA为DNA浓度(mol/L);33为DNA质量浓度(mg/mL);30为稀释倍数;1000为浓度换算;MW为DNA序列的相对分子质量。

    紫外可见吸收光谱试验中采用的激发光源为氘灯,激发波长为295nm,发射波长为300~700 nm,扫描速度为12000nm·min-1,激发与发射的狭缝宽度均为2.5nm,采集数据前先用Hepes缓冲溶液对仪器进行校正。

    Cys识别机制如图 1所示。DNA单链在K+存在的缓冲溶液中形成DNA G-四链体结构,DNA G-四链体和菁染料(ETC)分子相互识别后菁染料分子以紫色单体形式存在。当向体系中加入HgCl2后,HgCl2与DNA G-四链体序列中胸腺嘧啶形成T-Hg2+-T发夹型结构,使G-四链体解链,菁染料分子向蓝色J-聚集体形式转化。由于Cys与Hg2+有更高的亲和力,因此向体系中加入经预处理的Cys试样,Hg2+与Cys相互作用形成更为稳定的Hg(Ⅱ)-S结构,从而诱导富含鸟嘌呤的DNA单链释放重新折叠成稳定的DNA G-四链体结构。与此同时,菁染料分子从蓝色J聚集体形式转变为紫色单体形式。基于此策略,可通过DNA和Hg2+调控菁染料的聚集形式实现定性检测溶液样品中的Cys含量。

    图 1

    图 1.  人体血清半胱氨酸识别机制图
    Figure 1.  Human serum cysteine recognition mechanism diagram

    实验溶液配制如表 1所示。在紫外吸收光谱(图 2)中,1号样品中出现J-聚集体的特征吸收峰;2号样品加入DNA G-四链体后菁染料紫外吸收曲线发生蓝移;3号样品中加入Hg2+后菁染料紫外吸收曲线发生红移;4号样品相比3号样品为延长静置时间,试验结果为菁染料紫外吸收光谱红移效果明显。5号样品加入Cys后紫外吸收曲线发生蓝移。6号样品相比5号样品静置40min,紫外可见光谱蓝移明显,说明检测体系在40min后基本作用完全。通过上述实验,检测体系的可行性得到验证,说明利用该方法检测Cys的含量是可行的。

    表 1

    表 1  半胱氨酸检测体系溶液配制表a
    Table 1.  Solution preparation table of cysteine detection system
    下载: 导出CSV
    序号 Hepes缓冲溶液/μL DNA母液/μL HgCl2母液/μL Cys母液/μL
    1 360 0 0 0
    2 344 16 0 0
    3 244 16 100 0
    4 244 16 100 0
    5 235 16 100 9
    6 235 16 100 9
        a1~6中KCl母液加入量均为32μL,ETC母液加入量均为10μL

    图 2

    图 2.  紫外吸收光谱检测的可行性试验
    Figure 2.  Feasibility test of UV absorption spectroscopy detection

    菁染料能响应外界环境因素的变化,可在溶液环境中形成不同形式的聚集体,并因温度、pH[24]、极性[25]改变做出相应转换。因此需通过实验确定稳定菁染料的K+的浓度。K+浓度与吸光度的关系如图 3所示。由图 3(a)为菁染料紫外吸收光谱图可知,随K+浓度的增大,菁染料的吸光度呈上升趋势。图 3(b)为菁染料吸光度与K+浓度的拟合曲线图。K+浓度为8mmol/L时,菁染料的吸光度趋于平衡。说明此时ETC已经完全形成J-聚集体,因此确定适宜的K+浓度为8mmol/L。

    图 3

    图 3.  菁染料ETC的最佳K+浓度

    (a)不同浓度K+溶液中菁染料的紫外吸收光谱;(b)不同浓度K+溶液中651nm的吸收度变化

    Figure 3.  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different K+ solutions

    对G-四链体来说,配体的种类和数量是影响其结构稳定性的重要因素。本文通过实验确定了DNA与菁染料适宜结合比。固定ETC浓度为4μmol/L,测定加入不同浓度的DNA时的紫外光谱(见图 4(a)),随着DNA浓度的增大菁染料的紫外吸收波长由651nm蓝移至583nm处。图 4(b)为单体吸光度与DNA浓度拟合曲线图,当DNA浓度为4μmol/L时(即ETC/DNA摩尔比为1:1),ETC的单体吸光度趋于稳定。J聚集体吸光度与DNA浓度拟合曲线图见图 4(c),当DNA浓度为2μmol/L时,菁染料的J-聚集体吸光度趋于稳定。因此,利用紫外吸收光谱确定ETC与DNA的适宜结合比为1:1。

    图 4

    图 4.  菁染料ETC在不同DNA溶液中的紫外吸收光谱

    (a)不同浓度DNA溶液中菁染料的紫外吸收光谱; (b)不同浓度DNA溶液中583nm的吸收变化;(c)不同浓度DNA溶液中651nm的吸收变化

    Figure 4.  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different DNA solutions

    文献中大多数对Hg2+的检测都是基于Hg2+与T碱基的特异性结合来实现的[26],Hg2+可引起含T碱基的G-四链体结构发生改变,从而实现对Hg2+的检测。实验中固定菁染料和DNA的浓度为4μmol/L,Hg2+浓度为0~25μmol/L时体系的紫外吸收光谱见图 5(a)。随着Hg2+的加入,体系的吸收波长逐渐由580nm红移至646nm处。单体的吸光度在Hg2+浓度为10μmol/L时趋于平缓,J聚集体吸光度在Hg2+浓度为15μmol/L时基本达到最大。由此可知,HgCl2为15μmol/L时,诱导DNA G-四链体解链,ETC形成的J聚集体呈上升趋势,并最终确定HgCl2的适宜浓度为15μmol/L。

    图 5

    图 5.  菁染料ETC在不同HgCl2溶液中的紫外吸收光谱

    (a)不同浓度HgCl2中菁染料的紫外吸收光谱;(b)不同浓度DNA溶液中646nm的吸收度变化

    Figure 5.  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different HgCl2 solutions

    因为Hg2+与Cys的亲和力远高于Hg2+和碱基T的相互作用,因此Hg2+传感器可以进一步作为Cys的检测平台。在含有Hg2+的检测体系中加入Cys将作用在发卡结构DNA中的Hg2+分离出来,解除发卡结构,DNA-G四链体恢复原状,菁染料恢复单体形式,通过测试紫外吸收光谱的变化就可以用来检测Cys。溶液配制见表 2

    表 2

    表 2  半胱氨酸识别与检测a
    Table 2.  Cysteine recognition and detection
    下载: 导出CSV
    序号 Hepes缓冲溶液/μL Cys母液/μL
    1 280.0 0
    2 277.5 2.5
    3 275.0 5.0
    4 270.0 10.0
    5 265.0 15.0
    6 260.0 20.0
    7 255.0 25.0
    8 250.0 30.0
    9 247.5 37.5
    10 240.0 45.0
    11 235.0 50.0
        aDNA母液、KCl母液、ETC母液、HgCl2母液的加入量分别为20.0、40.0、10.0和150.0 μL

    随着Cys浓度的增大,最大吸收波长由640nm蓝移至582nm(图 6(a)),且ETC单体的吸光度呈上升趋势,并在Cys浓度为12μmol/L时趋于稳定;J聚集体的吸光度随Cys浓度升高而降低,并在Cys浓度12μmol/L时趋于稳定(图 6(b))。取582nm处的紫外吸收值进行线性拟合得图 6(c),根据3σ/slope计算其检测限,在本实验中,背景样品的标准偏差σ=0.006124,通过拟合后的直线斜率(582nm)为0.00625,线性关系良好;探针的检测限达到0.9798μmol/L,表现出很高的灵敏度。

    图 6

    图 6.  菁染料ETC在不同Cys溶液中的紫外吸收光谱

    (a)不同Cys下菁染料的紫外吸收光谱;(b)不同浓度DNA溶液中A582nmA640nm的吸收度变化;(c) A582nm的吸收度与Cys浓度的线性关系

    Figure 6.  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different Cys solutions

    在相同的溶液体系下,Cys存在时菁染料在656nm处的吸光度接近于0,几乎没有J-聚集体,即Cys能够通过与Hg2+特异性结合而改变DNA状态,进而影响菁染料ETC的聚集形式。其他氨基酸(包括谷氨酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、酪氨酸、组氨酸以及天冬氨酸,浓度12μmol/L)在656nm处的吸光度大约在0.25,与Cys相比差异明显,说明其他氨基酸既难与Hg2+结合,同时对菁染料形态也没有影响。因此,本方法对Cys具有很好的特异性,其他氨基酸基本不产生干扰。

    图 7

    图 7.  菁染料ETC在不同氨基酸溶液中的紫外吸收光谱
    Figure 7.  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different amino acid solutions

    本实验利用简单的紫外吸收光谱对DNA和Hg2+调控菁染料的聚集形式来识别检测Cys。通过K+诱导富含G碱基的DNA单链形成G-四链体,G-四链体使菁染料以单体形式存在,随后Hg2+与DNA G-四链体中的胸腺嘧啶T结合成T-Hg2+-T发夹型复合结构,G-四链体解链,菁染料形成J-聚集体,从而得到检测Cys的溶液体系。该溶液体系能对Cys与Hg2+的特异性结合产生响应,由于Hg2+-S沉淀的形成,使DNA重新组合成为G-四链体,菁染料又重新变成单体。经实验证明,该溶液体系配制简单,检测耗费时间短,DNA无需标记,对Cys的检测限低至0.9798μmol/L,同时具有较高的选择性。本研究可为Cys快速检测方法的开发提供新的思路。


    1. [1]

      Elshorbagy A K, Kozich V, Smith A D, et al. Curr. Opin. Clin. Nutr. MeTab. Care., 2012, 15: 49~57.

    2. [2]

      Shahrokhian S. Anal. Chem., 2001, 73: 5972~5978.

    3. [3]

      Bricks J L, Kovalchuk A, Triefinger C, et al. J. Am. Chem. Soc., 2005, 127: 13522~13529.

    4. [4]

      Zhang X H, Lai W Y, Wong T C, et al. Synth. Met., 2000, 114: 115~117.

    5. [5]

      Zhou Y, Li Y. Biophys. Chem., 2004, 107(3): 273~281.

    6. [6]

      Gago F. Methods, 1998, 14(3): 277~292.

    7. [7]

      Liu Y Q, Liu H H, Li Y H, et al. Chin. Chem. Lett., 2009, 20(3): 330~333.

    8. [8]

      王树玲, 于俊生.高等学校化学学报, 2002, (9): 1676~1679.

    9. [9]

      Li H, Yao Q, Fan J, et al. Eng. Chem. Res., 2016, 55(6): 1477~1483.

    10. [10]

      Sun Y, Li Y, Ma X, et al. RES Adv., 2016, 6(83): 79830~79835.

    11. [11]

      Howard F B, Frazier J, Miles H T. Biopolymers, 1997, 16(4): 791~809.

    12. [12]

      Burge S, Parkinson G N, Hazel P, et al. Nucl. Acids Res., 2006, 34(19): 5402~5415.

    13. [13]

      Armitage B A. Top. Curr. Chem., 2005, 253: 55~76.

    14. [14]

      Ihmels H. Otto D. Top. Curr. Chem., 2005, 258: 161~204.

    15. [15]

      Ihmels H. Faulhaber K. Vedaldi D, et al. Photochem. Photobio., 2005, 81(5): 107~115.

    16. [16]

      杨小东.三苯胺和菁染料类荧光探针的合成及性能.华南理工大学博士学位论文, 2016.

    17. [17]

      Mikkelsen R B, Wallaach D F. Cell Biol. Int. Rep., 1977, 1(1): 51~55.

    18. [18]

      Wu T, Zou G, Hu J, et al. Chem. Mater., 2009, 21(16): 3788~3798.

    19. [19]

      Steiger R, Pugin R, Heier J. Colloids Surf. B, 2009, 74(2): 484~491.

    20. [20]

      Zaheer A, Lenkinski R E, Mahmood A, et al. Nat. Biotechnol., 2001, 19 (12): 1148~1154.

    21. [21]

      Patsenker L D, Tatarets A L, Klochko O P, et al. J. Am. Chem. Soc., 2010, 9: 159~190.

    22. [22]

      Mishra A, Behera R K, Behera P K, et al. Chem. Rev., 2000, 100(6): 1973~2011.

    23. [23]

      Deligeorgiev T, Vasilev A, Kaloyanova S, et al. Color. Technol., 2010, 126(2): 55~80.

    24. [24]

      Kudo K, Momotake A, Kanna Y, et al. Chem. Commun., 2011, 47(13): 3867.

    25. [25]

      Lee J S, Han M S, Mirkin C A. Angew. Chem. Int. Ed., 2007, 46(22): 4093~4096.

    26. [26]

      Liu J, Cao Z, Lu Y. Chem. Rev., 2009, 109(5): 1948~1998.

  • 图式 1  ETC(菁染料)的结构

    Scheme 1  Structure of ETC(cyanine dye)

    图 1  人体血清半胱氨酸识别机制图

    Figure 1  Human serum cysteine recognition mechanism diagram

    图 2  紫外吸收光谱检测的可行性试验

    Figure 2  Feasibility test of UV absorption spectroscopy detection

    图 3  菁染料ETC的最佳K+浓度

    Figure 3  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different K+ solutions

    (a)不同浓度K+溶液中菁染料的紫外吸收光谱;(b)不同浓度K+溶液中651nm的吸收度变化

    图 4  菁染料ETC在不同DNA溶液中的紫外吸收光谱

    Figure 4  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different DNA solutions

    (a)不同浓度DNA溶液中菁染料的紫外吸收光谱; (b)不同浓度DNA溶液中583nm的吸收变化;(c)不同浓度DNA溶液中651nm的吸收变化

    图 5  菁染料ETC在不同HgCl2溶液中的紫外吸收光谱

    Figure 5  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different HgCl2 solutions

    (a)不同浓度HgCl2中菁染料的紫外吸收光谱;(b)不同浓度DNA溶液中646nm的吸收度变化

    图 6  菁染料ETC在不同Cys溶液中的紫外吸收光谱

    Figure 6  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different Cys solutions

    (a)不同Cys下菁染料的紫外吸收光谱;(b)不同浓度DNA溶液中A582nmA640nm的吸收度变化;(c) A582nm的吸收度与Cys浓度的线性关系

    图 7  菁染料ETC在不同氨基酸溶液中的紫外吸收光谱

    Figure 7  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different amino acid solutions

    表 1  半胱氨酸检测体系溶液配制表a

    Table 1.  Solution preparation table of cysteine detection system

    序号 Hepes缓冲溶液/μL DNA母液/μL HgCl2母液/μL Cys母液/μL
    1 360 0 0 0
    2 344 16 0 0
    3 244 16 100 0
    4 244 16 100 0
    5 235 16 100 9
    6 235 16 100 9
        a1~6中KCl母液加入量均为32μL,ETC母液加入量均为10μL
    下载: 导出CSV

    表 2  半胱氨酸识别与检测a

    Table 2.  Cysteine recognition and detection

    序号 Hepes缓冲溶液/μL Cys母液/μL
    1 280.0 0
    2 277.5 2.5
    3 275.0 5.0
    4 270.0 10.0
    5 265.0 15.0
    6 260.0 20.0
    7 255.0 25.0
    8 250.0 30.0
    9 247.5 37.5
    10 240.0 45.0
    11 235.0 50.0
        aDNA母液、KCl母液、ETC母液、HgCl2母液的加入量分别为20.0、40.0、10.0和150.0 μL
    下载: 导出CSV
  • 加载中
计量
  • PDF下载量:  0
  • 文章访问数:  94
  • HTML全文浏览量:  16
文章相关
  • 发布日期:  2020-11-01
  • 收稿日期:  2020-04-11
  • 接受日期:  2020-07-17
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

  1. 本站搜索
  2. 百度学术搜索
  3. 万方数据库搜索
  4. CNKI搜索

/

返回文章