

Citation: Tian Jiaqi, Chen Yuerong, Liu Ming, Zhang Yanhua, Sun Xudong, Fu Yao, Zhang Xiufeng, Shi Lei. A Cysteine Detection Probe Based on Regulating Cyanine Dye Transformation by G-quardruplex[J]. Chemistry, 2020, 83(11): 1025-1030.

基于菁染料响应G-四链体结构变化的半胱氨酸检测探针
English
A Cysteine Detection Probe Based on Regulating Cyanine Dye Transformation by G-quardruplex
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Key words:
- DNA G-quadruplex
- / Cyanine dyes
- / Thiol protein
- / Cysteine
- / UV spectrum
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半胱氨酸(Cys)等生物硫醇在人的生理活动中起着重要作用。Cys不仅是谷胱甘肽、乙酰辅酶与牛磺酸的前体,同时也是生物体硫铁络合物中硫配体的提供者;人体内的Cys异常会引起生长缓慢、毛发色素褪色、水肿、嗜睡、肝功能损伤以及肥胖、皮肤松弛、身体虚弱等症状[1, 2]。人体内同型Cys浓度过高可能引起心血管病和阿尔茨海默症,并且它在血浆中的总浓度还与某些先天性疾病和老年认知障碍有关[3, 4]。鉴于生物硫醇在生理活动中的重要意义,科学家们对生物和环境样品中小分子硫醇的检测高度关注。
许多疾病的特征在于各种生物分子表现出的异常活性,这些物质通常在细胞内外显示过表达现象,因此对其灵敏靶向识别可以提供诊断和治疗效用。核酸探针可以在稳定进入细胞的同时,特异性地结合目标物质,通过光学方法检测或通过成像技术标识出来。目前,比较常用的检测方法主要有圆二色谱法[5]、毛细管电泳法、荧光光谱法[6]、高效液相色谱法、质谱法[7]以及表面拉曼增强法[8]等。尽管这些方法在检测Cys方面已比较成熟,但它们对样品的纯度要求高,样品制备过程复杂。相比之下,菁染料核酸探针具有环境友好、检测限低、操作简单等优点。
核酸探针,是指带有标记物的已知序列的核酸片段,可以和与其互补的核酸序列杂交,形成双链用于待测样品中特定基因序列的检测,或者具有特异性相互作用的分子存在时会导致其构型、构象改变,从而引起信号变化用于化学、生物、医学和药学等领域的靶向分子识别[9, 10]。核酸探针通常是基于由富含G碱基的DNA链通过碱基间形成的Hoogsteen氢键的连接形成的DNA G-四链体[11, 12]。稳定的DNA G-四链体能够诱导菁染料在溶液中的存在形式,而当DNA G-四链体结构被破坏时染料聚集形式发生变化,同时这种响应可以反复循环。利用上述传感机制进行小分子生物硫醇的检测已有文献报道。
小分子与DNA的相互作用主要涉及DNA的二级结构[13~15],菁染料以非共价方式与DNA双链结合的方式主要有嵌入结合、小沟槽结合和外部静电结合三种。本文使用的菁染料3, 3′, -二(3-磺丙基)-4, 5, 4′, 5′, -二苯并-9-乙基-噻碳菁染料三乙胺盐(ETC,C39H47O6N3S4)的结构如图式 1所示[16]。此类菁染料能响应外界环境因素的变化,可在溶液环境中形成不同形式的聚集体,并因温度、酸度、无机盐浓度[17, 18]和溶剂性质等条件的改变而诱导不同聚集形态之间发生相互转化。单体染料向J-聚集体转化时[19]其吸收光谱红移,而转化为H-聚集形式时[20]发生蓝移,同时菁染料ETC具有合成与纯化方法成熟、生物低毒等优点[21~23]。
图式 1
据此,本文设计一种易合成、光谱从可见光到近红外可调、检测特异性高的含磺酸基菁染料作为Cys的新型紫外吸收核酸探针,利用Cys与Hg2+和DNA中T碱基与Hg2+的特异性结合,达到识别的目的,得到一种合成简单、特异性好、检测限低的Cys探针。
1. 实验部分
1.1 实验仪器与试剂
UV-9000S紫外-可见吸收光谱仪(上海元析有限公司);F-7000荧光分光光度计(株式会社日立集团);Laborata 4000Heidolph旋涡振荡器(德国海道夫);H 1650-W高速台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);Delta 320 pH计(梅特勒-托利多公司);MilliPore超纯水制备仪(法国MilliPore公司)。
ETC,分析纯,由中国科学院化学研究所提供;半胱氨酸(Cys)购自北京索莱宝科技有限公司;HgCl2标准溶液(1000μg/mL)购自阿拉丁试剂公司;其他所用试剂均为市售分析纯级。DNA序列,AGRO 100:GGTGGTGGTGGTTGTGGTGG TGGTGG。
1.2 溶液制备
Hepes缓冲液:精确称量Hepes固体0.4774g配制20mmol/L的Hepes缓冲溶液母液,加入50mL超纯水后利用旋涡振荡器混匀溶解。Cys储液(Cys固体粉末储存-20℃,现用现配):精确称量Cys固体粉末加入缓冲溶液配置为200μmol/L的储液,振荡混匀备用。菁染料:精确称量菁染料固体溶于甲醇配置为200μmol/L菁染料母液,用锡纸密封避光储存。KCl母液:精确称量KCl固体,溶于Hepes缓冲溶液中,配成100mmol/L的KCl母液。HgCl2母液:量取HgCl2溶液(1000μg/mL)5μL,加Hepes缓冲溶液配成50μmol/L HgCl2母液。
1.3 DNA溶解及浓度标定
先将DNA离心,向其中加入480μL Hepes缓冲溶液(DNA每管50nmol/L),用热循环仪升温至90℃,保持10min,再缓慢降至室温(退火),漩涡振荡混匀(1min),离心(将黏在离心盖上的溶液离心下来),取13μL用Hepes缓冲溶液稀释30倍(缓冲溶液377μL),漩涡振荡混匀,测量其在260nm处的吸光度,根据式(1)计算母液中DNA的浓度。将其配制成100μmol/L的母液备用。
$ {c_{{\rm{DNA}}}} = \left( {33 \times {A_{260}} \times 30 \times 1000} \right)/{M_W} $
(1) 式中,cDNA为DNA浓度(mol/L);33为DNA质量浓度(mg/mL);30为稀释倍数;1000为浓度换算;MW为DNA序列的相对分子质量。
1.4 光谱性能测试
紫外可见吸收光谱试验中采用的激发光源为氘灯,激发波长为295nm,发射波长为300~700 nm,扫描速度为12000nm·min-1,激发与发射的狭缝宽度均为2.5nm,采集数据前先用Hepes缓冲溶液对仪器进行校正。
2. 结果与讨论
2.1 半胱氨酸识别机制
Cys识别机制如图 1所示。DNA单链在K+存在的缓冲溶液中形成DNA G-四链体结构,DNA G-四链体和菁染料(ETC)分子相互识别后菁染料分子以紫色单体形式存在。当向体系中加入HgCl2后,HgCl2与DNA G-四链体序列中胸腺嘧啶形成T-Hg2+-T发夹型结构,使G-四链体解链,菁染料分子向蓝色J-聚集体形式转化。由于Cys与Hg2+有更高的亲和力,因此向体系中加入经预处理的Cys试样,Hg2+与Cys相互作用形成更为稳定的Hg(Ⅱ)-S结构,从而诱导富含鸟嘌呤的DNA单链释放重新折叠成稳定的DNA G-四链体结构。与此同时,菁染料分子从蓝色J聚集体形式转变为紫色单体形式。基于此策略,可通过DNA和Hg2+调控菁染料的聚集形式实现定性检测溶液样品中的Cys含量。
图 1
2.2 紫外吸收光谱
实验溶液配制如表 1所示。在紫外吸收光谱(图 2)中,1号样品中出现J-聚集体的特征吸收峰;2号样品加入DNA G-四链体后菁染料紫外吸收曲线发生蓝移;3号样品中加入Hg2+后菁染料紫外吸收曲线发生红移;4号样品相比3号样品为延长静置时间,试验结果为菁染料紫外吸收光谱红移效果明显。5号样品加入Cys后紫外吸收曲线发生蓝移。6号样品相比5号样品静置40min,紫外可见光谱蓝移明显,说明检测体系在40min后基本作用完全。通过上述实验,检测体系的可行性得到验证,说明利用该方法检测Cys的含量是可行的。
表 1
序号 Hepes缓冲溶液/μL DNA母液/μL HgCl2母液/μL Cys母液/μL 1 360 0 0 0 2 344 16 0 0 3 244 16 100 0 4 244 16 100 0 5 235 16 100 9 6 235 16 100 9 a1~6中KCl母液加入量均为32μL,ETC母液加入量均为10μL 图 2
2.3 K+浓度确定
菁染料能响应外界环境因素的变化,可在溶液环境中形成不同形式的聚集体,并因温度、pH[24]、极性[25]改变做出相应转换。因此需通过实验确定稳定菁染料的K+的浓度。K+浓度与吸光度的关系如图 3所示。由图 3(a)为菁染料紫外吸收光谱图可知,随K+浓度的增大,菁染料的吸光度呈上升趋势。图 3(b)为菁染料吸光度与K+浓度的拟合曲线图。K+浓度为8mmol/L时,菁染料的吸光度趋于平衡。说明此时ETC已经完全形成J-聚集体,因此确定适宜的K+浓度为8mmol/L。
图 3
2.4 DNA与菁染料的结合比
对G-四链体来说,配体的种类和数量是影响其结构稳定性的重要因素。本文通过实验确定了DNA与菁染料适宜结合比。固定ETC浓度为4μmol/L,测定加入不同浓度的DNA时的紫外光谱(见图 4(a)),随着DNA浓度的增大菁染料的紫外吸收波长由651nm蓝移至583nm处。图 4(b)为单体吸光度与DNA浓度拟合曲线图,当DNA浓度为4μmol/L时(即ETC/DNA摩尔比为1:1),ETC的单体吸光度趋于稳定。J聚集体吸光度与DNA浓度拟合曲线图见图 4(c),当DNA浓度为2μmol/L时,菁染料的J-聚集体吸光度趋于稳定。因此,利用紫外吸收光谱确定ETC与DNA的适宜结合比为1:1。
图 4
2.5 HgCl2的浓度确定
文献中大多数对Hg2+的检测都是基于Hg2+与T碱基的特异性结合来实现的[26],Hg2+可引起含T碱基的G-四链体结构发生改变,从而实现对Hg2+的检测。实验中固定菁染料和DNA的浓度为4μmol/L,Hg2+浓度为0~25μmol/L时体系的紫外吸收光谱见图 5(a)。随着Hg2+的加入,体系的吸收波长逐渐由580nm红移至646nm处。单体的吸光度在Hg2+浓度为10μmol/L时趋于平缓,J聚集体吸光度在Hg2+浓度为15μmol/L时基本达到最大。由此可知,HgCl2为15μmol/L时,诱导DNA G-四链体解链,ETC形成的J聚集体呈上升趋势,并最终确定HgCl2的适宜浓度为15μmol/L。
图 5
2.6 半胱氨酸的识别和检测
因为Hg2+与Cys的亲和力远高于Hg2+和碱基T的相互作用,因此Hg2+传感器可以进一步作为Cys的检测平台。在含有Hg2+的检测体系中加入Cys将作用在发卡结构DNA中的Hg2+分离出来,解除发卡结构,DNA-G四链体恢复原状,菁染料恢复单体形式,通过测试紫外吸收光谱的变化就可以用来检测Cys。溶液配制见表 2。
表 2
序号 Hepes缓冲溶液/μL Cys母液/μL 1 280.0 0 2 277.5 2.5 3 275.0 5.0 4 270.0 10.0 5 265.0 15.0 6 260.0 20.0 7 255.0 25.0 8 250.0 30.0 9 247.5 37.5 10 240.0 45.0 11 235.0 50.0 aDNA母液、KCl母液、ETC母液、HgCl2母液的加入量分别为20.0、40.0、10.0和150.0 μL 随着Cys浓度的增大,最大吸收波长由640nm蓝移至582nm(图 6(a)),且ETC单体的吸光度呈上升趋势,并在Cys浓度为12μmol/L时趋于稳定;J聚集体的吸光度随Cys浓度升高而降低,并在Cys浓度12μmol/L时趋于稳定(图 6(b))。取582nm处的紫外吸收值进行线性拟合得图 6(c),根据3σ/slope计算其检测限,在本实验中,背景样品的标准偏差σ=0.006124,通过拟合后的直线斜率(582nm)为0.00625,线性关系良好;探针的检测限达到0.9798μmol/L,表现出很高的灵敏度。
图 6
2.7 半胱氨酸的特异性检测
在相同的溶液体系下,Cys存在时菁染料在656nm处的吸光度接近于0,几乎没有J-聚集体,即Cys能够通过与Hg2+特异性结合而改变DNA状态,进而影响菁染料ETC的聚集形式。其他氨基酸(包括谷氨酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、酪氨酸、组氨酸以及天冬氨酸,浓度12μmol/L)在656nm处的吸光度大约在0.25,与Cys相比差异明显,说明其他氨基酸既难与Hg2+结合,同时对菁染料形态也没有影响。因此,本方法对Cys具有很好的特异性,其他氨基酸基本不产生干扰。
图 7
3. 结论
本实验利用简单的紫外吸收光谱对DNA和Hg2+调控菁染料的聚集形式来识别检测Cys。通过K+诱导富含G碱基的DNA单链形成G-四链体,G-四链体使菁染料以单体形式存在,随后Hg2+与DNA G-四链体中的胸腺嘧啶T结合成T-Hg2+-T发夹型复合结构,G-四链体解链,菁染料形成J-聚集体,从而得到检测Cys的溶液体系。该溶液体系能对Cys与Hg2+的特异性结合产生响应,由于Hg2+-S沉淀的形成,使DNA重新组合成为G-四链体,菁染料又重新变成单体。经实验证明,该溶液体系配制简单,检测耗费时间短,DNA无需标记,对Cys的检测限低至0.9798μmol/L,同时具有较高的选择性。本研究可为Cys快速检测方法的开发提供新的思路。
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表 1 半胱氨酸检测体系溶液配制表a
Table 1. Solution preparation table of cysteine detection system
序号 Hepes缓冲溶液/μL DNA母液/μL HgCl2母液/μL Cys母液/μL 1 360 0 0 0 2 344 16 0 0 3 244 16 100 0 4 244 16 100 0 5 235 16 100 9 6 235 16 100 9 a1~6中KCl母液加入量均为32μL,ETC母液加入量均为10μL 表 2 半胱氨酸识别与检测a
Table 2. Cysteine recognition and detection
序号 Hepes缓冲溶液/μL Cys母液/μL 1 280.0 0 2 277.5 2.5 3 275.0 5.0 4 270.0 10.0 5 265.0 15.0 6 260.0 20.0 7 255.0 25.0 8 250.0 30.0 9 247.5 37.5 10 240.0 45.0 11 235.0 50.0 aDNA母液、KCl母液、ETC母液、HgCl2母液的加入量分别为20.0、40.0、10.0和150.0 μL -

计量
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