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• 半胱氨酸(Cys)等生物硫醇在人的生理活动中起着重要作用。Cys不仅是谷胱甘肽、乙酰辅酶与牛磺酸的前体，同时也是生物体硫铁络合物中硫配体的提供者；人体内的Cys异常会引起生长缓慢、毛发色素褪色、水肿、嗜睡、肝功能损伤以及肥胖、皮肤松弛、身体虚弱等症状^{[1, 2]}。人体内同型Cys浓度过高可能引起心血管病和阿尔茨海默症，并且它在血浆中的总浓度还与某些先天性疾病和老年认知障碍有关^{[3, 4]}。鉴于生物硫醇在生理活动中的重要意义，科学家们对生物和环境样品中小分子硫醇的检测高度关注。

  许多疾病的特征在于各种生物分子表现出的异常活性，这些物质通常在细胞内外显示过表达现象，因此对其灵敏靶向识别可以提供诊断和治疗效用。核酸探针可以在稳定进入细胞的同时，特异性地结合目标物质，通过光学方法检测或通过成像技术标识出来。目前，比较常用的检测方法主要有圆二色谱法^[5]、毛细管电泳法、荧光光谱法^[6]、高效液相色谱法、质谱法^[7]以及表面拉曼增强法^[8]等。尽管这些方法在检测Cys方面已比较成熟，但它们对样品的纯度要求高，样品制备过程复杂。相比之下，菁染料核酸探针具有环境友好、检测限低、操作简单等优点。

  核酸探针，是指带有标记物的已知序列的核酸片段，可以和与其互补的核酸序列杂交，形成双链用于待测样品中特定基因序列的检测，或者具有特异性相互作用的分子存在时会导致其构型、构象改变，从而引起信号变化用于化学、生物、医学和药学等领域的靶向分子识别^{[9, 10]}。核酸探针通常是基于由富含G碱基的DNA链通过碱基间形成的Hoogsteen氢键的连接形成的DNA G-四链体^{[11, 12]}。稳定的DNA G-四链体能够诱导菁染料在溶液中的存在形式，而当DNA G-四链体结构被破坏时染料聚集形式发生变化，同时这种响应可以反复循环。利用上述传感机制进行小分子生物硫醇的检测已有文献报道。

  小分子与DNA的相互作用主要涉及DNA的二级结构^[13~15]，菁染料以非共价方式与DNA双链结合的方式主要有嵌入结合、小沟槽结合和外部静电结合三种。本文使用的菁染料3, 3′, -二(3-磺丙基)-4, 5, 4′, 5′, -二苯并-9-乙基-噻碳菁染料三乙胺盐(ETC，C₃₉H₄₇O₆N₃S₄)的结构如图式 1所示^[16]。此类菁染料能响应外界环境因素的变化，可在溶液环境中形成不同形式的聚集体，并因温度、酸度、无机盐浓度^{[17, 18]}和溶剂性质等条件的改变而诱导不同聚集形态之间发生相互转化。单体染料向J-聚集体转化时^[19]其吸收光谱红移，而转化为H-聚集形式时^[20]发生蓝移，同时菁染料ETC具有合成与纯化方法成熟、生物低毒等优点^[21~23]。

  图式 1

  

  图式 1.  ETC(菁染料)的结构

  Scheme 1.  Structure of ETC(cyanine dye)

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  据此，本文设计一种易合成、光谱从可见光到近红外可调、检测特异性高的含磺酸基菁染料作为Cys的新型紫外吸收核酸探针，利用Cys与Hg²⁺和DNA中T碱基与Hg²⁺的特异性结合，达到识别的目的，得到一种合成简单、特异性好、检测限低的Cys探针。

  1.   实验部分

  1.1   实验仪器与试剂

  UV-9000S紫外-可见吸收光谱仪(上海元析有限公司)；F-7000荧光分光光度计(株式会社日立集团)；Laborata 4000Heidolph旋涡振荡器(德国海道夫)；H 1650-W高速台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；Delta 320 pH计(梅特勒-托利多公司)；MilliPore超纯水制备仪(法国MilliPore公司)。

  ETC，分析纯，由中国科学院化学研究所提供；半胱氨酸(Cys)购自北京索莱宝科技有限公司；HgCl₂标准溶液(1000μg/mL)购自阿拉丁试剂公司；其他所用试剂均为市售分析纯级。DNA序列，AGRO 100：GGTGGTGGTGGTTGTGGTGG TGGTGG。

  1.2   溶液制备

  Hepes缓冲液：精确称量Hepes固体0.4774g配制20mmol/L的Hepes缓冲溶液母液，加入50mL超纯水后利用旋涡振荡器混匀溶解。Cys储液(Cys固体粉末储存-20℃，现用现配)：精确称量Cys固体粉末加入缓冲溶液配置为200μmol/L的储液，振荡混匀备用。菁染料：精确称量菁染料固体溶于甲醇配置为200μmol/L菁染料母液，用锡纸密封避光储存。KCl母液：精确称量KCl固体，溶于Hepes缓冲溶液中，配成100mmol/L的KCl母液。HgCl₂母液：量取HgCl₂溶液(1000μg/mL)5μL，加Hepes缓冲溶液配成50μmol/L HgCl₂母液。

  1.3   DNA溶解及浓度标定

  先将DNA离心，向其中加入480μL Hepes缓冲溶液(DNA每管50nmol/L)，用热循环仪升温至90℃，保持10min，再缓慢降至室温(退火)，漩涡振荡混匀(1min)，离心(将黏在离心盖上的溶液离心下来)，取13μL用Hepes缓冲溶液稀释30倍(缓冲溶液377μL)，漩涡振荡混匀，测量其在260nm处的吸光度，根据式(1)计算母液中DNA的浓度。将其配制成100μmol/L的母液备用。

  $ {c_{{\rm{DNA}}}} = \left( {33 \times {A_{260}} \times 30 \times 1000} \right)/{M_W} $

  (1)

  式中，c_DNA为DNA浓度(mol/L)；33为DNA质量浓度(mg/mL)；30为稀释倍数；1000为浓度换算；M_W为DNA序列的相对分子质量。

  1.4   光谱性能测试

  紫外可见吸收光谱试验中采用的激发光源为氘灯，激发波长为295nm，发射波长为300~700 nm，扫描速度为12000nm·min^-1，激发与发射的狭缝宽度均为2.5nm，采集数据前先用Hepes缓冲溶液对仪器进行校正。

  2.   结果与讨论

  2.1   半胱氨酸识别机制

  Cys识别机制如图 1所示。DNA单链在K⁺存在的缓冲溶液中形成DNA G-四链体结构，DNA G-四链体和菁染料(ETC)分子相互识别后菁染料分子以紫色单体形式存在。当向体系中加入HgCl₂后，HgCl₂与DNA G-四链体序列中胸腺嘧啶形成T-Hg²⁺-T发夹型结构，使G-四链体解链，菁染料分子向蓝色J-聚集体形式转化。由于Cys与Hg²⁺有更高的亲和力，因此向体系中加入经预处理的Cys试样，Hg²⁺与Cys相互作用形成更为稳定的Hg(Ⅱ)-S结构，从而诱导富含鸟嘌呤的DNA单链释放重新折叠成稳定的DNA G-四链体结构。与此同时，菁染料分子从蓝色J聚集体形式转变为紫色单体形式。基于此策略，可通过DNA和Hg²⁺调控菁染料的聚集形式实现定性检测溶液样品中的Cys含量。

  图 1

  

  图 1.  人体血清半胱氨酸识别机制图

  Figure 1.  Human serum cysteine recognition mechanism diagram

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  2.2   紫外吸收光谱

  实验溶液配制如表 1所示。在紫外吸收光谱(图 2)中，1号样品中出现J-聚集体的特征吸收峰；2号样品加入DNA G-四链体后菁染料紫外吸收曲线发生蓝移；3号样品中加入Hg²⁺后菁染料紫外吸收曲线发生红移；4号样品相比3号样品为延长静置时间，试验结果为菁染料紫外吸收光谱红移效果明显。5号样品加入Cys后紫外吸收曲线发生蓝移。6号样品相比5号样品静置40min，紫外可见光谱蓝移明显，说明检测体系在40min后基本作用完全。通过上述实验，检测体系的可行性得到验证，说明利用该方法检测Cys的含量是可行的。

  表 1

  

  表 1  半胱氨酸检测体系溶液配制表^a

  Table 1.  Solution preparation table of cysteine detection system

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  序号	Hepes缓冲溶液/μL	DNA母液/μL	HgCl2母液/μL	Cys母液/μL
  1	360	0	0	0
  2	344	16	0	0
  3	244	16	100	0
  4	244	16	100	0
  5	235	16	100	9
  6	235	16	100	9
  a1~6中KCl母液加入量均为32μL，ETC母液加入量均为10μL

  图 2

  

  图 2.  紫外吸收光谱检测的可行性试验

  Figure 2.  Feasibility test of UV absorption spectroscopy detection

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  2.3   K⁺浓度确定

  菁染料能响应外界环境因素的变化，可在溶液环境中形成不同形式的聚集体，并因温度、pH^[24]、极性^[25]改变做出相应转换。因此需通过实验确定稳定菁染料的K⁺的浓度。K⁺浓度与吸光度的关系如图 3所示。由图 3(a)为菁染料紫外吸收光谱图可知，随K⁺浓度的增大，菁染料的吸光度呈上升趋势。图 3(b)为菁染料吸光度与K⁺浓度的拟合曲线图。K⁺浓度为8mmol/L时，菁染料的吸光度趋于平衡。说明此时ETC已经完全形成J-聚集体，因此确定适宜的K⁺浓度为8mmol/L。

  图 3

  

  图 3.  菁染料ETC的最佳K⁺浓度

  (a)不同浓度K⁺溶液中菁染料的紫外吸收光谱；(b)不同浓度K⁺溶液中651nm的吸收度变化

  Figure 3.  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different K⁺ solutions

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  2.4   DNA与菁染料的结合比

  对G-四链体来说，配体的种类和数量是影响其结构稳定性的重要因素。本文通过实验确定了DNA与菁染料适宜结合比。固定ETC浓度为4μmol/L，测定加入不同浓度的DNA时的紫外光谱(见图 4(a))，随着DNA浓度的增大菁染料的紫外吸收波长由651nm蓝移至583nm处。图 4(b)为单体吸光度与DNA浓度拟合曲线图，当DNA浓度为4μmol/L时(即ETC/DNA摩尔比为1:1)，ETC的单体吸光度趋于稳定。J聚集体吸光度与DNA浓度拟合曲线图见图 4(c)，当DNA浓度为2μmol/L时，菁染料的J-聚集体吸光度趋于稳定。因此，利用紫外吸收光谱确定ETC与DNA的适宜结合比为1:1。

  图 4

  

  图 4.  菁染料ETC在不同DNA溶液中的紫外吸收光谱

  (a)不同浓度DNA溶液中菁染料的紫外吸收光谱; (b)不同浓度DNA溶液中583nm的吸收变化；(c)不同浓度DNA溶液中651nm的吸收变化

  Figure 4.  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different DNA solutions

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  2.5   HgCl₂的浓度确定

  文献中大多数对Hg²⁺的检测都是基于Hg²⁺与T碱基的特异性结合来实现的^[26]，Hg²⁺可引起含T碱基的G-四链体结构发生改变，从而实现对Hg²⁺的检测。实验中固定菁染料和DNA的浓度为4μmol/L，Hg²⁺浓度为0~25μmol/L时体系的紫外吸收光谱见图 5(a)。随着Hg²⁺的加入，体系的吸收波长逐渐由580nm红移至646nm处。单体的吸光度在Hg²⁺浓度为10μmol/L时趋于平缓，J聚集体吸光度在Hg²⁺浓度为15μmol/L时基本达到最大。由此可知，HgCl₂为15μmol/L时，诱导DNA G-四链体解链，ETC形成的J聚集体呈上升趋势，并最终确定HgCl₂的适宜浓度为15μmol/L。

  图 5

  

  图 5.  菁染料ETC在不同HgCl₂溶液中的紫外吸收光谱

  (a)不同浓度HgCl₂中菁染料的紫外吸收光谱；(b)不同浓度DNA溶液中646nm的吸收度变化

  Figure 5.  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different HgCl₂ solutions

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  2.6   半胱氨酸的识别和检测

  因为Hg²⁺与Cys的亲和力远高于Hg²⁺和碱基T的相互作用，因此Hg²⁺传感器可以进一步作为Cys的检测平台。在含有Hg²⁺的检测体系中加入Cys将作用在发卡结构DNA中的Hg²⁺分离出来，解除发卡结构，DNA-G四链体恢复原状，菁染料恢复单体形式，通过测试紫外吸收光谱的变化就可以用来检测Cys。溶液配制见表 2。

  表 2

  

  表 2  半胱氨酸识别与检测^a

  Table 2.  Cysteine recognition and detection

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  序号	Hepes缓冲溶液/μL	Cys母液/μL
  1	280.0	0
  2	277.5	2.5
  3	275.0	5.0
  4	270.0	10.0
  5	265.0	15.0
  6	260.0	20.0
  7	255.0	25.0
  8	250.0	30.0
  9	247.5	37.5
  10	240.0	45.0
  11	235.0	50.0
  aDNA母液、KCl母液、ETC母液、HgCl2母液的加入量分别为20.0、40.0、10.0和150.0 μL

  随着Cys浓度的增大，最大吸收波长由640nm蓝移至582nm(图 6(a))，且ETC单体的吸光度呈上升趋势，并在Cys浓度为12μmol/L时趋于稳定；J聚集体的吸光度随Cys浓度升高而降低，并在Cys浓度12μmol/L时趋于稳定(图 6(b))。取582nm处的紫外吸收值进行线性拟合得图 6(c)，根据3σ/slope计算其检测限，在本实验中，背景样品的标准偏差σ=0.006124，通过拟合后的直线斜率(582nm)为0.00625，线性关系良好；探针的检测限达到0.9798μmol/L，表现出很高的灵敏度。

  图 6

  

  图 6.  菁染料ETC在不同Cys溶液中的紫外吸收光谱

  (a)不同Cys下菁染料的紫外吸收光谱；(b)不同浓度DNA溶液中A_582nm与A_640nm的吸收度变化；(c) A_582nm的吸收度与Cys浓度的线性关系

  Figure 6.  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different Cys solutions

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  2.7   半胱氨酸的特异性检测

  在相同的溶液体系下，Cys存在时菁染料在656nm处的吸光度接近于0，几乎没有J-聚集体，即Cys能够通过与Hg²⁺特异性结合而改变DNA状态，进而影响菁染料ETC的聚集形式。其他氨基酸(包括谷氨酰胺、谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、酪氨酸、组氨酸以及天冬氨酸，浓度12μmol/L)在656nm处的吸光度大约在0.25，与Cys相比差异明显，说明其他氨基酸既难与Hg²⁺结合，同时对菁染料形态也没有影响。因此，本方法对Cys具有很好的特异性，其他氨基酸基本不产生干扰。

  图 7

  

  图 7.  菁染料ETC在不同氨基酸溶液中的紫外吸收光谱

  Figure 7.  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different amino acid solutions

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  3.   结论

  本实验利用简单的紫外吸收光谱对DNA和Hg²⁺调控菁染料的聚集形式来识别检测Cys。通过K⁺诱导富含G碱基的DNA单链形成G-四链体，G-四链体使菁染料以单体形式存在，随后Hg²⁺与DNA G-四链体中的胸腺嘧啶T结合成T-Hg²⁺-T发夹型复合结构，G-四链体解链，菁染料形成J-聚集体，从而得到检测Cys的溶液体系。该溶液体系能对Cys与Hg²⁺的特异性结合产生响应，由于Hg²⁺-S沉淀的形成，使DNA重新组合成为G-四链体，菁染料又重新变成单体。经实验证明，该溶液体系配制简单，检测耗费时间短，DNA无需标记，对Cys的检测限低至0.9798μmol/L，同时具有较高的选择性。本研究可为Cys快速检测方法的开发提供新的思路。

  
  
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  图式 1  ETC(菁染料)的结构

  Scheme 1  Structure of ETC(cyanine dye)

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  图 1  人体血清半胱氨酸识别机制图

  Figure 1  Human serum cysteine recognition mechanism diagram

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  图 2  紫外吸收光谱检测的可行性试验

  Figure 2  Feasibility test of UV absorption spectroscopy detection

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  图 3  菁染料ETC的最佳K⁺浓度

  Figure 3  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different K⁺ solutions

  (a)不同浓度K⁺溶液中菁染料的紫外吸收光谱；(b)不同浓度K⁺溶液中651nm的吸收度变化

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  图 4  菁染料ETC在不同DNA溶液中的紫外吸收光谱

  Figure 4  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different DNA solutions

  (a)不同浓度DNA溶液中菁染料的紫外吸收光谱; (b)不同浓度DNA溶液中583nm的吸收变化；(c)不同浓度DNA溶液中651nm的吸收变化

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  图 5  菁染料ETC在不同HgCl₂溶液中的紫外吸收光谱

  Figure 5  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different HgCl₂ solutions

  (a)不同浓度HgCl₂中菁染料的紫外吸收光谱；(b)不同浓度DNA溶液中646nm的吸收度变化

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  图 6  菁染料ETC在不同Cys溶液中的紫外吸收光谱

  Figure 6  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different Cys solutions

  (a)不同Cys下菁染料的紫外吸收光谱；(b)不同浓度DNA溶液中A_582nm与A_640nm的吸收度变化；(c) A_582nm的吸收度与Cys浓度的线性关系

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  图 7  菁染料ETC在不同氨基酸溶液中的紫外吸收光谱

  Figure 7  Ultraviolet absorption spectrum of cyanine dye ETC in different amino acid solutions

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  表 1  半胱氨酸检测体系溶液配制表^a

  Table 1.  Solution preparation table of cysteine detection system

  序号	Hepes缓冲溶液/μL	DNA母液/μL	HgCl2母液/μL	Cys母液/μL
  1	360	0	0	0
  2	344	16	0	0
  3	244	16	100	0
  4	244	16	100	0
  5	235	16	100	9
  6	235	16	100	9
  a1~6中KCl母液加入量均为32μL，ETC母液加入量均为10μL

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  表 2  半胱氨酸识别与检测^a

  Table 2.  Cysteine recognition and detection

  序号	Hepes缓冲溶液/μL	Cys母液/μL
  1	280.0	0
  2	277.5	2.5
  3	275.0	5.0
  4	270.0	10.0
  5	265.0	15.0
  6	260.0	20.0
  7	255.0	25.0
  8	250.0	30.0
  9	247.5	37.5
  10	240.0	45.0
  11	235.0	50.0
  aDNA母液、KCl母液、ETC母液、HgCl2母液的加入量分别为20.0、40.0、10.0和150.0 μL

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