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磷脂组学研究中的分析检测技术

朱超 ,  梁琼麟 ,  王义明 ,  罗国安 ,  Rob J. Vreeken ,  Thomas Hankemeier

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引用本文: 朱超,  梁琼麟,  王义明,  罗国安,  Rob J. Vreeken,  Thomas Hankemeier. 磷脂组学研究中的分析检测技术[J]. 分析化学, 2016, 44(6): 984-993. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.150971 shu
Citation:  ZHU Chao,  LIANG Qiong-Lin,  WANG Yi-Ming,  LUO Guo-An,  Rob J. Vreeken,  Thomas Hankmeimer. Advance in Analysis and Detection Technologies for Phospholipidomics[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2016, 44(6): 984-993. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.150971 shu

磷脂组学研究中的分析检测技术

  • 1.

    德州学院医药与护理学院, 德州 山东253023;

  • 2.

    清华大学化学系, 生命有机磷与化学生物学教育部重点实验室, 北京 100084;

  • 3.

    Division of Analytical Biosciences, Leiden University, P.O. Box 9502, 2300 RA, Leiden, The Netherlands;

  • 4.

    Discovery & Exploratory BA, Discovery Sciences, Janssen R&D, Turnhoutseweg 30, 2340 Beerse, Belgium

  • 基金项目:

    本文系国家自然科学基金项目(Nos.81202502,81130066,81230079)资助

摘要: 磷脂是细胞膜的主要组分,有非常重要的生理功能,与人类健康、疾病密切相关。因此,有必要对生物体内磷脂化合物进行全面的分析,深入研究磷脂在疾病发生发展过程中的生物功能。磷脂组学是通过全面的定性与定量分析磷脂化合物解决现有生物学问题的研究模式。磷脂分析检测技术是实现磷脂组学研究的关键,包括样品前处理、分离、定性与定量分析和组学数据挖掘等。本文综述了磷脂组学研究中的分析检测技术,为发展快速、稳定、可靠、高灵敏、高分辨、高通量的磷脂检测平台技术提供参考。磷脂组学与其他组学的整合研究将促进生命分析化学的进一步发展。

English

  • 1.   引 言

    磷脂是细胞膜的主要成分,是生物活性物质及信息分子前体的贮备物质,在细胞生长、细胞迁移、细胞信号转导、细胞识别、细胞相互作用、细胞凋亡等方面都具有重要的生理功能[1~9]。磷脂通过影响人体内分泌或神经系统起到调节人体代谢的作用,与肥胖、糖尿病、癌症、阿尔兹海默病、心血管疾病等多种疾病密切相关,甚至被认为是某些疾病的潜在生物标志物[10~16]。因此,有必要对生命体内的磷脂化合物进行准确、高效的检测,深入研究磷脂的生物功能,探讨其与疾病发生、发展的关系并发现其在疾病预防、诊断和治疗过程中的生物作用。

    磷脂组学是对生物系统中磷脂化合物进行全面的定性、定量,解决现有与磷脂及其代谢相关的生物学问题。其研究策略 (图 1) 采用代谢组学的研究模式:针对疾病发生、发展、诊断、治疗,药物安全性和疗效评价等生物学问题制定解决方案,设计并实施实验过程,对大量生物样本的检测数据进行多元统计分析,寻找有关的潜在生物标志物,并进行验证和阐释生物学意义。其中,最关键的就是要有可靠的数据来源。这些数据的获取依赖于磷脂分析检测技术。

    图 1

    图 1  磷脂组学研究的一般策略
    Figure 1.  Strategy for phospholipidomics
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    磷脂分析检测技术包括样本前处理、磷脂化合物分离 (轮廓谱的获取)、定性与定量分析及组学数据挖掘和相关数据库的建立。本文对磷脂分析检测技术进行综述,对磷脂组学的研究前景进行展望,为代谢组学研究发展新技术、新方法提供有价值的参考。

    2.   磷脂的种类与结构

    磷脂主要分为两大类,一类是甘油磷脂,另一类是鞘磷脂。甘油磷脂分子由4部分构成:1个磷酸,1个甘油骨架,1个亲水头部R和1个疏水尾部 (图 2A)。亲水头部R是磷脂分子的极性端,可以是胆碱、乙醇胺、肌醇、丝氨酸、甘油,构成不同类的甘油磷脂化合物:磷脂酸 (PA)、溶血磷脂酸 (LPA)、磷脂酰胆碱 (PC)、溶血性磷脂酰胆碱 (LPC)、磷脂酰乙醇胺 (PE)、溶血性磷脂酰乙醇胺 (LPE)、磷脂酰肌醇 (PI)、溶血磷脂酰肌醇 (LPI)、磷脂酰丝氨酸 (PS)、溶血磷脂酰丝氨酸 (LPS)、磷脂酰甘油 (PG)、溶血磷脂酰甘油 (LPG)、双磷脂酰甘油 (DPG)。疏水尾部是磷脂分子的非极性端,主要由一条或两条含有不同碳数 (n=14~22) 和不同不饱和度的(n=0~6) 的脂肪酸链构成。甘油结构中C1位置常连结饱和脂肪酸链,C2位置则常连结不饱和脂肪酸链。鞘磷脂分子结构与甘油磷脂结构非常相似,由4部分构成: 1个磷酸,1个亲水头部R',1个鞘氨醇和1个脂肪酸 (图 2B)。鞘磷脂的亲水头部R'可以是胆碱或乙醇胺,是分子极性端;疏水尾部则由1条不同碳数和不同不饱和度的脂肪酸链与1条鞘氨醇的烃基链构成。脂肪酸链碳数相同不饱和度相同的情况下双键位置也有不同。基于以上不同,同类磷脂化合物中包括含多种不同脂肪酸链的分子,可鉴定的磷脂分子理论总数超过1000种。

    图 2

    图 2  磷脂分子结构示意图:(A)甘油磷脂,(B)鞘磷脂
    Figure 2.  Molecular structure of phospholipids. (A) Glycerol phospholipid,(B) Sphingomyelin
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    磷脂分子属于两性分子。针对磷脂化合物的性质选择提取、分离、检测手段,获取定性或定量信息进而筛查生物学问题相关的潜在标志物并建立数据库,是磷脂组学研究中分析检测技术应完成的任务。随着仪器分析和计算科学的不断发展,磷脂分析检测技术正在进一步完善。通过整合多种方法构建新型磷脂检测平台技术将满足磷脂组学研究对发展简便、快捷、高精度、高分辨、高通量的系统分析方法的要求。

    3.   磷脂分析检测技术

    3.1.   生物样本的前处理

    3.2.   磷脂的分离

    色谱是分离磷脂的主要手段。磷脂具有不挥发、易吸水、不耐高温等特点,不同类磷脂分子结构类似,同类分子之间只有脂肪酸链的碳数和不饱和度的差别。分离时易出现色谱峰重叠、拖尾等问题。因此,获得良好色谱分离必须选择合适的分离方法和洗脱方式。用于磷脂分离的主要色谱方法有薄层色谱法 (TLC)、HPLC和GC。由于GC分离磷脂化合物需经过衍生化,其应用受到一定限制。本文主要介绍TLC和HPLC方法。

    3.3.   磷脂的定性与定量分析

    磷脂组学的研究目标是研究磷脂的生物功能,寻找磷脂及其代谢与疾病发生发展的关系。前提是对复杂生物体系内的磷脂化合物进行定性与定量分析。要确定磷脂化合物的类别归属 (确定分子的极性头部和骨架)、分子结构 (脂肪酸链的碳数、双键数和双键位置)、生物样本中的含量,从而深入研究其代谢途径和代谢差异。由于磷脂分子结构的多样性和相似性,对磷脂化合物进行全面的定性与定量分析是很大的挑战。常用方法有光谱法、质谱或色谱质谱联用法、核磁共振法等 (表 2)。

    表 2

    表 2  磷脂的定性和定量检测技术总结
    Table 2.  Summary on technologies for qualitative and quantitative detection of phospholipids
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    检测技术 Detection technology类型 Type定性技术 Qualitation定量技术 Quantitation特点 Evaluation
    光谱 Spectrometry紫外光谱 Ultraviolet (UV) spectroscopy基于色谱分离提供的保留时间 Based on retention of chromatographic separation优秀 Excellent可直接测定,操作简单、线性良好、回收率高、精密度高 Direct measurement,easy to operate good linearity,high recovery and high precision
    傅里叶变换红外光谱 Fourier Transform infrared spectroscopy (FTIR)基于C=O, PO2,P-O-C 振动吸收 Based onvibration absorption of C=O, PO2,P-O-C优秀 Excellent操作简便、分析速度快、准确度高、重复性良好 Rapid,easy to operate,high accuracy,good repeatability
    质谱 Mass spectrometry (MS)离子阱质谱 Ion trap mass spectrometry (ITMS)基于多级质谱碎片信息 Based onMSn fragmentation 中等 Good可提供多级质谱碎片离子信息 MSn fragmentation
    飞行时间/四级杆飞行时间 Time of flight mass spectrometry,TOFMS/ Quadrupole time of flight mass spectrometry (QTOFMS)基于精确分子质量/QTOF的二级质谱碎片信息 Based on accurate mass (TOF/QTOF) and MSn fragmentation (QTOF)中等 Good高分辨率、高质量准确度 High resolution,high mass accuracy
    傅里叶变换光谱 Fourier transform mass spectrometry (FTMS)基于精确分子质量 Based on accurate mass优秀 Excellent高分辨率、高质量准确度、稳定性好 High resolution,high massaccuracy,good stability
    轨道阱质谱 Obitrap mass spectrometry基于精确分子质量 Based on accurate mass中等 Good高分辨率、高质量准确度 High resolution,high mass accuracy
    核磁共振谱 Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR)高分辨魔角旋转磁共振 High-resolution magic angle spinning, HR-MAS NMR基于磷原子31P的核磁共振效应 Based on 31P NMR优秀 Excellent快速、准确性较高、无损检测 Rapid,high accuracy,nondestructive

    3.4.   组学数据挖掘

    3.1.2.   磷脂的衍生化

    磷脂的衍生化是通过结构修饰改变分子性质,从而改善HPLC、毛细管电泳 (CE)、气相色谱 (GC) 等方法检测磷脂的选择性和灵敏度,实现磷脂化合物进行定性和定量[37]。衍生化方法主要包括:直接衍生化、水解后衍生化和其他衍生化。对于含有氨基头部的磷脂化合物一般采用直接衍生化,其紫外吸收强度和傅里叶变换响应都会增强,检测限能达到pmol水平[38]。Haddadian等[39]用甲基-β-环糊精修饰的胶束电毛细管色谱检测荧光染料3-(2-糠酰)-喹啉-3-环己烯 (FQ) 标记的氨基磷脂分子,检出限最低可以达到0.1 fg。对于大多数的磷脂化合物,特别是甘油磷脂,常采用的衍生化方法是水解后的衍生化。甘油磷脂水解后生成甘油二酯,其中的自由羟基可被酰化或酯化,适于光谱检测。当采用气相色谱 (GC) 检测时,首先用过磷脂酶C进行水解,后选择不同试剂,例如:特丁基二甲基硅烷 (TBDMS)[40]、三甲基硅烷 (TMS)[41]、五氟苯甲酰 (PFB)[42]、七氟丁酸酐 (HFB)[43]等进行衍生化,降低化合物极性,提高灵敏度。

    3.1.1.   磷脂的提取

    由于生物样本具有多样性,涉及磷脂分析的生物样本主要有血浆或血清、组织样本、细胞样本等[17]。从复杂生物样本中提取两性磷脂化合物,主要方法包括液液萃取、液固萃取、单一溶剂提取。

    已经报道的磷脂或总脂的液液萃取方法有多种,如Folch法[18, 19, 22]、Bligh and Dyer (BD) 法[19, 20]、Gerber法[21]、Babcock法[21]、Werner-Schmid法[21]和Rose-Gottlieb法[22]。其中BD法被认为是磷脂化合物提取的"金标准",即采用极性较小的氯仿 (或二氯乙烷) 和极性相对较强的甲醇作为提取溶剂,使样本中不同极性的磷脂化合物更好的溶出。此方法被广泛用于提取细胞、血浆、脑组织和肝组织样品中的总脂[23~25]。其它常用的磷脂提取的溶剂体系还有正己烷/异丙醇/丙酮[26]。但是,液液萃取法所需样本量大 (>100 μL),且耗时长,在萃取、超声、纯化过程中,磷脂化合物会有一定程度的损失[26]。

    固相萃取 (SPE) 是磷脂分离和富集的另外一种有效手段,能够去除样本中的中性脂,更适合磷脂化合物的提取。SPE可实现与色谱、质谱或NMR技术的在线串联[27, 28]。目前应用的固相萃取方法中常采用的吸附剂有C18和键合硅胶[29]、Si[30]、TiO2/SiO2核壳颗粒[31]、丙氨基硅胶键合相[32]等。洗脱剂则以氯仿、甲醇、异丙醇、正己烷等为主。常用的缓冲盐包括乙酸铵、甲酸铵等。Fauland等[33]采用两根硅胶柱与一根氨基键合硅胶柱组合,将PC,LPC,PE,PI,PA,CL,PG,PS,SM等通过4个洗脱片段进行分离。SPE法可以连续处理多个样品,操作简单、重复性好、提取回收率能够满足分析要求。

    为获得更好的提取效率,降低样本用量,单一溶剂提取方法被众多研究者所采用。Matyash等[34]利用甲基叔丁基醚 (MTBE) 提取生物样品中的脂类物质。MTBE有超强的选择性,不溶物可以离心除去。利用甲醇 (MeOH) 能够简便快捷的提取血浆磷脂,得到较为理想的提取回收率,适于提取血浆中的大部分磷脂[35]。我们在之前的研究中采用异丙醇 (IPA) 法取代MeOH法提取血浆磷脂。结果表明,IPA作为提取溶剂时,除溶血卵磷脂的提取效率低于MeOH法,其它各类磷脂的提取率均高于或相当于MeOH法[36]。单一溶剂的提取方法省去了富集过程、降低了提取过程中的损失,而且样本用量低 (＜10 μL)。

    3.2.2.   高效液相色谱(HPLC)

    良好的分离非常有利于复杂样本的定性与定量分析。虽然TLC在磷脂类别分离方面存在一定优势,但其并不适于同类别内的不同磷脂分子的分离。借助HPLC系统可以实现磷脂化合物类别间和类别内的分离,为磷脂化合物定性提供了保留时间信息,也有利于磷脂的定量分析。用于磷脂分离的主要色谱方法包括反相高效液相色谱 (RPLC)、正相高效液相色谱 (NPLC) 和亲水色谱 (HILIC),且可以串联不同的检测器,如紫外 (UV)、蒸发光散射 (ELSD)[52]和质谱 (MS)。

    RPLC法能够实现同一类磷脂化合物中不同分子的分离,但各类别间的分离效果较差,极性较强的脂先被洗脱出来[24,52~54]。NPLC法能够实现较好的类别间的分离,极性较弱的脂先被洗脱出来[23, 55, 56]。由于NPLC方法常采用弱极性溶剂作为流动相,与极性相对较强溶液混合易产生气泡,保留时间的飘移不可避免。HILIC法则使用RPLC法的流动相系统,其洗脱顺序却与NPLC法相同,克服了NPLC法保留时间飘移的缺陷,重现性良好[29, 57, 58]。磷脂化合物的极性差别会影响分离度,因此,在洗脱方式上,梯度洗脱比等度洗脱更有利于磷脂分离,会获得更好的峰形和分离度。磷脂化合物的HPLC分离方法总结见表 1。

    表 1

    表 1  HPLC分离磷脂化合物方法总结
    Table 1.  Method summary on HPLC separation of phospholipids(PLs)
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    色谱类型 Type固定相 Solid phase流动相 (缓冲试剂) Mobile phase (buffer reagent)洗脱方式 Elution mode检测器 Detector分离组分 Separated PLs
    NPLCSi甲醇(冰醋酸) Methanol (glacial acetic acid)等度 Isocratic ELSDPC/LPC/PE/PA
    Zorbax Rx-SIL正己烷-异丙醇-水(硫酸铵) Hexane-Isopropanol-H2O (ammonium sulfate)等度 IsocraticUVPE/PG/CL/PI/PS/LPE/PC/LPC
    Hypersil Si正己烷-异丙醇-乙醇(醋酸铵/醋酸) Hexane-Isopropanol-Ethanol (ammonium acetate/acetic acid)等度 IsocraticUVPE/PI/CL/PS/LPS/PC/LPC
    TracerExtrasil SI乙腈-甲醇(磷酸) Acetonitrile-Methanol (phosphoric acid)等度 IsocraticUVPI/PS/PE/PC/SM
    Hypersil Si氯仿-甲醇-水(乙酸铵) CHCl3-Methanol-H2O (ammonium acetate)梯度 GradientMSPG/PI/PE/LPC/LPE/LPG/PC/PS
    Lichropher 100 Diol正己烷-异丙醇(乙酸/氨水) Hexane-Isopropanol (acetic acid/ammonia)梯度 GradientMSPG/CL/PE/PC/PI
    Nucleosil 100-5OH正己烷-异丙醇(甲酸/氨水) Hexane-Isopropanol (formic acid/ammonia)等度 IsocraticMSPE/PG/PI/PS/PC/SM/LPC
    RPLCZORBAX C18甲醇-正己烷(酸胺/甘油) Methanol-Hexane (acid amide/glycerol)等度 IsocraticMSPC/LPC/PE/PA
    P-E C18甲醇-乙腈-水 Methanol-Acetonitrile-H2O等度 IsocraticUVPE/PG/CL/PI/PS/LPE/ PC/LPC
    Sephasil C8乙腈-甲醇(三氟乙酸) Methanol-Acetonitrile (trifluoroacetic acid)等度 IsocraticUVPE/PI/CL/PS/LPS/PC/LPC
    ZORBAX RP乙腈-甲醇(乙酸铵) Methanol-Acetonitrile (ammonium acetate)梯度 GradientMSPI/PS/PE/PC/SM
    Prodigy ODS氯仿-甲醇-乙腈-水 CHCl3-Methanol-Acetonitrile-H2O梯度 GradientELSDPG/PI/PE/LPC/LPE/ LPG/PC/PS
    Ascentis Express C8乙腈-异丙醇-水(甲酸铵) Acetonitrile-Isopropanol-H2O (ammonium formate)梯度 GradientMSPG/CL/PE/PC/PI//LPC/LPE
    HILICNucleosil 100-5OH乙腈-水(甲酸/甲酸铵) Acetonitrile-H2O (formic acid/ammonium formate)梯度 GradientMSPE/PG/PI/PS/PC/SM/LPC
    Spherisorb silica gel乙腈-甲醇(磷酸) Methanol-Acetonitrile (phosphoric acid)梯度 GradientUVPE/PG/PI/PS/PC/SM/LPC
    Ascentis Express HILIC乙腈-水(甲酸铵) Acetonitrile-H2O(ammonium formate)梯度 GradientMSPI/PE/PC/LPC
    BEH HILIC乙腈-水(甲酸/甲酸铵) Acetonitrile-H2O (formic acid/ammonium formate)梯度 GradientMSPC/PE
    Silica based HILIC乙腈-甲醇(乙酸铵) Methanol-Acetonitrile (ammonium acetate)等度 IsocraticMS
    PA: phosphatidic acid; PC: phosphatidylcholine; LPC: lysophosphatidylcholine; PE : phosphatidyl-ethanolamine; LPE: lysophosphatidyl-ethanolamine; PI : phosphatidylinositol; LPI : lysophosphatidylinositol; PS: phosphatidylserine; LPS : lysophosphatidylserine; PG :phosphatidylglycerol; LPG: lysophosphatidylglycerol CL: Cardiolipin; SM: sphingomyelin.

    基于各类型色谱的优缺点,二维液相色谱方法(如2D-NPLC-RPLC[59, 60]、2D-HILIC-RPLC[61~63])能够同时获得良好的类别间和类别内分离,被广泛应用于磷脂组学的研究,其缺陷在于单次运行的时间比较长,分析通量小。因此,建立快速二维分离方法对于磷脂分析检测技术发展和磷脂组学研究有很好的促进作用。

    3.2.1.   薄层色谱(TLC)/高效薄层色谱(HPTLC)

    TLC是利用不同磷脂种类在薄层板上产生不同的比移值,从而达到分离的目的[44],适于不同类别磷脂的分离。薄层色谱的吸附剂是涂抹在玻璃板、塑料或铝基片上的,主要有两种:硅胶G和硅胶H,其中硅胶H的吸附性更强。洗脱剂常用氯仿-甲醇-水 (醋酸盐缓冲液或氨水),具体实验应根据吸附剂的使用情况调整洗脱剂的种类和比例[45~47]。常用的显色剂包括:Dittmer-lester 钼蓝显色剂、茚三酮试剂、碘蒸气显色、Vaskovsky试剂和Dragendorff 试剂等。TLC能够实现不同种类磷脂化合物的分离,通过与标准品对照进行定性与定量分析。方法简单、方便、直观,但预处理繁琐、耗时,且影响准确度,需较高的点样技术。TLC或二维TLC(2D-TLC)在HPLC出现之前是非常重要的磷脂分离方法,由于方便、快速,现在仍被广泛用于磷脂的类别分离[32, 46, 48, 49]。目前,高效薄层色谱 (HPTLC) 和二维高效薄层色谱 (2D-HPTLC)[50, 51]方法应用较多。

    3.3.2.   质谱(MS)

    磷脂化合物的定性不仅要明确化合物的类别归属,更要明确分子组成。色谱分离可以提供用于判定类别归属的保留时间还可以抵消质谱中部分离子抑制。质谱提供磷脂分子的质量信息、离子碎片或中性丢失信息,从而进一步确定可能的分子结构。磷脂检测中常用的质谱检测器包括:离子阱质谱 (IT)[23]、飞行时间质谱 (TOF)[23]、四级杆飞行时间质谱(QTOF)[66]、傅里叶转换质谱 (FT)[24]、轨道阱质谱 (Orbitrap)[67]等。IT和QTOF可以提供多级碎片信息;TOF,QTOF,FT,Orbitrap具有较高的分辨率,可以提供精确分子质量。高分辨质谱在鉴定m/z接近而元素组成不一致的基团时优势明显。采用色谱质谱联用技术就可以根据保留时间、精确分子量和碎片离子信息对磷脂化合物进行结构鉴定[67~70],根据多级质谱信息确定相同分子量含有不同脂肪酸链的磷脂结构。然而,磷脂分子中不饱和脂肪酸链C=C双键位置的确定仍是难点。

    质谱检测的离子信号强度(在一定范围内)均与离子数量大致线性相关。通过建立峰面积 (或待测物峰面积与内标物比值) 和标准品溶液浓度的标准曲线,由回归方程计算得到未知样本的含量[23, 24, 29]。由于磷脂标准品种类受限,每类或离子化行为一致的多类磷脂可共用一种标准品进行定量分析。

    3.3.1.   光谱

    光谱主要利用磷脂化合物的特征吸收对磷脂进行定性与定量分析。通过最大吸收波长下的紫外吸收峰与磷脂标准溶液浓度的关系建立回归方程,计算得到总磷脂或某类磷脂的含量。该方法只需排除非磷脂干扰,不需经过分离就可直接测定,操作简单、线性良好、回收率高、精确度高。紫外检测器是HPLC测定磷脂化合物常用的检测器[64]。磷脂化合物经过分离后,根据色谱峰的保留时间定性,根据峰面积积分值定量分析,但必须要有对应的同类磷脂的标准品。

    利用傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 中提供的由于C=O, PO2,P-O-C振动吸收在1200~970 nm产生的谱带信息进行定性与定量分析。 通过建立磷脂峰面积与浓度的回归方程,计算出磷脂含量[65]。该方法准确度高、重复性良好、操作简便、分析速度快。

    3.3.3.   核磁共振谱(NMR)

    核磁共振技术是最通用的复杂生物样本的分析手段,利用磷原子31P的核磁共振效应对磷脂化合物进行定性和定量分析。不同类别的磷脂由于化学环境不同,31P的化学位移也不同,通过监测31P的化学位移来鉴定磷脂的分子结构,其含量则由核磁响应信号的积分确定[71]。借助1D NMR和2D-NMR可以确定磷脂分子脂肪酸链中双键的位置[72~76]。NMR可与HPLC、MS、SPE等手段整合运用,获取更有价值的结构信息,实现已知和未知磷脂化合物分子的结构鉴定,特别是分子中不饱和脂肪酸链的结构确认[75, 76]。NMR具有快速、准确性较高、深入物质内部而不破坏被测物质等优点[77]。因此,核磁共振技术为磷脂化合物的结构鉴定提供了强有力的工具。然而,样本用量大限制了NMR在生物样本分析中的应用。此外,近年发展的高分辨魔角旋转核磁共振技术 (HR-MAS) 能够消除非均相溶液中磁化率不同引起的谱线加宽,可以直接用于完整组织和器官中磷脂化合物的检测,灵敏度较高[78]。

    发展新型平台技术,必须综合考虑各种分析检测技术的特点,整合多种技术和数据库,才能确定磷脂分子的类别、脂肪酸链的碳原子数、不饱和度及双键位置、生物样本中的含量及相关代谢途径。整合色谱分离技术、高分辨质谱技术及核磁共振技术建立新型磷脂检测平台技术最能满足磷脂化合物结构鉴定面临的挑战。

    3.4.1.   数据处理方法

    磷脂组学完全借鉴代谢组学的数据处理方法。对充分挖掘化合物的大量的、多维的信息,进行一系列化学计量学方法计算,从中获取具有生物学意义的潜在信息。首先需要对获得的代谢物的轮廓谱数据进行归一化和滤噪,消除多余的干扰因素,保留与分类有关的信息。正交信号校正技术 (OSC) 是最为广泛应用的滤噪技术之一[79]。生物标志物的发掘是通过对检测到的所有化合物信息进行判别分析,找出对分类贡献最大的一种或若干种变量[80~82]。用于组学研究的聚类算法主要包括:非监督学习方法和监督学习方法。

    非监督的学习方法是以原始图谱或预处理后的图谱数据对样本进行归类,不需任何样本分类的背景信息。这种方法没有训练样本可供学习利用,而是对给定的数据集进行模式判别和相关性分析。主要有主成分分析 (PCA)、K均值聚类、高斯模型等[83~87]。

    监督的学习方法适于分析有先验知识和假设的数据。依据先验知识对未知数据进行辨识、归类、预测。这种方法需要建立测试模型判别性能的测试集和确认类别归属的确认集。代表方法有偏最小二乘法 (PLS)、非线性偏最小二乘法(OPLS)、偏最小二乘判别分析 (PLS-DA)、非线性偏最小二乘判别分析 (OPLS-DA)、人工神经网络 (ANN) 等[85, 88]。

    3.4.2.   数据库

    数据库是组学研究不可或缺的工具。数据库除能够提供生物体中各种代谢物的结构信息外,还应包涵化合物生化信息、疾病相关的代谢差异以及有关的定量数据。磷脂组学需要建立的数据库是关于生物系统中所有磷脂化合物的数据库,为未知磷脂化合物及其代谢物的结构鉴定提供相关信息或可用于已知磷脂分子生物功能的解释。从数据库或基于网络的搜索引擎中获取磷脂化合物的性质、分类、实验技术、代谢途径等相关信息。常用数据库和搜索引擎包括:LIPIDAT (http://www.lipidat.chemistry.ohio-state.edu)、Lipid Map (http://www.lipidmaps.org/)、Cyberlipids (http://www.cyberlipid.org/)、Lipid Library (http://lipidlibrary.aocs.org/)、LIPIDAT (http://www.lipidat.chemistry.ohio-state.edu)、Human Metabolome (HMBD,http://www.hmdb.ca/)、LIPID Bank (www.lipidbank.jp)、KEGG (http://www.kegg.jp/)、LIPIDMonster DB (http://www.lipidmaps.org/tools/)、Lipidhome (http://www.ebi.ac.uk/metabolights/lipidhome/)、代谢途径数据库 (http://pid.nci.nih.gov/)、Pubmed数据资源 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)、代谢途径数据库 (http://pid.nci.nih.gov/)、生物信息学数据库 (ExPASy,http://www.expasy.org/)、LipidSearchTM Software (Thermo scientific)、VaLID[89~91]。已经建立的脂质组学的数据库为磷脂组学研究提供了大量化合物的结构信息、质谱信息和代谢途径信息,为潜在生物标志物的鉴定提供参考[92]。

    4.   结语与展望

    磷脂分析检测技术是磷脂组学研究获取稳定、可靠数据的必要手段,是顺利实施实验方案的重要保障。分析仪器和计算技术的不断革新决定了磷脂检测技术的发展趋势。样本前处理方法的发展趋势:(1) 样品用量少 降低样本用量,特别是宝贵的临床样本的用量。(2) 提取效率高 提高低丰度磷脂化合物的提取效率。(3) 在线提取 实现与LC、MS或NMR等的在线联用,提高方法的简捷程度和自动化程度。磷脂检测技术将向着快速、稳定、重现性好、高灵敏度、高分辨率、高通量的方向发展[66],满足微量和痕量磷脂化合物定性和定量分析要求。通过建立二维或多维色谱和质谱方法实现同类磷脂化合物不同分子的鉴定[63, 93]。完善磷脂组学的数据库建设,使其能够提供尽可能多的磷脂化合物及其代谢物相关的代谢通路信息,及与疾病相关的代谢差异的生物学意义的解释。

    采用单一技术是很难实现磷脂化合物的全面的定性和定量,必须针对生物样本的特性,整合不同检测技术的优势,构建包含提取、分离、检测、数据处理等的定性定量平台技术,结合数据库和相关软件挖掘潜在标志物的各类信息。整合基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等的数据信息,使相关数据库和软件的功能越来越强大,逐渐实现磷脂化合物鉴定和相关代谢途径分析的自动化、网络化、可视化。

    磷脂组学研究是针对磷脂的代谢组学研究模式。随着代谢组学的整合化发展[17],磷脂组学可以借助代谢组学提供的数据分析方法、脂质研究的数据库和相关专家系统。与基因组学、转录组学[94]、蛋白组学、代谢组学等进行多组学整合研究,从基因、蛋白、代谢等多层次研究磷脂化合物,寻找与疾病诊断、预防、治疗相关的潜在生物标志物体系及相关的的代谢途径、代谢规律和代谢网络,为人类健康提供更可靠、更有意义的数据。

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  • Figure 1  Strategy for phospholipidomics

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    Figure 2  Molecular structure of phospholipids. (A) Glycerol phospholipid,(B) Sphingomyelin

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    Table 1.  Method summary on HPLC separation of phospholipids(PLs)

    色谱类型 Type固定相 Solid phase流动相 (缓冲试剂) Mobile phase (buffer reagent)洗脱方式 Elution mode检测器 Detector分离组分 Separated PLs
    NPLCSi甲醇(冰醋酸) Methanol (glacial acetic acid)等度 Isocratic ELSDPC/LPC/PE/PA
    Zorbax Rx-SIL正己烷-异丙醇-水(硫酸铵) Hexane-Isopropanol-H2O (ammonium sulfate)等度 IsocraticUVPE/PG/CL/PI/PS/LPE/PC/LPC
    Hypersil Si正己烷-异丙醇-乙醇(醋酸铵/醋酸) Hexane-Isopropanol-Ethanol (ammonium acetate/acetic acid)等度 IsocraticUVPE/PI/CL/PS/LPS/PC/LPC
    TracerExtrasil SI乙腈-甲醇(磷酸) Acetonitrile-Methanol (phosphoric acid)等度 IsocraticUVPI/PS/PE/PC/SM
    Hypersil Si氯仿-甲醇-水(乙酸铵) CHCl3-Methanol-H2O (ammonium acetate)梯度 GradientMSPG/PI/PE/LPC/LPE/LPG/PC/PS
    Lichropher 100 Diol正己烷-异丙醇(乙酸/氨水) Hexane-Isopropanol (acetic acid/ammonia)梯度 GradientMSPG/CL/PE/PC/PI
    Nucleosil 100-5OH正己烷-异丙醇(甲酸/氨水) Hexane-Isopropanol (formic acid/ammonia)等度 IsocraticMSPE/PG/PI/PS/PC/SM/LPC
    RPLCZORBAX C18甲醇-正己烷(酸胺/甘油) Methanol-Hexane (acid amide/glycerol)等度 IsocraticMSPC/LPC/PE/PA
    P-E C18甲醇-乙腈-水 Methanol-Acetonitrile-H2O等度 IsocraticUVPE/PG/CL/PI/PS/LPE/ PC/LPC
    Sephasil C8乙腈-甲醇(三氟乙酸) Methanol-Acetonitrile (trifluoroacetic acid)等度 IsocraticUVPE/PI/CL/PS/LPS/PC/LPC
    ZORBAX RP乙腈-甲醇(乙酸铵) Methanol-Acetonitrile (ammonium acetate)梯度 GradientMSPI/PS/PE/PC/SM
    Prodigy ODS氯仿-甲醇-乙腈-水 CHCl3-Methanol-Acetonitrile-H2O梯度 GradientELSDPG/PI/PE/LPC/LPE/ LPG/PC/PS
    Ascentis Express C8乙腈-异丙醇-水(甲酸铵) Acetonitrile-Isopropanol-H2O (ammonium formate)梯度 GradientMSPG/CL/PE/PC/PI//LPC/LPE
    HILICNucleosil 100-5OH乙腈-水(甲酸/甲酸铵) Acetonitrile-H2O (formic acid/ammonium formate)梯度 GradientMSPE/PG/PI/PS/PC/SM/LPC
    Spherisorb silica gel乙腈-甲醇(磷酸) Methanol-Acetonitrile (phosphoric acid)梯度 GradientUVPE/PG/PI/PS/PC/SM/LPC
    Ascentis Express HILIC乙腈-水(甲酸铵) Acetonitrile-H2O(ammonium formate)梯度 GradientMSPI/PE/PC/LPC
    BEH HILIC乙腈-水(甲酸/甲酸铵) Acetonitrile-H2O (formic acid/ammonium formate)梯度 GradientMSPC/PE
    Silica based HILIC乙腈-甲醇(乙酸铵) Methanol-Acetonitrile (ammonium acetate)等度 IsocraticMS
    PA: phosphatidic acid; PC: phosphatidylcholine; LPC: lysophosphatidylcholine; PE : phosphatidyl-ethanolamine; LPE: lysophosphatidyl-ethanolamine; PI : phosphatidylinositol; LPI : lysophosphatidylinositol; PS: phosphatidylserine; LPS : lysophosphatidylserine; PG :phosphatidylglycerol; LPG: lysophosphatidylglycerol CL: Cardiolipin; SM: sphingomyelin.
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    Table 2.  Summary on technologies for qualitative and quantitative detection of phospholipids

    检测技术 Detection technology类型 Type定性技术 Qualitation定量技术 Quantitation特点 Evaluation
    光谱 Spectrometry紫外光谱 Ultraviolet (UV) spectroscopy基于色谱分离提供的保留时间 Based on retention of chromatographic separation优秀 Excellent可直接测定,操作简单、线性良好、回收率高、精密度高 Direct measurement,easy to operate good linearity,high recovery and high precision
    傅里叶变换红外光谱 Fourier Transform infrared spectroscopy (FTIR)基于C=O, PO2,P-O-C 振动吸收 Based onvibration absorption of C=O, PO2,P-O-C优秀 Excellent操作简便、分析速度快、准确度高、重复性良好 Rapid,easy to operate,high accuracy,good repeatability
    质谱 Mass spectrometry (MS)离子阱质谱 Ion trap mass spectrometry (ITMS)基于多级质谱碎片信息 Based onMSn fragmentation 中等 Good可提供多级质谱碎片离子信息 MSn fragmentation
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  • 收稿日期:  2015-12-09
  • 修回日期:  2016-02-04
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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