Cu(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)配合物的合成、抗肿瘤作用及其对细胞周期分布的影响

江名 盖爽爽 蓝峻峰 文胜 蒋才云 覃逸明

引用本文: 江名, 盖爽爽, 蓝峻峰, 文胜, 蒋才云, 覃逸明. Cu(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)配合物的合成、抗肿瘤作用及其对细胞周期分布的影响[J]. 化学通报, 2020, 83(3): 253-257. shu
Citation:  Jiang Ming, Gai Shuangshuang, Lan Junfeng, Wen Sheng, Jiang Caiyun, Qin Yiming. Cu (Ⅱ) and Ni (Ⅱ) Complexes: Synthesis, Antitumor Effects and Cell Cycle Arrest[J]. Chemistry, 2020, 83(3): 253-257. shu

Cu(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)配合物的合成、抗肿瘤作用及其对细胞周期分布的影响

    通讯作者: 蒋才云  男, 硕士, 教授, 主要从事药物设计和药物靶点研究, E-mail:jiangcaiyun2013@163.com覃逸明  男, 博士, 教授, 主要从事药物合成和筛选研究, E-mail:qinyiming@163.com
  • 基金项目:

    广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(2019KY0853)资助

摘要: 以2-氨基-5-氯苯酚和2-喹啉甲醛合成的席夫碱作为配体,分别与氯化镍、氯化铜反应合成了2个金属配合物C1C2,其结构通过单晶X-射线衍射进行了解析。采用MTT法测试了配合物C1C2对不同人肝癌细胞系和正常肝细胞系HL-7702增殖抑制活性,结果表明C1C2对人肝癌细胞系的抑制活性均优于顺铂,且对正常肝细胞系HL-7702的毒性要弱于顺铂。通过活性氧实验、细胞周期等实验,可以推断出配合物C1C2抗肿瘤机制是通过产生活性氧造成肿瘤细胞的氧化损伤,以及使细胞周期停滞在G0/G1期阻滞细胞复制。

English

  • 自20世纪70年代顺铂作为抗癌药物的发现和临床应用以来,激发了人们开展其他金属基药物研究[1, 2],然而,顺铂化疗普遍存在耐药性等不良反应,限制了其使用。近年来,很多研究致力于开发新的抗肿瘤活性更好、副作用更小、耐药性更低的金属配合物来代替顺铂治疗,因为它们可以通过不同的机制起作用,例如靶向细胞器,蛋白和DNA错配等[3~5]

    Cu和Ni是多种酶的活性中心,而且是人体必需的微量元素,在人体器官和组织的发育和功能中起着重要的作用[6, 7]。以席夫碱作为金属药物配体具有良好的生物活性[8~10],因此铜、镍金属席夫碱配合物被广泛合成和应用于抗肿瘤研究。

    本文以2-氨基-5-氯苯酚、2-甲醛喹啉为原料合成席夫碱配体,进一步与氯化镍或氯化铜反应生成配合物C1C2(合成路线见图式 1),并研究了配合物的体外抗肿瘤活性,初步探索了配合物的抗肿瘤机制。

    图式 1

    图式 1.  配合物的合成
    Scheme 1.  Synthesis of complexes

    Bruker Smart1000 CCD仪;Perkin-Elmer240Q元素分析仪。2-氨基-5-氯苯酚、2-喹啉甲醛和常用溶剂均购自Sigma公司或西陇化工厂。所有的细胞系均购自上海生命科学研究院。

    将0.5mmol 2-氨基-5-氯苯酚和0.5mmol 2-喹啉甲醛加入20mL甲醇中,搅拌至溶解,加热至70℃回流2h得到席夫碱配体。在紫红色溶液中加入氯化镍或氯化铜的甲醇溶液继续回流2h。反应结束后,将反应液置于常温条件下缓慢挥发直至晶体析出,得到深紫色晶体。C1:产率80.5%;元素分析(%):C32H20Cl2N4NiO3:理论值:C,60.23;H,3.16;N,8.78;O,7.52;实测值:C,60.25;H,3.14;N,8.77;O,7.51。C2:产率82.3%;元素分析(%):C32H20Cl2CuN4O2.5,理论值:C,61.30;H,3.22;N,8.94;O,5.10;实测值:C,61.31;H,3.23;N,8.92;O,5.12。

    将HepG2细胞接种到96孔板中,于37℃、5% CO2的条件下继续培养24h。加入不同浓度的C1C2,以顺铂作为对照组。48h后,加入10μL 5mg/mL的噻唑蓝(MTT)溶液处理4h,轻轻吸去所有液体,加入100μL DMSO后振荡溶解结晶。用酶标仪在570/630 nm双波长检测吸光度并计算IC50值。

    在6孔板中接种105个HepG2细胞,于37℃、5% CO2的条件下培养12h,除去旧的培养基加入相同体积的新培养基后,继续加入化合物C1C2,孵育15h。收集细胞加入100μL PBS,溶液中包含10μmol/L H2DCF-DA(双氯荧光黄乙酸乙酯)探针,37℃下孵育30min,用流式细胞仪检测样品。

    将HepG2细胞接种到60mm的培养皿中孵育过夜,更换新的培养基后分别添加化合物C1C2,浓度为10μmol/L,对照组不做任何处理。继续培养24h后,收集细胞并用10mL 70%的冰乙醇于4℃固定过夜。离心除去乙醇,收集细胞,并用PBS洗涤2~3次,离心收集细胞并加入500μL染色工作液(20mg/mL碘化丙啶(PI)和50mg/mL RNase A),轻轻吹打使细胞悬浮,室温条件下避光孵育15min后上样检测。

    将HepG2细胞接种到10cm的培养皿中孵育24h,加入C1C2作用24h。收集并用PBS洗涤3次。加入细胞裂解液(RIPA)使蛋白质释放出来,利用BCA试剂盒对蛋白进行定量。以10%的SDS-聚丙烯凝胶电泳分离各蛋白,切取所需片段,转移到硝化纤维薄膜上。利用脱脂牛奶封闭1h,加入一抗置于4℃孵育过夜,TBST缓冲液洗涤3次,再用二抗处理1h。应用Amersham ECL Plus试剂检测免疫反应。

    由X-射线单晶衍射仪对化合物晶体进行衍射得到衍射数据,晶体结构在OLEX2软件中应用XS项目中的Patterson法解出,并对所有非氢原子的各向异性温度因子进行修正,氢原子则通过理论计算加入[11]。结果显示,2个化合物均属于空间群为P21/n的单斜系,晶体学参数如表 1所示,部分键长键角如表 2所示。化合物的结构和晶胞堆积图(图 1)显示,C1C2的分子结构均是由2个配体和1个中心金属离子组成,由于其二者结构类似,所以只对C1进行结构描述。

    表 1

    表 1  配合物的晶体数据
    Table 1.  Crystal data of complexes
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    Compound C1 C2
    Empirical formula C32H20Cl2N4NiO3 C32H20Cl2CuN4O2.5
    Formula weight 638.12 630.13
    Crystal system monoclinic monoclinic
    Space group P21/n P21/n
    a 14.8676(4) 14.9256(7)
    b 12.3646(4) 12.3941(4)
    c 16.7930(7) 16.8958(8)
    α 90.00 90.00
    β/° 103.368(4) 103.787(5)
    γ 90.00 90.00
    Volume/Å3 3003.45(18) 3035.5(2)
    F(000) 1304.0 1288.0
    Radiation MoKα (λ=0.71073) MoKα (λ=0.71073)
    Goodness-of-fit on F2 1.069 1.056
    Final R indexes [I > =2σ (I)] R1=0.0522, wR2=0.1554 R1=0.0680, wR2 =0.2042
    Final R indexes [all data] R1=0.0690, wR2=0.1690 R1=0.1039, wR2=0.2358
    2θ range for data collection/° 5.98 to 50 5.96 to 52.74
    Data/restraints/parameters 5284/0/379 6201/0/379
    Largest diff. peak/hole / e·Å-3 1.37/-0.53 1.08/-0.37

    表 2

    表 2  部分键长(Å)和键角(°)数据
    Table 2.  Selected bond lengths (Å) and angles (°)
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    C1 Length/ Angle C2 Length/Angle
    Ni1-O1 2.088(3) Cu1-O1 2.071(3)
    Ni1-O2 2.052(2) Cu1-O2 2.047(3)
    Ni1-N1 2.011(3) Cu1-N1 2.067(4)
    Ni1-N2 2.209(3) Cu1-N2 2.212(4)
    Ni1-N3 2.014(3) Cu1-N3 2.229(4)
    Ni1-N4 2.177(3) Cu1-N4 2.063(4)
    O1-Ni1-N2 156.33(11) O1-Cu1-N2 90.83(15)
    O1-Ni1-N4 91.31(12) O1-Cu1-N3 150.92(14)
    O2-Ni1-O1 95.63(11) O2-Cu1-O1 103.43(15)
    O2-Ni1-N2 90.73(11) O2-Cu1-N1 78.92(13)
    O2-Ni1-N4 157.61(11) O2-Cu1-N2 151.75(14)
    N1-Ni1-O1 79.65(11) O2-Cu1-N3 89.75(14)
    N1-Ni1-O2 91.34(11) O2-Cu1-N4 92.92(13)
    N1-Ni1-N2 77.42(12) N1-Cu1-O1 96.25(14)
    N1-Ni1-N3 170.17(12) N1-Cu1-N2 75.34(15)
    N1-Ni1-N4 110.87(12) N1-Cu1-N3 111.82(15)
    N3-Ni1-O1 95.75(11) N2-Cu1-N3 89.16(15)
    N3-Ni1-O2 80.40(11) N4-Cu1-O1 78.32(14)
    N3-Ni1-N2 107.80(12) N4-Cu1-N1 168.99(16)
    N3-Ni1-N4 77.73(12) N4-Cu1-N2 114.01(14)
    N4-Ni1-N2 91.39(12) N4-Cu1-N3 75.18(15)

    图 1

    图 1.  (A) C1的晶体结构图;(B)C2的晶体结构图;(C)C1晶胞堆积图;(D)C2晶胞堆积图
    Figure 1.  (A) Crystal structure of C1; (B) Crystal structure of C2; (C) packing diagram of C1; (D) packing diagram of C2

    C1的化学式为C32H20Cl2N4NiO3,其主体结构主要包含2个席夫碱配体和1个镍离子。其中镍离子处于六配位的配位环境中,Ni1-O1、Ni1-O2、Ni1-N、Ni1-N2、Ni1-N3、Ni1-N4的键长分别为2.088(3)、2.052(2)、12.011(3)、2.209(3)、2.014(3)和2.177(3) Å,形成了略微扭曲的八面体构型。

    采用MTT法测试化合物对3种肝癌细胞株HepG2、BEL-7404、BEL-7402以及人正常肝细胞株HL-7702的细胞毒性。结果如表 3所示,C1C2与顺铂相比对癌细胞的活性更好,但对正常细胞的毒性更弱,且铜配合物比镍配合物抗肿瘤活力更强。

    表 3

    表 3  化合物对不同种的肝癌细胞IC50
    Table 3.  IC50 values of complexes to different liver cell lines for 48 h
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    Complex IC50(μmol/L)
    HepG2 BEL-7402 BEL-7404 HL-7702
    L > 50 > 50 > 50 > 50
    Cu2+ > 50 > 50 > 50 > 50
    Ni2+ > 50 > 50 > 50 > 50
    C1 10.05±0.11 16.84±0.21 17.32±0.31 23.14±0.23
    C2 8.64±0.35 12.12±0.19 10.77±0.41 20.8±0.28
    顺铂 14.63±0.42 16.97±0.13 18.37±0.24 9.67±0.29

    过量的活性氧会对溶酶体膜产生重要的影响,会引起膜脂质过氧化损伤,并导致溶酶体渗透性不受控制,最终促使细胞的凋亡[12]。如图 2所示,与对照相比,峰值均向右偏移,说明C1C2均能促使HepG2细胞内产生大量的活性氧(ROS),表明2种化合物均可诱导氧化损伤促进细胞凋亡。MTT试验显示C2的活性要优于C1,与ROS的试验结果趋势一样,C2相比C1能更加显著地提高细胞内ROS水平。C1C2的结构类似,配体相同,仅中心离子不同。在HepG2细胞内C2产生ROS量大于C1,可能是由于Cu2+比Ni2+氧化性更强,进入细胞后更易被还原产生ROS。

    图 2

    图 2.  (A) C1(10μmol/L)和C2(10μmol/L)处理HepG2细胞对ROS水平的影响;(B)细胞内DCF氧化增加的细胞百分比
    Figure 2.  (A) Effect of ROS levels of HepG2 treated with C1 (10 μmol/L) and C2 (10 μmol/L); (B) showing the percentage of cells with increased intracellular DCF oxidation

    利用PI染色和流式细胞仪检测化合物对细胞周期的影响,结果见图 3。2种化合物均能增大细胞周期G0/G1期的百分比,分别从42.10%增大到47.97%(C1)和49.11%(C2)。Western blot试验与流式细胞仪分析的数据非常吻合,C1C2会影响G0/G1期相关的蛋白质的表达进而使细胞周期停滞。

    图 3

    图 3.  (A) C1 (10μmol/L)、C2 (10μmol/L)处理HepG2细胞对细胞周期的影响;(B)Western blot分析CDK2和Cyclin E蛋白的表达;(C) CDK2和Cyclin E蛋白表达水平百分比
    Figure 3.  (A) Effect of cell cycle of HepG2 treated with C1 (10 μmol/L) and C2 (10 μmol/L); (B) Western blot analysis of CDK2 and Cyclin E in HepG2 cells treated with C1 (10 μmol/L) and C2 (10 μmol/L); (C) Percentage expression levels of CDK2 and Cyclin E

    以2-氨基-5-氯苯酚和2-喹啉甲醛合成的席夫碱作为配体合成了2种金属配合物C1C2,2种配合物具有相似的结构,1个金属离子与2个配体结合,中心金属离子都分别与配体中N、O原子形成了六配位的结构。C1C2均对不同种类的肝癌细胞株具有较强的抑制作用,C2的活性优于C1,2种配合物的抗肿瘤活力均优于顺铂,且对正常细胞株HL-7702的毒性要弱于顺铂。C1C2潜在的抗肿瘤机制可能是通过金属配合物在细胞内产生活性氧造成细胞的氧化损伤,并使细胞周期停滞在G0/G1期。本文的结果可为新型金属基抗肿瘤药物的研究提供一定理论依据与参考。


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  • 图式 1  配合物的合成

    Scheme 1  Synthesis of complexes

    图 1  (A) C1的晶体结构图;(B)C2的晶体结构图;(C)C1晶胞堆积图;(D)C2晶胞堆积图

    Figure 1  (A) Crystal structure of C1; (B) Crystal structure of C2; (C) packing diagram of C1; (D) packing diagram of C2

    图 2  (A) C1(10μmol/L)和C2(10μmol/L)处理HepG2细胞对ROS水平的影响;(B)细胞内DCF氧化增加的细胞百分比

    Figure 2  (A) Effect of ROS levels of HepG2 treated with C1 (10 μmol/L) and C2 (10 μmol/L); (B) showing the percentage of cells with increased intracellular DCF oxidation

    图 3  (A) C1 (10μmol/L)、C2 (10μmol/L)处理HepG2细胞对细胞周期的影响;(B)Western blot分析CDK2和Cyclin E蛋白的表达;(C) CDK2和Cyclin E蛋白表达水平百分比

    Figure 3  (A) Effect of cell cycle of HepG2 treated with C1 (10 μmol/L) and C2 (10 μmol/L); (B) Western blot analysis of CDK2 and Cyclin E in HepG2 cells treated with C1 (10 μmol/L) and C2 (10 μmol/L); (C) Percentage expression levels of CDK2 and Cyclin E

    表 1  配合物的晶体数据

    Table 1.  Crystal data of complexes

    Compound C1 C2
    Empirical formula C32H20Cl2N4NiO3 C32H20Cl2CuN4O2.5
    Formula weight 638.12 630.13
    Crystal system monoclinic monoclinic
    Space group P21/n P21/n
    a 14.8676(4) 14.9256(7)
    b 12.3646(4) 12.3941(4)
    c 16.7930(7) 16.8958(8)
    α 90.00 90.00
    β/° 103.368(4) 103.787(5)
    γ 90.00 90.00
    Volume/Å3 3003.45(18) 3035.5(2)
    F(000) 1304.0 1288.0
    Radiation MoKα (λ=0.71073) MoKα (λ=0.71073)
    Goodness-of-fit on F2 1.069 1.056
    Final R indexes [I > =2σ (I)] R1=0.0522, wR2=0.1554 R1=0.0680, wR2 =0.2042
    Final R indexes [all data] R1=0.0690, wR2=0.1690 R1=0.1039, wR2=0.2358
    2θ range for data collection/° 5.98 to 50 5.96 to 52.74
    Data/restraints/parameters 5284/0/379 6201/0/379
    Largest diff. peak/hole / e·Å-3 1.37/-0.53 1.08/-0.37
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    表 2  部分键长(Å)和键角(°)数据

    Table 2.  Selected bond lengths (Å) and angles (°)

    C1 Length/ Angle C2 Length/Angle
    Ni1-O1 2.088(3) Cu1-O1 2.071(3)
    Ni1-O2 2.052(2) Cu1-O2 2.047(3)
    Ni1-N1 2.011(3) Cu1-N1 2.067(4)
    Ni1-N2 2.209(3) Cu1-N2 2.212(4)
    Ni1-N3 2.014(3) Cu1-N3 2.229(4)
    Ni1-N4 2.177(3) Cu1-N4 2.063(4)
    O1-Ni1-N2 156.33(11) O1-Cu1-N2 90.83(15)
    O1-Ni1-N4 91.31(12) O1-Cu1-N3 150.92(14)
    O2-Ni1-O1 95.63(11) O2-Cu1-O1 103.43(15)
    O2-Ni1-N2 90.73(11) O2-Cu1-N1 78.92(13)
    O2-Ni1-N4 157.61(11) O2-Cu1-N2 151.75(14)
    N1-Ni1-O1 79.65(11) O2-Cu1-N3 89.75(14)
    N1-Ni1-O2 91.34(11) O2-Cu1-N4 92.92(13)
    N1-Ni1-N2 77.42(12) N1-Cu1-O1 96.25(14)
    N1-Ni1-N3 170.17(12) N1-Cu1-N2 75.34(15)
    N1-Ni1-N4 110.87(12) N1-Cu1-N3 111.82(15)
    N3-Ni1-O1 95.75(11) N2-Cu1-N3 89.16(15)
    N3-Ni1-O2 80.40(11) N4-Cu1-O1 78.32(14)
    N3-Ni1-N2 107.80(12) N4-Cu1-N1 168.99(16)
    N3-Ni1-N4 77.73(12) N4-Cu1-N2 114.01(14)
    N4-Ni1-N2 91.39(12) N4-Cu1-N3 75.18(15)
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    表 3  化合物对不同种的肝癌细胞IC50

    Table 3.  IC50 values of complexes to different liver cell lines for 48 h

    Complex IC50(μmol/L)
    HepG2 BEL-7402 BEL-7404 HL-7702
    L > 50 > 50 > 50 > 50
    Cu2+ > 50 > 50 > 50 > 50
    Ni2+ > 50 > 50 > 50 > 50
    C1 10.05±0.11 16.84±0.21 17.32±0.31 23.14±0.23
    C2 8.64±0.35 12.12±0.19 10.77±0.41 20.8±0.28
    顺铂 14.63±0.42 16.97±0.13 18.37±0.24 9.67±0.29
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  • 发布日期:  2020-03-01
  • 收稿日期:  2019-11-20
  • 接受日期:  2019-12-20
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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