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• 酶是自然界重要的生命活性物质，其结构和性质容易受到外部环境的影响，保持及提高酶的活性是当今研究的热点之一^[1]。胃蛋白酶(Pepsin)是从脊椎动物的胃粘膜分离提取得到的，是由胃液中的前体物质—胃蛋白酶原在pH为2.0左右条件下，N段约25个氨基酸残基从肽链上水解下来被激活而成^{[2, 3]}，是胃液中主要的蛋白水解消化酶^[4]。在医学上，胃蛋白酶原以及胃蛋白酶在消化道疾病中具有很重要的生理功能，人的胃蛋白酶原含量以及胃蛋白酶活性的大小与人的消化道疾病有直接的联系^[5]。此外，胃蛋白酶广泛应用于食品、奶制品、消化药等加工制造^{[6, 7]}。

  Al-Hakeim等^[8]研究发现，在37℃条件下，使用二氧化硅纳米粒子和高浓度NaCl溶液可以显著抑制胃蛋白酶活性，固定化后的胃蛋白酶活性从4.82U降低到2.90U。Suliburska等^[9]研究了心血管和抗糖尿病药物对体外胃蛋白酶活性的影响，结果表明，血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)抑制剂引起胃蛋白酶活性的显著降低，而Indapen(一种利尿剂)和Glucophage(一种抗糖尿病药物)提高了胃蛋白酶的活性，说明这些药物能够影响正在接受治疗的患者的消化过程。

  两性离子化合物具有优异的生物相容性，其分子链中含有正负电荷总数相等的阴离子基团和阳离子基团，带电端官能团的溶剂化作用和氢键作用形成水合层，这种水合层表面可有效阻挡非特异性蛋白吸附，有利于维持蛋白质的天然构象^[10~13]。两性离子化合物主要有磷酰胆碱型(PC)、磺基甜菜碱型(SB)、羧基甜菜碱型(CB)等类型，其代表性两性离子化合物分别有甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)、甲基丙烯酸磺酸基甜菜碱酯(SBMA)、甲基丙烯酸羧基甜菜碱酯(CBMA)^[14~16]。其结构式如图式 1所示。

  图式 1

  

  图式 1.  两性离子化合物MPC、SBMA、CBMA的结构式

  Scheme 1.  Structures of Zwitterionic compounds MPC, SBMA, CBMA

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  本文研究了三种不同两性离子化合物MPC、SBMA、CBMA对胃蛋白酶活性的影响，并进一步探究在高温下CBMA对胃蛋白酶活性的影响。

  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(南京乐天然科技开发研究所)；甲基丙烯酸磺酸基甜菜碱酯(阿拉丁试剂)；胃蛋白酶(Biofroxx试剂)；牛血红蛋白(Biosharp试剂)；福林酚(合肥博美生物科技有限责任公司)；甲基丙烯酸二甲氨乙酯(DMAEM，99%)、丙酮(分析纯)、乙醚(分析纯)、β-丙内酯(98.5%)均为市售化学试剂。

  Bruker 400 ULTRA SHIELD (400MHz)核磁共振谱仪(布鲁克公司)；紫外可见分光光度计(L5上海仪电分析仪器有限公司)。

  1.2   甲基丙烯酸羧基甜菜碱酯的制备与表征

  参考文献报道的方法^[12]合成CBMA，将1.57g (10mmol)DMAEM溶于50mL无水丙酮中，逐滴加入0.87g(12mmol) β-丙内酯的无水丙酮溶液，氮气保护下15℃反应8h，可观察到有白色沉淀生成。将所得白色沉淀用50mL无水丙酮和100mL无水乙醚分别洗涤3次，得到甲基丙烯酸羧基甜菜碱酯(CBMA)，真空干燥箱中干燥后，置于2~8℃下的干燥环境中保存。CBMA合成路线见图式 1。

  图式 2

  

  图式 2.  CBMA的合成路线

  Scheme 2.  Synthesis route of CBMA

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  采用¹H NMR对CBMA进行结构表征。

  1.3   两性离子化合物对胃蛋白酶活性的影响研究

  1.3.1   L-酪氨酸标准曲线的绘制^{[17, 18]}

  配制100mg/L的酪氨酸标准溶液。准确移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL酪氨酸溶液于10mL离心管中，定容至1mL，加入5mL NaOH溶液(0.4mol/L)，混合均匀后加入1mL福林酚试剂(福林酚与水体积比1:2配制)。在660nm处测定吸光度，得到标准曲线A=0.0097x+0.0533，R²=0.993。其中A为测得的吸光度值，x为酪氨酸含量(μg/mL)。

  1.3.2   胃蛋白酶活性的测定

  采用福林法测定胃蛋白酶酶活力^{[17, 18]}。取1mL胃蛋白酶溶液(pH=2缓冲溶液配制，0.0001g/mL)37℃下活化10min，活化后的酶液加入1mL不同摩尔浓度(pH=2缓冲溶液配制，0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18mmol/mL)的两性离子化合物(MPC、SBMA、CBMA)溶液，加入1mL牛血红蛋白溶液(0.005g/mL)，37℃下反应10min，加入2mL三氯乙酸溶液(0.4mol/L)终止反应。取1mL上层清液，加入5mL NaOH溶液(0.4mol/L)，混合均匀后加入1mL福林酚试剂(福林酚与水体积比1:2配制)。在660nm处测定吸光度。

  胃蛋白酶酶活力计算公式：

  $ 酶活力X = A \times K \times N \times 5/10 $

  (1)

  其中，X为胃蛋白酶酶活力(U/mL)，A为吸光度值，K为吸光常数(根据回归方程计算出吸光度为1时的酪氨酸的量，K=97.6)，N为胃蛋白酶稀释倍数(0.0001g/mL，稀释倍数为10000)，5为胃蛋白酶酶活力测定总量(1mL胃蛋白酶液，1mL两性离子化合物溶液，1mL底物溶液，2mL三氯乙酸溶液)；10为反应时间(min)。

  取多组1mL胃蛋白酶溶液与1mL CBMA溶液(0.18mmol/mL)混合，分别在37和60 ℃下培养，每隔2h取样，重复以上实验。

  2.   结果与讨论

  2.1   甲基丙烯酸羧基甜菜碱酯(CBMA)的结构表征

  采用¹H NMR对CBMA的结构进行了表征，结果见图 1。CBMA单体的¹H NMR(400MHz，D₂O)数据如下：δ 6.07(s，1H，=CH)，5.69(s，1H，=CH)，4.55(t，2H，OCH₂)，3.70(t，2H，CH₂N)，3.59(t，2H，NCH₂)，3.10(s，6H，NCH₃)，2.64(t，2H，CH₂COO)，1.85(s，3H，=CCH₃)，与文献报道^[12]的数据相吻合。

  图 1

  

  图 1.  CBMA的核磁氢谱图

  Figure 1.  ¹H NMR of CBMA in D₂O

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  2.2   MPC、SBMA、CBMA的添加量对胃蛋白酶活性的影响

  向胃蛋白酶溶液中加入不同摩尔浓度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18 mmol/mL)的MPC、SBMA、CBMA溶液，按照1.3.2中的方法测定胃蛋白酶活性，结果如图 2所示。

  图 2

  

  图 2.  37℃下MPC、SBMA、CBMA的添加量对胃蛋白酶活性的影响

  Figure 2.  Effect of MPC、SBMA and CBMA addition on pepsin activity at 37℃

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  由图 2可以看出，添加相同摩尔量的MPC、SBMA、CBMA溶液，CBMA对胃蛋白酶活性维持有较好的效果，并随着浓度的增加，对胃蛋白酶活性的维持效果越好。在添加量为0.18mmol/mL时，添加CBMA的胃蛋白酶活性分别是添加MPC、SBMA的胃蛋白酶活性的153%和210%。

  2.2   在不同的温度下CBMA对胃蛋白酶活性的影响

  胃蛋白酶的生物活性在37℃以上随着环境温度的升高而下降。本文分别测定37和60 ℃下添加CBMA(0.18mmol/mL)与未添加CBMA的胃蛋白酶活性，研究CBMA对胃蛋白酶活性的影响，结果见图 3。37℃条件下，经过2h，添加CBMA的胃蛋白酶活性是未添加CBMA的胃蛋白酶活性的194%，4h后是未添加CBMA的胃蛋白酶活性的179%，6h后是未添加CBMA的胃蛋白酶活性的162%。

  图 3

  

  图 3.  在37及60℃下添加与未添加CBMA的胃蛋白酶活性对比图

  Figure 3.  Comparison of pepsin activity with and without CBMA at 37℃ and 60℃

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  60℃条件下，2h后，添加CBMA的胃蛋白酶活性是未添加CBMA的胃蛋白酶活性的453%，4h后是未添加CBMA的胃蛋白酶活性的451%，6h后是未添加CBMA的胃蛋白酶活性的330%。以上结果表明，CBMA对维持胃蛋白酶活性有良好的效果。

  3.   结论

  本文研究了3种两性离子化合物(MPC、SBMA、CBMA)对胃蛋白酶活性的影响，结果表明，在添加量为0.18mmol/mL时，添加CBMA的胃蛋白酶活性分别是添加MPC、SBMA的胃蛋白酶活性的153%和210%。60℃条件下，经过2h，添加CBMA的胃蛋白酶活性是未添加CBMA的胃蛋白酶活性的453%，6h后仍是未添加CBMA的胃蛋白酶活性的330%。CBMA能够有效提高胃蛋白酶的活性。

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  图式 1  两性离子化合物MPC、SBMA、CBMA的结构式

  Scheme 1  Structures of Zwitterionic compounds MPC, SBMA, CBMA

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  图式 2  CBMA的合成路线

  Scheme 2  Synthesis route of CBMA

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  图 1  CBMA的核磁氢谱图

  Figure 1  ¹H NMR of CBMA in D₂O

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  图 2  37℃下MPC、SBMA、CBMA的添加量对胃蛋白酶活性的影响

  Figure 2  Effect of MPC、SBMA and CBMA addition on pepsin activity at 37℃

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  图 3  在37及60℃下添加与未添加CBMA的胃蛋白酶活性对比图

  Figure 3  Comparison of pepsin activity with and without CBMA at 37℃ and 60℃

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