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• II型聚酮类化合物是一类重要的天然产物, 该家族化合物结构多种多样^[1a-1b]. II型聚酮化合物的生物合成已经得到了广泛的研究, 结构多样性主要来源于它们不同的后修饰途径^[2a-2c].我们^[3]在金色链霉菌SP-371 (S. aureus suzhoueusis SP-371)的基因组中发现了一个新型II型聚酮化合物的生物合成基因簇tjh, 通过过表达正调控基因的方法激活了tjh, 成功得到了8个新化合物, 它们包含有两种不同的骨架结构(线性四环结构和五元稠环结构).根据单基因敲除实验的结果, 推测这两类不同结构的化合物可能是通过同一中间体经过分叉的生物合成途径得到的.为了得到这一共同中间体, 我们进行了双基因敲除实验, 在tjhC5和tjhD5的双敲除突变株中分离到了一个螺-萘醌结构化合物aureuspiro, 其结构新颖, 并且对最终产物生物合成途径的阐释有一定借鉴意义.

  1.   结果与讨论

  1.1   ΔtjhC5/ΔtjhD5双敲除突变株的构建

  在单基因敲除实验中, 不仅证明了最终的两类化合物是从共同中间体经由两种不同的后修饰途径得到的, 还成功确定了与各自后修饰途径相关的基因.我们发现tjhC5, tjhD2, tjhD4和tjhO5只参与了线性四环结构化合物的后修饰, tjhO4, tjhD3, tjhD5和tjhD1的敲除只对五元稠环结构化合物的产生有影响(Scheme 1).根据生物信息学分析, 发现四环素生物合成中前体合成相关蛋白与tjh编码的一系列蛋白同源性较高, 所以推测共同中间体1可能与四环素前体类似^[4].在单敲除突变株的发酵提取物中无法检测到共同中间体, 所以我们希望通过双基因敲除实验来同时阻断两种后修饰途径从而积累共同中间体.

  图式 1

  

  图式 1.  两种骨架结构化合物的后修饰途径

  Scheme 1.  Post-modified pathways of two skeleton structures

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  我们成功在突变株ΔtjhC5的基础上同框敲除了tjhD5.过表达基因簇中SARP家族正调控基因tjhR1后的突变株tjhC5/D5::2R成功中断了五元稠环和线性四环骨架化合物的产生(图 1).然而并未在双敲除突变株的发酵提取物中检测到目标中间体, 但其可以产生一个分子量为302的化合物.

  图 1

  

  图 1.  (A) 突变株的构建、(B)突变株的PCR验证图和(C) ΔtjhC5::2R, ΔtjhD5::2R和ΔtjhC5/D5::2R发酵粗提物HPLC图

  Figure 1.  (A) Construction of the mutant strain, (B) PCR verification of the mutant strain and (C) HPLC analysis of fermentation extractions of ΔtjhC5::2R, ΔtjhD5::2R and ΔtjhC5/D5::2R

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  1.2   突变株中化合物aureuspiro的分离及鉴定

  对突变株ΔtjhC5/D5::2R进行大量发酵, 用乙酸乙酯对其发酵液进行萃取, 得到突变株的发酵提取物.最终通过C18反向柱层析和半制备的方法成功分离得到了化合物aureuspiro.该化合物为黄色固体, 紫外光谱于202, 228和348 nm有较强吸收, 高分辨质谱(HR-ESIMS)给出其准分子离子峰m/z 301.1079 [M－ H]^－, 其分子式为C₁₇H₁₈O₅(计算值301.1081 [M－H]^－).

  通过核磁共振波谱成功解析了其化学结构. Aureuspiro的¹H NMR谱中存在一个甲基氢信号(δ_H 2.19)和三个芳基氢信号(δ_H 7.23, 7.70, 7.53). ¹³C NMR谱和DEPT谱图显示有17个碳信号, 其中包含三个酮羰基碳特征信号(δ_C 198.1, 203.1, 210.0)、一个连有酚羟基的碳信号(δ_C 160.5)和四个仲碳信号(δ_C 27.2, 28.7, 32.5, 50.3)(表 1).通过HSQC谱将碳信号与相关氢信号联系起来. ¹H-¹H COSY谱显示芳香氢H-3和H-2、H-4都有相关信号, 说明该苯环结构与野生型中分离得到的化合物结构相同; H-8与H-9、H-9与H-10、H-10与H-11、H-11与H-12分别有氢氢相关信号, 说明对应的四个碳连在一起. HMBC谱中, H-13与C-6、C-15、C-8都有相关信号, 说明C-13可能与C-14相邻; H-9、H-11、H-13都与C-7 (δ_C 47.9)有相关信号, 所以结构中可能有以C-7为中心的螺环结构. H-10与H-9和H-11偶合常数均小于5 Hz, 且H-12与H-11偶合常数为12.0 Hz, 所以C-12位取代的甲酰基和C-10位的羟基应处于不同的面(图 2).

  表 1

  

  表 1  Aureuspiro的核磁共振图谱数据(500/125 MHz, CH₃OH-d₄)

  Table 1.  NMR spectroscopic data of aureuspiro (500/125 MHz, CH₃OH-d₄)

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  Position	δC	δH	HMBC (H→C)	1H-1H COSY
  1	160.5
  2	122.6	7.23 (d, J＝8.0 Hz, 1H)	4, 15	3
  3	136.7	7.70 (t, J＝8.0 Hz, 1H)	1, 5	2, 4
  4	118.5	7.53 (d, J＝8.0 Hz, 1H)	2, 6, 15	3
  5	134.2
  6	198.1
  7	47.9
  8	28.7	1.95~2.02 (m, 1H) 1.72~1.77 (m, 1H)	6, 10, 13	9
  9	27.2	1.44~1.50 (m, 1H) 1.56~1.61 (m, 1H)	7, 8, 11	8, 10
  10	64.3	4.13~4.18 (m, 1H)	8, 12	9, 11
  11	32.5	2.48~2.55 (m, 1H) 2.22~2.47 (m, 1H)	7, 9	10, 12
  12		2.95 (dd, J＝4.7, 12.0 Hz, 1H)	6, 8, 10	11
  13	50.3	3.60 (d, J＝16.7 Hz, 1H) 2.63 (d, J＝16.8 Hz, 1H)	6, 8, 12, 15
  14	203.1
  15	116.7
  16	210.0
  17	27.1	2.19 (s, 3H)	12, 16

  图 2

  

  图 2.  aureuspiro (6)化学结构

  Figure 2.  Chemical structure of aureuspiro (6)

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  1.3   化合物aureuspiro生物合成途径的推测

  该化合物可能是共同中间体中D环先被TjhO4氧化开环, 再经过自发的逆Diels-Alder反应和Michael addition反应, 之后可能由TjhD3或者TjhD1对双键和羰基进行了还原, 最终形成了化合物aureuspiro (Scheme 2). Aureuspiro中A, B环结构与推测的共同中间体相同, 但C和D环可能由其它后修饰酶的催化和自发反应进行了断裂和重排.该结构进一步证明了分叉型生物合成途径中共同中间体的结构可能与我们推测的一致.

  图式 2

  

  图式 2.  推测的aureuspiro形成机制

  Scheme 2.  Proposed mechanism of the formation of aureuspiro

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  2.   结论

  通过双基因敲除实验, 成功获得了突变株ΔtjhC5/ D5::2R, 在其发酵提取物中检测到了一个分子量为302的新化合物, 将其命名为aureuspiro. 经过分离纯化和鉴定, 发现该化合物有一个新颖的螺-萘醌结构, 这是一个新的II型聚酮类天然产物.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  PCR扩增仪Eppendorf Mastercycler, 凝胶成像系统BioRad Syngene, 质谱仪Thermo Scientific LCQ Fleet Ion Trap, 高效液相色谱仪Dionex Ultimate 3000, 高分辨质谱仪Agilent Technologies 6230 TOF LC/MS, 核磁共振仪Bruker AVANCE DRX-500, 分析色谱柱Grace AlltimaTM, 5 μmol•L^-1, C18柱, 4.6 mm×250 mm, 半制备柱YMC-Pack ODS-AQ, 5 μm, C18柱, 10 mm×250 mm.生物试剂购自New England Biolab、Thermo和Takara公司, 引物合成和DNA测序由苏州金唯智公司完成, 国产化学试剂购自上海国药集团有限公司, 百灵威和深圳爱拓化学有限公司, 进口化学试剂购自Sigma- Aldrich公司和TCI公司, 氘代试剂购自Cambridge Isotope Laboratories.链霉菌S. aureus suzhoueusis SP-371由华东理工大学的陶黎明教授提供.

  3.2   双敲除突变株的构建

  以pKC1139为载体构建含左右臂的同框敲除质粒pNQY-1, 左臂引物为tjhD5-L-f: TATAAGCTTCACAC- AGGTGACGTACTTC和tjhD5-L-r: TATTCTAGATCGT- TGCGGTACGACACC, 右臂引物为tjhD5-R-f: TATTCT- AGAGATGCTCAAGGGTCTGC和tjhD5-R-r: TATGA- ATTCCATGACGTTCTCCATCAGC.同框敲除质粒经过接合转移导入ΔtjhC5突变株中, 经过筛选得到最终双敲除突变株, 具体操作详见文献[3].通过PCR验证突变株的基因型, 验证引物为tjhD5-yz-f: CATCGCAACGATCAAGGAATTC和tjhD5-yz-r: GCCTGCGAGCAC- AGGAACAG, 目标条带大小为329 bp.

  3.3   突变株的发酵

  挑取接合子于2~3 mL胰酪胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth, TSB)培养基中, 于30 ℃, 220 r/min培养2~3 d.小量发酵, 直接将试管中的2 mL菌体接到SP-371发酵培养基中即可.大量发酵需将1 mL种子液接到装有100 mL TSB培养基的500 mL摇瓶中, 30 ℃, 220 r/min培养1 d, 将5%发酵培养基体积的种子液接种到发酵培养基中培养, 培养约5~7 d.离心后, 发酵上清液用乙酸乙酯萃取两次, 合并乙酸乙酯, 旋干, 同时收集菌体, 用丙酮浸泡1 h, 滤去固体, 旋蒸除去丙酮, 剩余水相用乙酸乙酯萃取多次, 与上清萃取液合并, 旋干备用.

  3.4   化合物的检测、分离及鉴定

  将发酵提取物用甲醇溶解, 用LC-MS进行分析, 程序为(40 min): T＝0 min, 60% A, 40% B; T＝2 min, 60% A, 40% B; T＝35 min, 25% A, 75% B; T＝36 min, 10% A, 90% B; T＝38 min, 60% A, 40% B; T＝40 min, 40% B, HPLC流速为1 mL/min.其中A相为含体积分数为1‰ HCOOH的H₂O, B相为含体积分数为1‰ HCOOH的CH₃OH, 使用254和272 nm波长检测.发酵粗提物用C18反向柱层析进行初步的纯化, 再用半制备进行二次纯化.半制备分离条件: H₂O和CH₃OH分别作为半制备的A和B相, 用体积分数为40% CH₃OH等比例洗脱, 流速为3 mL/min.最终我们从8 L的发酵液中分离得到了约10 mg aureuspiro. Aureuspiro:红色固体, m.p. 229~267 ℃; [α]30 D 29.3 (c 0.1, MeOH); HR-ESIMS calcd for C₁₇H₁₇O₅ [M－H]^－ 301.1081, found 301.1079.

  辅助材料(Supporting Information)  化合物aureuspiro的紫外吸收光谱、HR-ESIMS和NMR图谱.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  致谢: 感谢华东理工大学的陶黎明教授提供S. aureus suzhoueusis SP-371菌株. Dedicated to Professor Henry N. C. Wong on the occasion of his 70th birthday.
  
• 1. [1]

     (a) David, J. N.; Gordon, M. C. J. Nat. Prod. 2020, 83, 770.
     (b) Das, A.; Khosla, C. Acc. Chem. Res. 2009, 42, 631.

  2. [2]

     (a) Malpartida, F.; Hopwood, D. A. Nature 1984, 309, 462.
     (b) Hertweck, C. Angew. Chem., Int. Ed. 2009, 48, 4688.
     (c) Hertweck, C.; Luzhetskyy, A.; Rebets, Y.; Bechthold, A. Nat. Prod. Rep. 2007, 24, 162.

  3. [3]

     Ji, Z.-Y.; Nie, Q.-Y.; Yin, Y.; Zhang, M.; Pan, H.-X.; Hou, X.-F.; Tang, G.-L. Angew. Chem., Int. Ed. 2019, 58, 18046. doi: 10.1002/anie.201910882

  4. [4]

     Xu, W.; Raetz, L. B.; Wang, P.; Tang, Y. Tetrahedron 2016, 72, 3599. doi: 10.1016/j.tet.2015.09.029

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  图式 1  两种骨架结构化合物的后修饰途径

  Scheme 1  Post-modified pathways of two skeleton structures

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  图 1  (A) 突变株的构建、(B)突变株的PCR验证图和(C) ΔtjhC5::2R, ΔtjhD5::2R和ΔtjhC5/D5::2R发酵粗提物HPLC图

  Figure 1  (A) Construction of the mutant strain, (B) PCR verification of the mutant strain and (C) HPLC analysis of fermentation extractions of ΔtjhC5::2R, ΔtjhD5::2R and ΔtjhC5/D5::2R

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  图 2  aureuspiro (6)化学结构

  Figure 2  Chemical structure of aureuspiro (6)

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  图式 2  推测的aureuspiro形成机制

  Scheme 2  Proposed mechanism of the formation of aureuspiro

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  表 1  Aureuspiro的核磁共振图谱数据(500/125 MHz, CH₃OH-d₄)

  Table 1.  NMR spectroscopic data of aureuspiro (500/125 MHz, CH₃OH-d₄)

  Position	δC	δH	HMBC (H→C)	1H-1H COSY
  1	160.5
  2	122.6	7.23 (d, J＝8.0 Hz, 1H)	4, 15	3
  3	136.7	7.70 (t, J＝8.0 Hz, 1H)	1, 5	2, 4
  4	118.5	7.53 (d, J＝8.0 Hz, 1H)	2, 6, 15	3
  5	134.2
  6	198.1
  7	47.9
  8	28.7	1.95~2.02 (m, 1H) 1.72~1.77 (m, 1H)	6, 10, 13	9
  9	27.2	1.44~1.50 (m, 1H) 1.56~1.61 (m, 1H)	7, 8, 11	8, 10
  10	64.3	4.13~4.18 (m, 1H)	8, 12	9, 11
  11	32.5	2.48~2.55 (m, 1H) 2.22~2.47 (m, 1H)	7, 9	10, 12
  12		2.95 (dd, J＝4.7, 12.0 Hz, 1H)	6, 8, 10	11
  13	50.3	3.60 (d, J＝16.7 Hz, 1H) 2.63 (d, J＝16.8 Hz, 1H)	6, 8, 12, 15
  14	203.1
  15	116.7
  16	210.0
  17	27.1	2.19 (s, 3H)	12, 16

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