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• 许多金属离子的存在对人体和环境都有着非常不利的影响^[1-3], 例如铅离子由于其较高的毒性, 在很多方面都引起了关注^[4-6].生理学家指出, 人体每天只能有效地排出约2 mg的铅, 超过这个数量就会导致严重的健康问题, 特别是对儿童造成重大危害, 如记忆力减退、贫血和神经传导速度减慢等^[7-8].因此对铅离子的检测一直以来都受到高度重视.虽然已经发展了很多用于检测铅离子的方法, 如原子吸收光谱法(AAS)、质谱法(MS)和原子发射光谱法等^[8].但是使用这些方法需要昂贵的仪器或复杂的程序, 并且很耗时.因此, 开发一种简单且廉价的能够检测Pb²⁺离子的方法就变得非常迫切.因为光学检测具有低成本、操作简便、仪器使用简单、反应速度快、选择性好^[9-12]等优点, 正逐渐被用于检测金属离子.近年来, 很多研究者已经设计和合成了许多Pb²⁺荧光传感探针.然而, 这些Pb²⁺荧光传探针仍然存在一些缺点, 例如复杂的合成步骤, 选择性差, 低的检出极限^[13-15], 或者只能在有机溶剂中使用.因此, 开发一些成本低、选择性好、灵敏度高的新型Pb²⁺荧光探针仍然存在很大的挑战.在过去的几十年中, 研究发现含有CH＝N结构的荧光化学传感器, 具有与金属离子配位的良好能力^[16-17].本研究报道了一个席夫碱类荧光探针L, 并通过紫外光谱、荧光光谱、高分辨质谱、核磁共振波谱以及密度泛函理论(DFT)理论计算, 研究了其对Pb²⁺的检测性能.

  1.   结果与讨论

  1.1   探针L的设计与合成

  以菲咯啉二醛和邻羟基苯胺为原料, 合成了一种新型席夫碱荧光探针(图 1), 通过核磁氢谱、碳谱、质谱和红外光谱表征了其结构, 化合物L具有一定大小的空腔, 拥有CH＝N和OH官能团, 能够实现对金属阳离子的络合.

  图 1

  

  图 1.  化合物L的合成路线

  Figure 1.  Synthetic route of compound L

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  1.2   光谱研究

  如图 2a所示, 在DMF-H₂O (V:V＝1:1, 10 mmol/ L Tris, pH＝7.4)溶液中, 探针L (3.33×10^－5 mol/L)的荧光发射峰值位于416 nm处(激发波长346 nm), 当向L 的溶液中分别加入2.0 equiv.金属离子(如Li⁺, Na⁺, K⁺, Ag⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Hg²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Cr³⁺, Fe³⁺和Al³⁺)时, 其荧光未发生明显变化; 在相同条件下只有Pb²⁺离子的加入会导致探针L的荧光淬灭.为了进一步了解探针L与Pb²⁺之间的络合模式, 进行了荧光光谱滴定实验.由图 2b发现, 随着Pb²⁺ (0~1.6 equiv.)的加入, 探针L的荧光强度逐渐减弱, 荧光发射峰由418 nm蓝移到400 nm, 肉眼可以观察到溶液的颜色由黄色变为橙色(图 2b右上插图), 其他金属离子的加入并没有观察到明显的颜色变化.根据荧光强度和Pb²⁺的浓度变化关系, 使用方程Benesi-Hilde-brand^[18-19]和C_DL＝3δ/k^[20-21], 计算出探针对Pb²⁺离子的结合常数和检出极限分别为(3.47± 0.49)×10⁴ L/mol和2.68×10^－7 mol/L. Jobʼs曲线滴定实验和高分辨率质谱分析表明探针L与Pb²⁺离子的络合化学计量比为1:1.为了进一步探究其他金属离子存在时, 探针L对Pb²⁺的选择性, 在其他金属离子(2 equiv.)存在下继续加入Pb²⁺ (2 equiv.)后, 溶液的荧光强度发生明显降低, 这表明金属离子对Pb²⁺的检测无明显干扰, 传感器L对Pb²⁺有很高的选择性(图 2c).体系的pH值通常被认为是主体与客体相互作用的重要因素, 当pH在5.3~10.3的范围内探针L的荧光强度没有变化, 在4.5~8.3的范围内L-Pb²⁺配合物的荧光强度较弱.考虑到潜在的生物应用, 选择pH值为7.4作为L的检测体系.可逆性是探针实用性的一个重要的因素.当加入乙二胺四乙酸(EDTA) (10 equiv.)时, 探针的荧光恢复, 再次加入Pb²⁺时, 探针的荧光又淬灭.这一过程至少可以重复三次而探针的荧光强度损失不大, 表明探针L与Pb²⁺作用是可逆的.我们所制备的荧光探针与许多已报道的荧光探针相比, 具有结构简单、成本低及选择性高等特点^{[4, 6, 8]}, 在环境样品检测等领域具有潜在的应用前景.

  图 2

  

  图 2.  (a) 在DMF-H₂O (V:V＝1:1, 10 mmol/L Tris, pH＝7.4)溶液中加入2.0 equiv.不同金属离子(Li⁺, Na⁺, K⁺, Ag⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Cr³⁺, Fe³⁺和Al³⁺)后探针L (3.33×10^－5 mol/L)的荧光波谱(λ_ex＝346 nm); (b)在探针L (3.33×10^－5 mol/L)的溶液中加入Pb(NO₃)₂ (0~1.6 equiv.)的荧光光谱变化

  Figure 2.  (a) Fluorescent intensity of probe L (3.33×10^－5 mol/L) upon the addition of different metal ions of Li⁺, Na⁺, K⁺, Ag⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Cr³⁺, Fe³⁺and Al³⁺ (2.0 equiv.) in DMF-H₂O (V:V＝1:1, 10 mmol/L Tris, pH＝7.4) (λ_ex＝346 nm); (b) fluorescence changes of probe (3.33×10^－5 mol/L) upon additions of different equiv. of Pb(NO₃)₂ at 20 ℃ in the buffer solution; (c) comparison among the fluorescent intensity of L (3.33×10^－5 mol/L) upon the addition of 2.0 equiv. of Pb²⁺ in the presence of 2.0 equiv. background metal ions in the buffer solution(b) Insert: the photo of L upon additions of Pb²⁺ ion in the buffer solution at 20 ℃; (c) black column: the fluorescence intensity of probe L in the presence of metal ions (2 equiv.), red column: the fluorescence intensity of probe L in the presence of various metal ions (2 equiv.) and Pb²⁺ (2 equiv.).

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  1.3   络合机理

  为了理解探针L与Pb²⁺之间的络合机理, 在相同条件下进行了紫外光谱滴定实验.结果表明, 探针L在286 nm处有一明显的吸收峰, 当向溶液中逐渐加入Pb²⁺时, 286 nm处的吸收峰减弱, 表明探针与Pb²⁺发生了络合.为了进一步探究探针L对Pb²⁺络合模式, 在DMSO-d₆溶液中进行了¹H NMR滴定实验.如图 3a所示, 将1.0 equiv. Pb²⁺加入到探针L中时, ¹H NMR谱发生了明显的变化, H_a的质子峰从δ 9.15向低场位移到δ 9.84, 而菲咯啉环上位于δ 8.16, 8.68, 8.86处的质子信号向低场移动到δ 8.39, 8.72, 9.20.酚羟基质子峰H_b在加入Pb²⁺后消失, 说明Pb²⁺与酚羟基发生了络合.当O原子与Pb²⁺配位, 会引起电子云密度的降低, 苯环上其它质子信号也向低场移动.当加入多于1.0 equiv. Pb²⁺时, 探针L的核磁氢信号的位置不再发生变化, 表明探针L与Pb²⁺之间形成了1:1的络合物, 且L与Pb²⁺之间的络合是通过菲咯啉的氮原子、席夫碱氮原子以及羟基的氧原子发生络合的.同时, 以B3LYP泛函为基础, 利用Gaussian 09程序进行了密度泛函理论(DFT)的计算, 以进一步了解L-Pb²⁺的络合机理.如图 3b所示, Pb²⁺与N原子的距离分别为0.24、0.24、0.27和0.27 nm, 这满足了向中心金属离子提供络合空间的前提条件.此外, 当探针L与Pb²⁺配位时, 其结构基本保持不变, 结果发现从最低未占分子轨道(LUMO)到最高已占分子轨道(HOMO)转变时, 电子云密度的变化值减小. L及其Pb²⁺络合物中HOMO和LUMO的能隙分别为3.54和2.66 eV.由于探针L与Pb²⁺的络合物的HOMO和LUMO的能量稳定性高于探针L本身, 使得L向其配合物转化的几率较大.未配位的探针L中LUMO中的电子密度分布在菲咯啉环上, 而HOMO中的电子密度主要分布在整个分子上.而在其Pb²⁺络合物中, LUMO的电子密度主要出现配体特征, HOMO的电子密度主要分布在配体和Pb²⁺离子部分.光诱导电子转移(PET)是由L的氮原子上的电子密度引起的. L-Pb²⁺络合物形成后, 提高了氮原子向激发的菲咯啉和金属离子的电子转移能力, 导致发生PET过程^[22-23].随着L-Pb²⁺络合物的形成, L- Pb²⁺的荧光强度逐渐降低.基于上述研究结果, 提出了探针L与Pb²⁺可能的络合模式(图 3c).

  图 3

  

  图 3.  (a) 在DMSO-d₆中探针L (2×10^－3 mol/L)和加入Pb²⁺的¹H NMR图, (b)探针L和加入Pb²⁺后的结构优化图和(c)探针L对Pb²⁺可能的络合机理

  Figure 3.  (a) ¹H NMR spectra of probe L (2×10^－3 mol/L) with Pb(NO₃)₂ in DMSO-d₆, (b) probe L and L-Pb²⁺ calculated through the DFT of Gaussian 09, and (c) the bonding mode of probe L towards Pb²⁺

  A: Probe L, B: probe L+1 equiv. Pb²⁺, C: probe L+2 equiv. Pb²⁺

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  1.4   荧光成像

  为了进一步拓展探针L的应用研究, 首先用噻唑蓝(MTT)法检测了探针L对活PC-12的细胞毒性.探针L在20 μmol/L时, 细胞的存活率超过90%, 表明探针L的细胞毒性较低.根据文献报道, 在Pb²⁺浓度为50 μmol/L时PC-12细胞的存活率超过65% (24 h)^[5], 因此选用探针L和Pb²⁺浓度均为20 μmol/L进行细胞成像研究.如图 4所示, PC-12细胞用探针L孵育30 min后, PC-12细胞内显示了很强的荧光(图 4a, 4b), 表明探针L可以穿透PC-12细胞.而在图 4c中, PC-12细胞内不显示荧光, 表明探针L可以在细胞内可以检测Pb²⁺.

  图 4

  

  图 4.  探针L在PC-12活细胞中的荧光成像

  Figure 4.  Live cell fluorescence imaging of probe L in living PC-12 cells

  (a) Bright-field image of living PC-12 cells incubation with L (20 µmol/ L) for 30 min, (b) fluorescence images of a, (c) bright-field image with L (20 µmol/L) and Pb²⁺ (20 µmol/L) ion for 30 min, and (d) fluorescence images of c

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  2.   结论

  设计并合成了一种新型的基于菲咯啉的席夫碱荧光探针L.实验表明, 探针L在DMF-H₂O (V:V＝1:1, 10 mmol/L Tris, pH＝7.4)溶液中显示对Pb²⁺的荧光猝灭响应, 以及从黄色到橙色的比色响应.在其他金属离子存在的情况下, 探针L显示出对Pb²⁺的高度选择性识别.紫外可见、荧光、高分辨质谱实验显示, 探针和Pb²⁺形成了1:1的络合物, 其络合常数K_a＝3.47×10⁴ L/mol, 对Pb²⁺的检测限为2.68×10^－7 mol/L.此外结合核磁滴定和拟合计算, 提出了探针和Pb²⁺可能的络合模式.细胞成像实验表明, 探针L可以穿透活细胞PC-12, 并且在细胞内检测Pb²⁺, 拓宽了探针L在化学和生物研究中检测Pb²⁺的应用前景.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  所有试剂和化学药品均购自商业供应. ¹H NMR和¹³C NMR在Bruker AV仪上测定; 熔点用MEL-TEMPII熔点仪测定; IR光谱在Nicolet 670 FT-IR分光光度计上测定; 高分辨质谱在Esquire 3000 LC-MS质量仪器上测定; 紫外和荧光光谱分别在Agilent Cary-100UV-vis分光光度计和F-7000FL荧光分光光度计上测定.细胞成像在20×物镜的倒置荧光显微镜上测定. pH测量在FE28 pH计和LE438 pH电极上测定. 2, 9-二甲酰基-1, 10-菲咯啉由2, 9-二甲基-1, 10-菲咯啉经SeO₂氧化制得^[24].

  3.2   实验方法

  3.2.1   化合物L的合成

  室温下在50 mL圆底烧瓶中加入0.42 g 2-羟基苯胺(3.81 mmol), 将1, 10-菲咯啉-2, 9-二甲醛(0.3 g, 1.27 mmol)的无水甲醇(10 mL)溶液逐滴加入圆底烧瓶中.最后的混合物在室温下搅拌2 h, 直至出现沉淀.将沉淀过滤, 滤饼用无水甲醇(10 mL×2)洗涤, 得到0.36 g目标产物L, 产率68%.棕黄色固体, m.p. 215.5~216.3 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.40 (s, 2H), 9.15 (s, 2H), 8.84 (d, J＝8.4 Hz, 2H), 8.67 (d, J＝8.4 Hz, 2H), 8.16 (s, 2H), 7.50 (d, J＝9.2 Hz, 2H), 7.20 (t, J＝8.4 Hz, 2H), 6.99 (d, J＝8.1 Hz, 2H), 6.92 (t, J＝8.1 Hz, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 159.5, 155.2, 152.4, 145.6, 137.5, 136.9, 130.1, 129.3, 128.2, 121.4, 120.4, 120.2, 117.0; IR (KBr) v: 3409, 3216, 1926, 1708, 1620, 1587, 1552, 1493, 1453, 1361, 749 cm^－1. HRMS calcd for C₂₆H₁₉N₄O₂ [M+H]⁺ 419.1503, found 419.1503.

  3.2.2   荧光光谱测定

  在水溶液中制备各种金属离子的硝酸盐或氯化物储备液(0.1 mol/L).化合物L溶解在DMF中配制成0.01 mol/L的溶液.在光谱测量时, 将其稀释至3.33×10^－5 mol/L (DMF/H₂O, V:V＝1:1, 10 mmol/L Tris, pH＝7.4).每次取3.00 mL的L溶液放在长度为1 cm的比色皿中, 用微型注射器将不同的金属离子(10 μL)加入到比色皿.然后在室温下记录UV-vis和荧光光谱.

  3.2.3   理论计算

  采用Gaussian-09程序对探针L及其铅离子络合物进行了理论计算.利用谐振频率分析(未发现虚频)确认DFT优化结构在势能面(PES)上是最小值, 并且在几何优化期间仅使用默认收敛条件.

  3.2.4   细胞成像测试

  PC-12细胞在37 ℃下含5% CO₂的加湿气氛中培养.实验前, 细胞与探针L (20 mmol/L)在0.1 mol/L无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中共同孵育30 min.铅离子成像时, 先用Pb(NO₃)₂的PBS缓冲液培养30 min, 再用PBS缓冲液洗涤细胞3次.通过倒置荧光显微镜将接种到培养皿上的细胞进行荧光成像.

  辅助材料(Supporting Information)化合物L的¹H NMR, ¹³C NMR, HRMS (ESI)谱图, Benesi-Hildebrand, 探针对Pb²⁺离子的结合常数, 检出极限, Jobʼs曲线滴定, L-Pb²⁺高分辨质谱, pH分析, 恢复性实验, 紫外光谱滴定和MTT分析.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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  图 1  化合物L的合成路线

  Figure 1  Synthetic route of compound L

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  图 2  (a) 在DMF-H₂O (V:V＝1:1, 10 mmol/L Tris, pH＝7.4)溶液中加入2.0 equiv.不同金属离子(Li⁺, Na⁺, K⁺, Ag⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Cr³⁺, Fe³⁺和Al³⁺)后探针L (3.33×10^－5 mol/L)的荧光波谱(λ_ex＝346 nm); (b)在探针L (3.33×10^－5 mol/L)的溶液中加入Pb(NO₃)₂ (0~1.6 equiv.)的荧光光谱变化

  Figure 2  (a) Fluorescent intensity of probe L (3.33×10^－5 mol/L) upon the addition of different metal ions of Li⁺, Na⁺, K⁺, Ag⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ba²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺, Ni²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Cr³⁺, Fe³⁺and Al³⁺ (2.0 equiv.) in DMF-H₂O (V:V＝1:1, 10 mmol/L Tris, pH＝7.4) (λ_ex＝346 nm); (b) fluorescence changes of probe (3.33×10^－5 mol/L) upon additions of different equiv. of Pb(NO₃)₂ at 20 ℃ in the buffer solution; (c) comparison among the fluorescent intensity of L (3.33×10^－5 mol/L) upon the addition of 2.0 equiv. of Pb²⁺ in the presence of 2.0 equiv. background metal ions in the buffer solution(b) Insert: the photo of L upon additions of Pb²⁺ ion in the buffer solution at 20 ℃; (c) black column: the fluorescence intensity of probe L in the presence of metal ions (2 equiv.), red column: the fluorescence intensity of probe L in the presence of various metal ions (2 equiv.) and Pb²⁺ (2 equiv.).

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  图 3  (a) 在DMSO-d₆中探针L (2×10^－3 mol/L)和加入Pb²⁺的¹H NMR图, (b)探针L和加入Pb²⁺后的结构优化图和(c)探针L对Pb²⁺可能的络合机理

  Figure 3  (a) ¹H NMR spectra of probe L (2×10^－3 mol/L) with Pb(NO₃)₂ in DMSO-d₆, (b) probe L and L-Pb²⁺ calculated through the DFT of Gaussian 09, and (c) the bonding mode of probe L towards Pb²⁺

  A: Probe L, B: probe L+1 equiv. Pb²⁺, C: probe L+2 equiv. Pb²⁺

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  图 4  探针L在PC-12活细胞中的荧光成像

  Figure 4  Live cell fluorescence imaging of probe L in living PC-12 cells

  (a) Bright-field image of living PC-12 cells incubation with L (20 µmol/ L) for 30 min, (b) fluorescence images of a, (c) bright-field image with L (20 µmol/L) and Pb²⁺ (20 µmol/L) ion for 30 min, and (d) fluorescence images of c

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