1, 2, 4-三唑-3-硫醚衍生物的合成、晶体结构与神经氨酸酶抑制活性

引用本文: 何梅, 贺超凡, 刘玲, 叶姣, 胡艾希, 陈云, 许律捷, 刘艾林. 1, 2, 4-三唑-3-硫醚衍生物的合成、晶体结构与神经氨酸酶抑制活性[J]. 有机化学, 2020, 40(8): 2402-2410. doi: 10.6023/cjoc202003009 shu

Citation: He Mei, He Chaofan, Liu Ling, Ye Jiao, Hu Aixi, Chen Yun, Xu Lujie, Liu Ailin. Synthesis, Crystal Structure and Neuraminidase Inhibitory Activity of 1, 2, 4-Triazole-3-sulfide Derivatives[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2020, 40(8): 2402-2410. doi: 10.6023/cjoc202003009 shu

1, 2, 4-三唑-3-硫醚衍生物的合成、晶体结构与神经氨酸酶抑制活性

何梅 ^a, ,
贺超凡 ^a, ,
刘玲 ^a, ,
叶姣 ^{a,
,} ,
胡艾希 ^{a,
,} ,
陈云 ^a, ,
许律捷 ^b, ,
刘艾林 ^b,

a.
湖南大学化学化工学院长沙 410082
b.
中国医学科学院北京协和医学院药物研究所北京 100050

通讯作者: 叶姣, yejiao@hnu.edu.cn; 胡艾希, axhu@hnu.edu.cn

基金项目:

湖南省自然科学基金（No.2019JJ40030）资助项目

摘要: 设计并合成了一系列1，2，4-三唑-3-硫醚衍生物，目标化合物的化学结构经¹H NMR、¹³C NMR、质谱和元素分析确证；采用单晶X射线衍射法测定了（E）-4-（4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基）-5-乙基-4H-1，2，4-三唑-3-丙硫醚（1c）的晶体结构.目标化合物体外神经氨酸酶（Neuraminidase，NA，H1N1）抑制活性测试结果表明，大部分化合物1具有较好的NA抑制活性，其中（E）-4-（4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基）-5-乙基-4H-1，2，4-三唑-3-乙硫醚（1b）和1c的NA抑制活性最佳，其IC₅₀值分别为（6.86±2.08）和（9.1±1.56）μg/mL.

关键词:

English

Synthesis, Crystal Structure and Neuraminidase Inhibitory Activity of 1, 2, 4-Triazole-3-sulfide Derivatives

He Mei ^a, ,
He Chaofan ^a, ,
Liu Ling ^a, ,
Ye Jiao ^{a,
,} ,
Hu Aixi ^{a,
,} ,
Chen Yun ^a, ,
Xu Lujie ^b, ,
Liu Ailin ^b,

a.
College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan University, Changsha 410082
b.
Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050

Corresponding author: Ye Jiao，E-mail: yejiao@hnu.edu.cn; Hu Aixi，E-mail:axhu@hnu.edu.cn

Received Date: 05 March 2020
Revised Date: 21 May 2020
Available Online: 01 August 2020
Fund Project:

Project supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province (No. 2019JJ40030)

Abstract: A series of 1, 2, 4-triazole-3-sulfide derivatives were designed and synthesized. Their chemical structures were confirmed by ¹H NMR, ¹³C NMR, MS and elemental analysis. The crystal structure of (E)-4-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl-methyleneamino)-5-ethyl-4H-1, 2, 4-triazole-3-propylsulfide (1c) was determined by X-ray diffraction analysis. The preliminary assay of neuraminidase (NA, H1N1) inhibitory activity in vitro showed that most of compound 1 has more potent NA inhibitory activity. Among them, compounds (E)-4-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl-methyleneamino)-5-ethyl-4H-1, 2, 4-triazole-3-ethylsulfide (1b) and 1c showed the best inhibitory activity with IC₅₀ values of (6.86±2.08) and (9.1±1.56) μg/mL, respectively.

Key words:

流感是一种爆发频繁、致死率高、严重威胁人类健康的疾病^[1-2].目前抗流感药物根据其作用机理的不同主要分为M2离子通道抑制剂(金刚烷胺和金刚乙胺)、神经氨酸酶(Neuraminidase, NA)抑制剂(扎那米韦、奥司米韦、帕拉米韦、拉尼米韦)、核糖核酸(RNA)聚合酶抑制剂(法匹拉韦)、血凝素(HA)抑制剂(阿比多尔)和帽状结构(Cap)依赖型核酸内切酶抑制剂(巴洛沙韦)^[3-6].其中, 金刚烷胺和金刚乙胺是最早研制成功的抗流感药物, 只能抑制甲型流感病毒的M2离子通道, 临床使用已有四十余年, 由于其严重的抗药性已不再推荐用于治疗流感^[7].神经氨酸酶抑制剂(NAIs)是第二代主流的抗流感药物, 主要是通过抑制呼吸道病毒表面神经氨酸酶的活性, 从而阻断病毒的复制和释放, 达到抗流感病毒的作用, 是目前使用最为广泛的治疗和预防流感的药物^[8].虽然流感病毒抗原极易变异, 但所有A型和B型流感病毒的NA活性位点具有高度保守性^[9-10], 所以NA一直是研发抗流感药物的理想靶标.目前已上市的4个NAIs, 扎那米韦(Zanamivir)、奥司他韦(Oseltamivir)、帕拉米韦(Peramivir)和拉尼米韦(Laninamivir), 均具有优异的NA抑制活性和整体抗病毒活性, 但该类药物的结构中含有多个手性中心, 结构复杂, 合成困难, 所需原料昂贵, 生产成本高; 同时随着NAIs药物的广泛使用, 耐药病毒迅速出现^[11-12], 因此, 急需研究开发结构新颖的新型抗流感药物, 以应对未来的流感大爆发.

近年来, 随着大量具有低毒性和较高生物活性的含氮杂环化合物被报道, 含氮杂环已成为新药创制研究的热点领域之一^[13-20].其中1, 2, 4-三唑硫酮(硫醇或硫醚)衍生物是一类具有广泛生物活性的含氮杂环化合物, 如抗菌^[21-22]、消炎^[23]、抗病毒^[24]、抗肿瘤^[25]等活性, 具有开发新药和新的药理活性的价值.例如: Sharma等^[26]合成的1, 2, 4-三唑硫醇亚胺类衍生物具有抑菌作用, 其中化合物A(图 1)对大肠杆菌(Escherichia coli)抑菌值为(10.2±0.24) mm, 对革兰氏阳性菌(Streptococcus pneumoniae)和真菌(Aspergillus niger)抑菌值分别为(11.28±0.25)和(17.24±0.21) mm [阳性对照药环丙沙星对大肠杆菌抑菌值为(19.67±0.58) mm, 对革兰氏阳性菌抑菌值为(20.18±0.16) mm, 阳性对照药氟康唑对真菌抑菌值为(20.31±0.13) mm]. Liu等^[27]设计并合成的含有1, 2, 4-三唑硫醚亚胺的化合物B(图 1)具有抗HIV-1_ⅢB活性, 其EC₅₀值为17.4 μmol/L. Kamel等^[28]研究了1, 2, 4-三唑硫醇类衍生物的抗癌活性, 其中化合物C(图 1)对HEPG2癌细胞表现出了nmol/L级的抑制活性, 其IC₅₀值为53 nmol/L. El-Husseiny等^[29]以萘普生为骨架, 设计合成的1, 2, 4-三唑硫酮亚胺类衍生物具有抗炎作用, 其中化合物D(图 1)对COX-2酶有优良的抑制活性, 其IC₅₀为0.40 μmol/L.

图 1

图 1. 1, 2, 4-三唑硫酮(硫醇或硫醚)衍生物

Figure 1. 1, 2, 4-Triazolethione (thiol or thioether) derivatives

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1, 2, 4-三唑硫酮(硫醇或硫醚)衍生物除具有以上生物活性外, 还具有良好的NA抑制活性, 本课题组^[30]在前期研究中, 通过骨架跃迁方法设计并合成了一系列1, 2, 4-三唑-3-硫酮衍生物, 大部分具有良好的神经氨酸酶(H1N1)抑制活性, 其中活性最好的化合物E和F(图 1)的IC₅₀值分别为(14.97±0.70)和(14.68±0.49) μg/mL.通过分子对接分析发现, 化合物E与NA (PDA entry: 3TI6)的活性空腔有两个作用位点, 一个是苯环上的4-OH-3-OCH₃类似于奥司他韦羧酸的羧基, 能与Arg118, Arg292和Arg371形成多个氢键作用, 另一个是1, 2, 4-三唑环上的两个氮原子与Glu119具有氢键作用(图 2).

图 2

图 2. 化合物E与A/H1N1-NA (3TI6)的分子对接模型

Figure 2. Interaction models of E with A/H1N1-NA (3TI6)

The top picture shows binding models of E with A/H1N1-NA. The H-bond interactions are depicted as yellow dashed lines. The bottom picture shows comparison of the interactions of E and Oseltamivir acid with A/H1N1-NA by structural superposition

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为进一步提高该类化合物与NA活性位点的结合能力, 本工作在化合物E的基础上, 将硫酮转变为硫醚, 通过引入疏水性基团增加分子与靶点的疏水作用.因此在目标分子的R位置引入不同的烷基和芳基, 探究取代基的大小、位阻和极性对NA抑制活性的影响, 设计并合成了11个新型1, 2, 4-三唑硫醚亚胺衍生物; 然后从中筛选出活性较佳的2个化合物, 将其N＝C还原成NH—CH, 增大分子的柔性, 设计合成了2个新型1, 2, 4-三唑硫醚胺类衍生物(Scheme 1), 考察化合物刚性与柔性对活性的影响, 并对所有目标化合物体外NA抑制活性进行评估.目标化合物的合成路线见Scheme 2.

图式 1

图式 1. 目标化合物1和2的设计

Scheme 1. Design strategy of the target compounds 1 and 2

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图式 2

图式 2. 目标化合物1和2的合成路线

Scheme 2. Synthetic routes of target compounds 1 and 2

1a: R＝CH₃; 1b, 2b: R＝C₂H₅; 1c, 2c: R＝n-Pr; 1d: R＝i-Pr; 1e: R＝n-C₄H₉; 1f: R＝sec-C₄H₉; 1g: R＝n-C₅H₁₁; 1h: R＝CH(CH₂CH₃)₂; 1i: R＝CH₂COOH; 1j: R＝4-O₂NC₆H₄CH₂; 1k: R＝4-NCC₆H₄CH₂

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1. 结果与讨论

1.1 目标化合物1a~1k和2b~2c的合成

化合物E(按文献^[30]合成)在碱作用下, 经硫烷基化反应得目标化合物1a~1k, 收率为39.7%~78.7%.用硼氢化钠将化合物1b和1c的N＝C还原成N—C得目标化合物2b和2c, 收率为81.0%~82.0%.所合成的目标化合物均通过¹H NMR、¹³C NMR、MS和元素分析确证结构.

1.2 化合物1c晶体结构解析

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基-4H- 1, 2, 4-三唑-3-丙硫醚(1c)单晶体结构如图 3所示, 氢键如图 4所示.

图 3

图 3. 化合物1c的单晶结构图

Figure 3. Single crystal structure of compound 1c

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图 4

图 4. 化合物1c的晶体中的分子间氢键作用图

Figure 4. Intermolecular hydrogen bonding in the crystal of compound 1c

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化合物1c晶体数据存于英国剑桥数据中心, CCDC号为1923378, 分子式为C₁₅H₂₀N₄O₂S, M_r＝320.41, m.p. 119~121 ℃.属于三斜晶系, 空间群为P-1, 每个单元含有2个分子, 晶胞参数为: a＝1.0601(8) nm, b＝1.5344(11) nm, c＝2.0476(9) nm; Z＝2, V＝3.129(3) nm³, D_c＝1.360 Mg/m³, S＝1.042, F(000)＝1360, μ＝0.220 mm^－1.

化合物1c只有一种硫醚式结构, 说明化合物E与烷基化试剂在碱性条件下的反应是以硫烷基化反应为主; 另外, 由于丙基柔性较强, 易发生扭转, 导致化合物1c具有四种构象, 且每种构象分子的苯环与1, 2, 4-三唑环的二面角大小有所差别, 第一种构象至第四种构象的二面角分别为56.62°, 64.02°, 86.98°和53.95°; 化合物1c有两个碳硫键, S(1)—C(9)和S(1)—C(11)的键长分别0.174和0.183 nm, 相比于C＝S (0.164 nm)的标准键长增大, 且与C—S (0.182 nm)^[31]的标准键长更接近, 说明C与S之间为单键, 也进一步证明了化合物1c为硫醚式结构(图 3); 化合物1c的晶体能通过苯环上的OH与相邻分子的1, 2, 4-三唑环上1位的N之间形成分子间氢键而稳定(图 4), 但是由于化合物1c有四种构象, 各类分子间所形成的氢键有差别, 其氢键距离及角度数据见表 1.另外, 分子结构中N＝C为E式构型.

表 1

表 1 化合物1c的氢键[nm和(°)]

Table 1. Hydrogen bonds [nm and (°)] of compound 1c

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D—H…A	d(D—H)	d(H…A)	d(D…A)	∠(DHA)
O(1)—H(1)…N(11)	0.0820	0.1870	0.2687	173.28
O(3)—H(3)…N(15)	0.0820	0.1936	0.2750	171.45
O(5)—H(5A)…N(8)	0.0820	0.1972	0.2721	151.48
O(7)—H(7)…N(4)	0.0820	0.1954	0.2699	150.71

1.3 生物活性

以扎那米韦(zanamivir)为阳性对照药, 评估了所有目标化合物的体外NA(H1N1)抑制活性, 并与化合物E和F进行了对比, 如表 2所示.从IC₅₀值看在化合物E基础上进一步改造的化合物1大部分表现出更优的NA抑制活性, 其中化合物1b和1c的活性最强, 其IC₅₀值分别为(6.86±2.08)和(9.1±1.56) μg/mL.此外, 化合物1a、1d、1e、1g和1i的NA抑制活性较化合物E和F都有所增强, 说明在1, 2, 4-三唑环的硫酮部分引入基团有助于提高活性.

表 2

表 2 化合物1a~1k和2b~2c的神经氨酸酶(H1N1)抑制活性

Table 2. Neuraminidase (H1N1) inhibitory activities of compounds 1a~1k and 2b~2c

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Compd.	R	Inhibition rate/ % (40 μg/mL）	IC₅₀/(μg•mL^－1)
1a	CH₃	76.11±2.41	10.6±2.58
1b	C₂H₅	79.11±0.64	6.86±2.08
1c	n-Pr	84.05±1.03	9.10±1.56
1d	i-Pr	74.34±1.39	14.58±2.54
1e	n-C₄H₉	78.03±5.48	10.81±5.14
1f	sec-C₄H₉	57.47±8.95	28.2±11.26
1g	n-C₅H₁₁	74.48±4.96	13.89±4.82
1h	CH(CH₂CH₃)₂	73.01±1.19	20.12±1.55
1i	CH₂COOH	81.07±4.66	12.57±3.47
1j	4-O₂NC₆H₄CH₂	45.00±7.57	—
1k	4-NCC₆H₄CH₂	67.37±1.43	20.15±1.1
2b	C₂H₅	16.19±11.04	—
2c	n-Pr	16.59±10.71	—
E	—	75.81±2.24	14.97±0.70
F	—	79.79±0.71	14.68±0.49
Zanamivir	—	87.54±3.40^a	0.000047±0.000007
^a The concentration is 0.004 μg/mL.

对于化合物1a~1k, 当R为C₂H₅ (1b)时, NA抑制活性最佳, 其IC₅₀值为(6.86±2.08) μg/mL; 当R为C₃H₇ (1c)时, NA抑制活性次之, 其IC₅₀值为(9.1±1.56) μg/ mL; 当R替换成CH₃ (1a)、n-C₄H₉ (1e)和n-C₅H₁₁ (1g)时, NA抑制活性较化合物1b和1c略有降低, 当R替换成4-CNC₆H₄CH₂ (1k)时, NA抑制活性较化合物1b和1c大大降低, 其IC₅₀值为(20.15±1.1) μg/mL, 当R为4-NO₂C₆H₄CH₂ (1j)时, NA抑制率仅为(45±7.57)%, 说明R部位更加适合引入小基团(C₂H₅, C₃H₇), 有利于增加与NA活性位点的相互作用, 提高NA抑制活性, 缩短或延长碳链均不利于提高活性; 引入芳基, NA抑制活性降低; 化合物1d与1c、1f与1e、1h与1g相比NA抑制活性均有所下降, 说明取代基支链化不利于提高NA抑制活性; 把R由疏水基团C₂H₅ (1b)换成极性基团CH₂COOH (1i), 化合物1i的NA抑制率为(81.07±4.66)%, IC₅₀值为(12.57±3.47) μg/mL, NA抑制活性略有降低. R部位取代基与NA抑制活性的关系可归纳为: C₂H₅＞C₃H₇＞CH₃, n-C₄H₉＞CH₂COOH＞n-C₅H₁₁＞i-Pr＞CH(CH₂CH₃)₂＞sec-C₄H₉＞4-NCC₆H₄CH₂＞4- O₂NC₆H₄CH₂.

将化合物1b和1c的N＝C还原成NHCH得到2b和2c, NA抑制率分别为(16.19±11.04)%和(16.59±10.71)% (40 μg/mL), 几乎没有NA抑制活性, 说明增大分子的柔性, 可能不利于提高NA抑制活性.

1.4 分子对接

为深入研究活性化合物与NA的相互作用情况, 将NA抑制活性最佳的化合物1b和1b的N＝C还原产物2b与NA (PDA entry: 3TI6)的活性位点进行分子对接, 并与化合物E与NA (PDA entry: 3TI6)的活性位点分子对接结果进行对比分析.

如图 5a和5b所示, 化合物1b的4-OH-3-OCH₃与Arg118, Arg292和Arg371 (site 1)形成的氢键作用力较化合物E有所增强, 化合物1b的1, 2, 4-三唑环上的氮原子以及碳氮双键的氮原子能与Arg152和Asp151 (site 2)形成氢键相互作用, 另外, 化合物1b的SC₂H₅如同奥司他韦羧酸的异戊基一样具有疏水作用.化合物1b的对接结果与化合物E的相比较, 位点作用力增强, 同时引入的硫醚基团还产生了疏水作用, 最终表现出更优的抑制活性.

图 5

图 5. 化合物1b和2b与A/H1N1-NA (3TI6)的分子对接模型

Figure 5. Interaction models of 1b and 2b with A/H1N1-NA (3TI6)

(a, c) Binding models of 1b (a) and 2b (c) with A/H1N1-NA. The H-bond interactions are depicted as yellow dashed lines. (b, d) Comparison of the interactions of 1b (b) and 2b (d) and oseltamivir acid with A/H1N1-NA by structural superposition.

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由于将“N＝C”还原成“NH—CH”导致化合物2b的构象发生变化, 如图 5c和5d所示, 化合物2b的4-OH-3-OCH₃与Arg118, Arg292和Arg371 (site 1)相隔距离加长, 氢键作用消失, 与Ser179, Arg152形成氢键相互作用, 但它们都不是NA活性位点, 化合物2b与奥司他韦羧酸在NA活性位点的堆叠(图 5d)也显示了化合物2b的4-OH-3-OCH₃与奥司他韦羧酸的羧基的重叠度很低.化合物2b的1, 2, 4-三唑环上的氮原子以及碳氮双键的氮原子与Asp151 (site 2)和Try406形成氢键相互作用, 其中, 只有Asp151 (site 2)为NA活性位点, 同时, 化合物2b的SC₂H₅与奥司他韦羧酸的异戊基重叠度也很低.这些可能是化合物2b的NA抑制活性大大降低的原因.

2. 结论

设计并合成了13种1, 2, 4-三唑-3-硫醚衍生物(1a~1k和2b~2c), 其化学结构经¹H NMR, ¹³C NMR, MS和元素分析等方法确证.通过单晶X射线衍射进一步确定化合物1c的分子为硫醚结构, N＝C键为E式构型. NA (H1N1)的抑制活性表明, 化合物1具有较好的NA抑制活性, 其中化合物1b和1c的NA抑制活性最佳, 其IC₅₀值分别为(6.86±2.08)和(9.1±1.56) μg/mL.构效关系分析发现, 硫上引入小的直链烷基有利于提高活性, 将N＝C还原成NH—CH后NA抑制活性大大降低; 同时通过分子对接分析了活性化合物与NA的可能作用模式.

3. 实验部分

3.1 仪器与试剂

ZF-2型三用紫外仪(上海安亭电子仪器厂); R- 1002N型旋转蒸发仪、SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司); RY-1G型熔点仪(天津天光光学仪器有限公司); VARIANINOVA-400核磁共振仪(美国Varian公司), ¹H NMR共振频率为400 MHz, ¹³C NMR共振频率为100 MHz, TMS为内标; Bruker AXS SMART 1000 CCDX射线单晶衍射仪(德国); Agilent 1100 Series型高效液相色谱-质谱联用系统(EI, 美国Agilent公司); VARIO EL III元素分析仪(德国).

薄层层析硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公司).溶剂和试剂均为市售分析纯或化学纯.

3.2 实验方法

3.2.1 目标化合物1a~1k的合成

将1.0 mmol化合物E、3 mmol氢氧化钾和10 mL水混合均匀, 0~5 ℃下, 缓慢滴加2.24 mmol硫酸二甲酯的乙醇(10 mL)溶液, 滴毕, 室温搅拌1 h[薄层色谱(TLC)跟踪], 析出固体, 抽滤、水洗、乙酸乙酯重结晶得化合物1a.将1.0 mmol化合物E、2.0 mmol溴代烷烃和0.6 mmol碳酸钾溶于4 mL乙醇, 回流反应13.5 h (TLC跟踪), 冷却、减压除去溶剂, 加入乙酸乙酯, 饱和食盐水洗涤, 有机层用无水硫酸钠干燥、过滤、减压除去乙酸乙酯, 加入二氯甲烷/石油醚(V:V＝1:2)混合溶剂, 静置, 析出固体, 用乙酸乙酯或乙醇重结晶得化合物1b~1h.将1.0 mmol化合物E和1.0 mmol氯乙酸溶于含有0.15 mL吡啶的6 mL乙醇混合溶液中, 回流反应6 h (TLC跟踪), 冷却、减压除去溶剂得黄色粘稠状液体, 加入3 mL水, 析出黄色晶体, 抽滤、乙酸乙酯重结晶得化合物1i. 1.0 mmol化合物E, 将1.1 mmol 4-取代苄溴, 5 mL乙醇, 10滴三乙胺, 回流反应1.5~2.5 h (TLC跟踪), 冷却、减压除去溶剂, 析出固体, 乙醇洗涤, 乙酸乙酯重结晶得化合物1j和1k.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基-4H- 1, 2, 4-三唑-3-甲硫醚(1a):白色固体, 收率39.7%. m.p. 178~180 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 1.25 (t, J＝7.5 Hz, 3H, CH₃), 2.61 (s, 3H, CH₃), 2.77 (t, J＝7.5 Hz, 2H, CH₂), 3.87 (s, 3H, OCH₃), 6.97 (d, J＝8.2 Hz, 1H, C₆H₃), 7.40 (dd, J＝8.2, 1.6 Hz, 1H, C₆H₃), 7.52 (d, J＝1.6 Hz, 1H, C₆H₃), 8.68 (s, 1H, NCH), 10.14 (s, 1H, OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 166.9, 153.9, 152.3, 148.7, 147.2, 125.2, 123.4, 116.2, 111.2, 56.1, 18.6, 15.2, 11.4; MS (ESI) m/z: 290.83 [M－H]^－. Anal. calcd for C₁₃H₁₆N₄- O₂S: C 53.41, H 5.52, N 19.16; found C 53.45, H 5.46, N 19.14.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基- 4H-1, 2, 4-三唑-3-乙硫醚(1b):白色固体, 收率78.7%. m.p. 137~139 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 1.27 (t, J＝7.4 Hz, 3H, CH₃), 1.33 (t, J＝7.4 Hz, 3H, CH₃), 2.79 (q, J＝7.4 Hz, 2H, CH₂), 3.14 (q, J＝7.4 Hz, 2H, CH₂), 3.89 (s, 3H, OCH₃), 6.99 (d, J＝8.0 Hz, 1H, C₆H₃), 7.42 (d, J＝8.0 Hz, 1H, C₆H₃), 7.54 (s, 1H, C₆H₃), 8.68 (s, 1H, CH), 10.19 (s, 1H, OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 167.2, 153.9, 152.3, 148.7, 145.9, 125.3, 123.5, 116.2, 111.2, 56.1, 27.3, 18.7, 15.3, 11.3; MS (ESI) m/z: 305.11 [M－H]^－. Anal. calcd for C₁₄H₁₈N₄O₂S: C 54.88, H 5.92, N 18.29; found C 54.85, H 5.90, N 18.25.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基- 4H-1, 2, 4-三唑-3-丙硫醚(1c):白色固体, 收率76.4%. m.p. 119~121 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 1.00 (t, J＝7.3 Hz, 3H, CH₃), 1.35 (t, J＝7.5 Hz, 3H, CH₃), 1.70~1.79 (m, 2H, CH₂), 2.86 (q, J＝7.5 Hz, 2H, CH₂), 3.19 (t, J＝7.2 Hz, 2H, SCH₂), 4.00 (s, 3H, OCH₃), 6.84 (s, 1H, OH), 7.06 (d, J＝8.4 Hz, 1H, C₆H₃), 7.28 (d, J＝8.4 Hz, 1H, C₆H₃), 7.49 (s, 1H, C₆H₃), 8.41 (s, 1H, CH); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ: 163.9, 155.1, 150.7, 147.4, 146.1, 125.7, 124.1, 114.7, 108.7, 56.2, 35.5, 22.8, 18.9, 13.2, 11.2; MS (ESI) m/z: 318.88 [M－H]^－. Anal. calcd for C₁₅H₂₀N₄O₂S: C 56.23, H 6.29, N 17.49; found C 56.15, H 6.24, N 17.46.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基- 4H-1, 2, 4-三唑-3-异丙硫醚(1d):淡黄色晶体, 收率50.0%. m.p. 170~171 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d₆) δ: 10.17 (s, 1H, OH), 8.63 (s, 1H, NCH), 7.50 (s, 1H, C₆H₃), 7.39 (d, J＝8.0 Hz, 1H, C₆H₃), 6.96 (d, J＝8.0 Hz, 1H, C₆H₃), 3.86 (s, 3H, OCH₃), 3.68~3.63 (m, 1H, CH), 2.77 (q, J＝7.6 Hz, 2H, CH₂), 1.31 (d, J＝6.8 Hz, 6H, 2×CH₃), 1.25 (t, J＝7.6 Hz, 3H, CH₃); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.9, 166.8, 153.9, 152.4, 148.6, 145.8, 125.3, 123.4, 116.2, 111.2, 56.1, 34.9, 18.7, 11.3; MS (ESI) m/z: 318.88 [M－H]^－. Anal. calcd for C₁₅H₂₀- N₄O₂S: C 56.23, H 6.29, N 17.49; found C 56.15, H 6.24, N 17.46.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基- 4H-1, 2, 4-三唑-3-丁硫醚(1e):浅黄色固体, 收率75.7%. m.p. 103~106 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 0.88 (t, J＝7.4 Hz, 3H, CH₃), 1.25 (t, J＝7.5 Hz, 3H, CH₃), 1.34~1.43 (m, 2H, C₄H₇-CH₂), 1.59~1.66 (m, 2H, C₄H₇- CH₂), 2.77 (q, J＝7.5 Hz, 2H, C₂H₅-CH₂), 3.11 (t, J＝7.2 Hz, 2H, C₄H₇-CH₂), 3.87 (s, 3H, OCH₃), 6.97 (d, J＝8.2 Hz, 1H, C₆H₃), 7.40 (dd, J＝8.2, 1.6 Hz, 1H, C₆H₃), 7.52 (d, J＝1.6 Hz, 1H, C₆H₃), 8.66 (s, 1H, N＝CH), 10.15 (s, 1H, OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 167.3, 153.9, 152.3, 148.6, 146.0, 125.3, 123.5, 1 16.2, 111.2, 56.1, 32.7, 31.5, 21.5, 18.7, 13.8, 11.3; MS (ESI) m/z: 332.92 [M－ H]^－. Anal. calcd for C₁₆H₂₂N₄O₂S: C 57.46, H 6.63, N 16.75; found C 57.44, H 6.71, N 16.72.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基- 4H-1, 2, 4-三唑-3-仲丁硫醚(1f):白色固体, 收率52.5%. m.p. 183~186 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 0.93 (t, J＝7.4 Hz, 3H, CH₃), 1.25 (t, J＝7.5 Hz, 3H, CH₃), 1.29 (d, J＝6.8 Hz, 3H, CH₃), 1.55~1.66 (m, 2H, CH₂), 2.76 (q, J＝7.5 Hz, 2H, CH₂), 3.45~3.50 (m, 1H, CH), 3.87 (s, 3H, OCH₃), 6.97 (d, J＝8.2 Hz, 1H, C₆H₃), 7.40 (dd, J＝8.2, 1.6 Hz, 1H, C₆H₃), 7.52 (d, J＝1.6 Hz, 1H, C₆H₃), 8.65 (s, 1H, N＝CH), 10.14 (s, 1H, OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 167.8, 153.9, 152.3, 148.6, 145.0, 125.3, 123.5, 116.2, 111.2, 56.1, 45.9, 29.5, 21.2, 18.7, 11.6, 11.3; MS (ESI) m/z: 332.92 [M－H]^－. Anal. calcd for C₁₆H₂₂N₄O₂S: C 57.46, H 6.63, N 16.75; found C 57.44, H 6.71, N 16.72.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基-4H- 1, 2, 4-三唑-3-戊硫醚(1g):白色固体, 收率75.2%. m.p. 114~116 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 0.85 (t, J＝7.1 Hz, 3H, CH₃), 1.25 (t, J＝7.5 Hz, 3H, CH₃), 1.38~1.27 (m, 4H, CH₂), 1.68~1.59 (m, 2H, CH₂), 2.76 (q, J＝7.5 Hz, 2H, C₂H₅-CH₂), 3.09 (t, J＝7.2 Hz, 2H, C₅H₁₁- CH₂), 3.87 (s, 3H, OCH₃), 6.97 (d, J＝8.2 Hz, 1H, C₆H₃), 7.40 (dd, J＝8.2, 1.8 Hz, 1H, C₆H₃), 7.52 (d, J＝1.8 Hz, 1H, C₆H₃), 8.66 (s, 1H, N＝CH), 10.14 (s, 1H, OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 167.3, 153.9, 152.3, 148.6, 146.0, 125.3, 123.5, 116.2, 111.2, 56.1, 33.01, 30.5, 29.1, 22.1, 18.7, 14.2, 11.3; MS (ESI) m/z: 347.01 [M－H]^－. Anal. calcd for C₁₇H₂₄N₄O₂S: C 58.60, H 6.94, N 16.08; found C 58.68, H 6.91, N 16.05.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基- 4H-1, 2, 4-三唑-3-(戊-3)-硫醚(1h):白色固体, 收率48.2%. m.p. 189~191 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d₆) δ: 0.93 (t, J＝7.2 Hz, 6H, CH₃), 1.25 (t, J＝7.2 Hz, 3H, CH₃), 1.55~1.65 (m, 4H, CH₂), 2.76 (q, J＝7.2 Hz, 2H, CH₂), 3.29~3.32 (m, 1H, CH), 3.86 (s, 3H, OCH₃), 6.97 (d, J＝8.0 Hz, 1H, C₆H₃), 7.40 (d, J＝8.0 Hz, 1H, C₆H₃), 7.52 (s, 1H, C₆H₃), 8.67 (s, 1H, NCH), 10.18 (s, 1H, OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 167.8, 153.9, 152.3, 148.6, 145.0, 125.3, 123.5, 116.2, 111.2, 56.1, 53.2, 27.1, 18.7, 11.5, 11.3; MS (ESI) m/z: 347.01 [M－H]^－. Anal. calcd for C₁₇H₂₄N₄O₂S: C 58.60, H 6.94, N 16.08; found C 58.68, H 6.91, N 16.05.

(E)-2-((5-乙基-4-((4-羟基-3-甲氧基亚苄基)氨基)- 4H-1, 2, 4-三唑-3-基)硫代)乙酸(1i):黄色固体, 收率43.0%. m.p. 174.5~176 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d₆) δ: 1.23 (t, J＝7.6 Hz, 3H, CH₂CH₃), 2.73~2.78 (m, 2H, CH₂), 3.85 (s, 3H, OCH₃), 3.99 (s, 2H, SCH₂), 7.50~6.95 (m, 3H, C₆H₃), 8.66 (s, 1H, NCH), 10.13 (s, 1H, OH), 12.91 (s, 1H, COOH); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 167.6, 153. 9, 152.3, 148.6, 145.1, 125.3, 123.5, 116.2, 111.2, 56.1, 39.3, 23.6, 18.7, 11.3; MS (ESI) m/z: 334.82 [M－H]^－. Anal. calcd for C₁₄H₁₆N₄O₄S: C 49.99, H 4.79, N 16.66; found C 50.03, H 4.85, N 16.64.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基- 4H-1, 2, 4-三唑-3-(4-硝基苄基)硫醚(1j):淡黄色固体, 收率67.8%. m.p. 154~156 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 1.21 (t, J＝7.4 Hz, 3H, CH₃), 2.73 (q, J＝7.4 Hz, 2H, CH₂), 3.85 (s, 3H, OCH₃), 4.47 (s, 2H, CH₂), 6.94 (d, J＝8.0 Hz, 1H, C₆H₃), 7.33 (d, J＝8.0 Hz, 1H, C₆H₃), 7.42 (s, 1H, C₆H₃), 7.59 (d, J＝8.0 Hz, 2H, C₆H₄), 8.15 (d, J＝8.0 Hz, 2H, C₆H₄), 8.57 (s, 1H, NH), 10.20 (s, 1H, OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 167.3, 154.1, 152.4, 148.6, 147.1, 146.2, 145.1, 130.6, 125.3, 123.9, 123.3, 116.1, 111.2, 56.1, 36.2, 18.7, 11.2; MS (ESI) m/z: 412.11 [M－H]^－. Anal. calcd for C₁₉H₁₉N₅O₄S: C 55.20, H 4.63, N 16.94; found C 55.07, H 4.56, N 16.91.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基亚甲氨基)-5-乙基- 4H-1, 2, 4-三唑-3-(4-氰基苄基)硫醚(1k):白色固体, 收率55.9%. m.p. 157~159 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO- d₆) δ: 1.23 (t, J＝7.4 Hz, 3H, CH₃), 2.74 (q, J＝7.4 Hz, 2H, CH₂), 3.87 (s, 3H, OCH₃), 4.43 (s, 2H, CH₂), 6.96 (d, J＝8.0 Hz, 1H, C₆H₃), 7.35 (d, J＝8.0 Hz, 1H, C₆H₃), 7.44 (s, 1H, C₆H₃), 7.52 (d, J＝7.8 Hz, 2H, C₆H₄), 7.77 (d, J＝7.8 Hz, 2H, C₆H₄), 8.57 (s, 1H, NCH), 10.17 (s, 1H, OH); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 167.2, 154.1, 152.4, 148.6, 145.2, 143.9, 132.7, 130.4, 125.3, 123.4, 119.2, 116.1, 111.2, 110.5, 56.1, 36.5, 18.7, 11.3; MS (ESI) m/z: 392.10 [M－H]^－. Anal. calcd for C₂₀H₁₉N₅O₂S: C 61.05, H 4.87, N 17.80; found C 61.02, H 4.94, N 17.77.

3.2.2 目标化合物2b~2c的合成

将1.0 mmol 1b或1c, 25 mmol硼氢化钠溶于16 mL甲醇溶液, 室温反应0.8~1 h, 减压除去溶剂, 乙酸乙酯萃取(30 mL×2), 饱和食盐水洗涤, 无水硫酸钠干燥, 过滤, 减压除去乙酸乙酯, 重结晶[V(石油醚):V(二氯甲烷)＝2:1]得化合物2b和2c.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基甲氨基)-5-乙基- 4H-1, 2, 4-三唑-3-乙硫醚(2b):白色固体, 收率82.0%. m.p. 138~139 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 1.11 (t, J＝7.6 Hz, 3H, SCH₂CH₃), 1.32 (t, J＝7.2 Hz, 3H, CH₂CH₃), 2.50~2.42 (m, 2H, CH₂), 3.15~3.10 (m, 2H, SCH₂), 3.72 (s, 3H, OCH₃), 3.96 (d, J＝4.4 Hz, 2H, NHCH₂), 6.71~6.61 (m, 3H, C₆H₃), 6.77 (s, 1H, NH), 8.96 (s, 1H, OH); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 157.1, 150.4, 147.8, 146.7, 127.6, 122.3, 115.7, 113.9, 56.0, 54.7, 26.5, 17.7, 15.4, 11.5; MS (ESI) m/z: 307.06 [M－H]^－. Anal. calcd for C₁₄H₂₀N₄O₂S: C 54.52, H 6.54, N 18.17; found C 54.54, H 6.56, N 18.14.

(E)-4-(4-羟基-3-甲氧基苯基甲氨基)-5-乙基-4H- 1, 2, 4-三唑-3-丙硫醚(2c):白色晶体, 收率81.0%. m.p. 139~142 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 1.00 (t, J＝7.6 Hz, 3H, SCH₂CH₂CH₃), 1.14 (t, J＝7.6 Hz, 3H, CH₂CH₃), 1.72 (q, J＝7.2 Hz, 2H, CH₂CH₃), 2.51~2.45 (m, 2H, SCH₂CH₂CH₃), 3.13 (t, J＝7.2 Hz, 2H, SCH₂), 3.75 (s, 3H, OCH₃), 4.00 (d, J＝4.4 Hz, 2H, NHCH₂), 6.74~6.64 (m, 3H, C₆H₃), 6.80 (s, 1H, NH), 9.02 (s, 1H, OH); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 157.1, 150.5, 147.8, 146.7, 127.6, 122.3, 115.7, 113.9, 56.0, 54.7, 40.5 (d, J＝20.7 Hz), 40.4~40.3, 40.1 (d, J＝17.7 Hz), 40.0, 39.8, 39.6, 39.4, 34.0, 23.0, 17.7, 13.5, 11.5; MS (ESI) m/z: 320.88 [M－H]^－. Anal. calcd for C₁₅H₂₂N₄O₂S: C 55.88, H 6.88, N 17.38; found C 55.84, H 6.83, N 17.41.

3.3 化合物1c的单晶测定

将化合物1c溶于无水乙醇, 微孔滤膜过滤, 滤液置于安静的环境中, 室温下挥发结晶, 得到无色块状晶体.挑选0.29 mm×0.24 mm×0.20 mm大小的单晶, 使用Bruker AXS SMART 1000 CCD X单晶衍射仪, Mo kα (λ＝0.71073)光源测定晶体结构, 在273(2) K下以ω-ψ扫描方式收集数据.然后运用Bruker的SAINTPLUS程序^[32]将数据还原, 同时运用SADABS程序^[33]进行经验吸收校正.应用SHELXS-97和SHELXL-97程序^[34]直接法解析和精修结构.所有的非氢原子采用全矩阵最小二乘法进行结构精修.所有非氢原子都做各向异性精修.理论加氢, 氢原子各向同性热参数修正.

3.4 目标化合物的NA抑制活性测定

用NA的特异性荧光底物2'-(4-甲基伞形酮基)-α-D- N-乙酰神经氨酸(MUNANA; Sigma)来测定NA活性.分别用365和460 nm的激发和发射波长测定NA与MUNANA作用后释放的4-甲基-贝伐酮的荧光.荧光程度越高, 则NA活性越强, 根据荧光强度的变化计算化合物对NA活性的抑制率.

将10 µL待测化合物溶液(40 μg/mL), 30 µL一定浓度的神经氨酸酶液[A/PR/8/34 (H1N1)]和10 µL 33 mmol/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(pH 6.5)加入96孔板中, 混合均匀, 37 ℃条件下孵育15 min.加入10 µL 4 mmol/L的二氯化钙溶液、10 µL 20 mmol/L底物MUNANA, 混合均匀, 37 ℃孵育30 min.加入150 µL终止液(氢氧化钠溶于质量分数为83%的乙醇水溶液中, 配置成14 mmol/L的终止液), 反应终止.在激光波长360 nm和发射波长450 nm的条件下, 测定荧光强度.根据荧光强度的减少量计算化合物对NA活性的抑制率.将抑制率大于50%的化合物进行三次复筛, 根据复筛结果计算化合物的IC₅₀值.流感病毒A/PR/8/34 (H1N1)神经氨酸酶由中国疾病预防控制中心提供, 葛兰素公司的扎那米韦(zanamivir)为阳性对照药.

3.5 分子对接

为深入研究活性化合物与NA的相互作用情况, 将NA抑制活性最佳的化合物1b与NA (PDA entry: 3TI6)的活性位点进行分子对接.选用LeDock (http://www.lephar.com/)软件进行分子对接, 其结合位点设置为X_min＝－37.4, X_max＝－19.8, Y_min＝4.0, Y_max＝21.5, Z_min＝12.0, Z_max＝32.2.对接结果用PyMOL (http://pymol. sourceforge.net/)软件显示并作图.

致谢: 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所提供生物活性测定. 辅助材料(Supporting Information) 化合物1a~1k和2b~2c的¹H NMR、¹³C NMR谱图和1c晶体的结构数据.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal. cn/ )上下载.

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图 1 1, 2, 4-三唑硫酮(硫醇或硫醚)衍生物

Figure 1 1, 2, 4-Triazolethione (thiol or thioether) derivatives

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图 2 化合物E与A/H1N1-NA (3TI6)的分子对接模型

Figure 2 Interaction models of E with A/H1N1-NA (3TI6)

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图式 1 目标化合物1和2的设计

Scheme 1 Design strategy of the target compounds 1 and 2

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图式 2 目标化合物1和2的合成路线

Scheme 2 Synthetic routes of target compounds 1 and 2

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图 3 化合物1c的单晶结构图

Figure 3 Single crystal structure of compound 1c

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图 4 化合物1c的晶体中的分子间氢键作用图

Figure 4 Intermolecular hydrogen bonding in the crystal of compound 1c

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图 5 化合物1b和2b与A/H1N1-NA (3TI6)的分子对接模型

Figure 5 Interaction models of 1b and 2b with A/H1N1-NA (3TI6)

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表 1 化合物1c的氢键[nm和(°)]

Table 1. Hydrogen bonds [nm and (°)] of compound 1c

D—H…A	d(D—H)	d(H…A)	d(D…A)	∠(DHA)
O(1)—H(1)…N(11)	0.0820	0.1870	0.2687	173.28
O(3)—H(3)…N(15)	0.0820	0.1936	0.2750	171.45
O(5)—H(5A)…N(8)	0.0820	0.1972	0.2721	151.48
O(7)—H(7)…N(4)	0.0820	0.1954	0.2699	150.71

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表 2 化合物1a~1k和2b~2c的神经氨酸酶(H1N1)抑制活性

Table 2. Neuraminidase (H1N1) inhibitory activities of compounds 1a~1k and 2b~2c

Compd.	R	Inhibition rate/ % (40 μg/mL）	IC₅₀/(μg•mL^－1)
1a	CH₃	76.11±2.41	10.6±2.58
1b	C₂H₅	79.11±0.64	6.86±2.08
1c	n-Pr	84.05±1.03	9.10±1.56
1d	i-Pr	74.34±1.39	14.58±2.54
1e	n-C₄H₉	78.03±5.48	10.81±5.14
1f	sec-C₄H₉	57.47±8.95	28.2±11.26
1g	n-C₅H₁₁	74.48±4.96	13.89±4.82
1h	CH(CH₂CH₃)₂	73.01±1.19	20.12±1.55
1i	CH₂COOH	81.07±4.66	12.57±3.47
1j	4-O₂NC₆H₄CH₂	45.00±7.57	—
1k	4-NCC₆H₄CH₂	67.37±1.43	20.15±1.1
2b	C₂H₅	16.19±11.04	—
2c	n-Pr	16.59±10.71	—
E	—	75.81±2.24	14.97±0.70
F	—	79.79±0.71	14.68±0.49
Zanamivir	—	87.54±3.40^a	0.000047±0.000007
^a The concentration is 0.004 μg/mL.

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142