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• 多环特特拉姆酸大环内酰胺(polycyclic tetramate macrolactams, PoTeMs)是一类含有多环体系和特特拉姆酸(tetramate)结构单元的大环内酰胺类化合物, 通常具有显著的生物活性, 包括抗菌、抗肿瘤、抗溃疡和抗虫等^[1~6].从生物合成的角度, PoTeMs根据多环体系不同分为5/5/6三环(如HSAFs、frontalamides和pactami- des)^{[5, 7, 8]}、5/6/5三环(ikarugamycins和clifednamides)^{[9, 10]}和5/5双环(alteramides和combamides)^{[4, 11]}三类.此外, PoTeMs还含有多样的氧化后修饰, 通常由位于基因簇内的细胞色素P450酶催化形成^{[4, 12]}.目前, 已报道了7个含有细胞色素P450氧化酶基因的PoTeMs基因簇及其编码产物^{[3, 4, 6, 7, 12~14]}, 通过对这些含有氧化修饰的PoTeMs的结构分析, 我们发现氧化修饰主要集中在多环体系并可同时修饰多个位点(图 1).前期研究表明PoTeMs生物合成基因簇具有简洁和高度保守的特点, 通过对参与多环体系和氧化后修饰反应的氧化还原酶的进化分析, 可以预测未知PoTeMs基因簇编码产物的多环体系和可能的氧化修饰类型.

  图 1

  

  图 1.  部分含有氧化修饰的已知PoTeM类化合物的基因簇和化学结构

  Figure 1.  Biosynthetic gene clusters and chemical structures of known oxidized PoTeMs

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  链霉菌S001是本实验室从青岛崂山土样中分离获得的一株链霉菌, 其代谢产物较少, 且具有较高的接合转移效率, 适于进行外源基因簇的异源表达.前期, 我们在链霉菌S023的基因组中发现了可能编码clifednamides生物合成的基因簇cft_S023, 该基因簇含有保守的PoTeM类核心基因, 分别负责多烯前体和5/6/5多环体系形成, 以及C3位羟基化和其它位点的氧化后修饰反应.为了获得新颖的clifednamides衍生物, 我们将替换了组成型启动子的cft_S023基因簇在链霉菌S001中进行异源表达, 意外提高了链霉菌S001自身PoTeM基因簇mtm编码产物的产量.本研究通过对链霉菌S001重组菌株S001-PoTeM_S023的10 L固体平板发酵和产物提取分离, 获得了1个新PoTeM类化合物monta- mide A (1); 并进行了抗菌和细胞毒活性测定, 结果显示化合物1无抗菌活性, 对人肺癌细胞A549有较弱的细胞毒性.

  1.   结果与讨论

  前期, 将可能编码新5/6/5三环PoTeMs的生物合成基因簇cft_S023导入链霉菌S001中获得重组菌株S001-PoTeM_S023 (未发表), 对差异代谢产物分离鉴定过程中意外发现了一个新的5/5/6三环PoTeM类化合物1 (图 2B, 2C), 化合物1具有三环体系PoTeMs特征的紫外吸收(图 2D).为了明确化合物1的生物合成基因簇, 对链霉菌S001的基因组序列进行了生物信息学分析, 发现其中含有一个PoTeMs生物合成基因簇mtm(图 2A, accession no. MN817126). Mtm基因簇含有负责PoTeMs多烯骨架合成的PKS-NRPS合酶基因mtmA, 负责多环体系合成的氧化还原酶基因mtmB、mtmC和mtmD, 负责氧化后修饰的细胞色素P450基因mtmE和负责3位羟基化修饰的羟基化酶基因mtmF(图 2A).此外, 对参与多环体系合成的氧化还原酶MtmB-D进行了进化分析, 发现mtm基因簇可能编码含有5/5/6三环体系的PoTeMs, 其中MtmC负责第一个五元环的形成, MtmB负责第二个五元环的形成, MtmD负责第三个六元环的形成.此外, 对负责氧化后修饰的细胞色素P450酶MtmE的进化分析发现, 其修饰区域和类型可能与SGR810类似, 因此, 推测mtm基因簇编码了化合物1的合成.对于化合物1在重组菌株S001- PoTeM_S023中产量提高的原因, 我们推测可能是由于含有组成型启动子的cft_S023基因簇的引入提供了大量PoTeMs类化合物合成所需的多烯前体, mtm基因簇中负责5/5/6三环体系合成的mtmB-D基因和负责C16位羟基化修饰的mtmE基因存在一定表达, 从而利用多烯前体合成了化合物1.

  图 2

  

  图 2.  (A) 链霉菌S001中mtm基因簇组成示意图、(B) S001野生型和重组菌株S001-PoTeM_S023代谢产物的高效液相图、(C)化合物1的高分辨质谱、(D)化合物1的紫外吸收光谱

  Figure 2.  (A) Genetic organization of mtm gene cluster in Streptomyces sp. S001, (B) HPLC profiles of the metabolites of S001 wild type and recombinant strain S001-PoTeM_S023, (C) HRMS spectrum of 1, and (D) UV spectrum of 1

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  化合物1为淡黄色粉末状固体, m.p. 151 ℃; [α]_D²⁵+120.1 [c 1.00, V(CH₃OH):V(CH₂Cl₂)=1:1]; UV-vis (CH₃CN) λ_max: 220, 320 nm; IR (film) ν: 3340, 2925, 2866, 1651, 1596, 1464, 1234, 1025, 1002, 859, 827, 764, 700 cm^-1; 高分辨质谱(HR-ESIMS)测得化合物1的分子式为C₂₉H₄₀O₆N₂ (calcd for C₂₉H₄₀O₆N₂Na[M+Na]⁺ 535.2784, found 535.2775). 1D和2D-NMR数据分析发现化合物1与已知化合物3-deOH-HSAF结构类似(表 1), 具有相同的5/5/6三环体系.不同之处在于化合物1的C16连有一个羟基, 使化学位移向低场移动至δ 85.8^[15]. HMBC数据显示H-2与C-4/C-27、H-8与C-7/C- 10、H-9与C-7/C-11、H-12与C-20、H-13与C-19、H-15与C-13/C-17/C-18、H-17与C-19、H-21与C-11、H-23与C-22/C-25、H-24和C-22/C-25、H-29与C-16/C-18、H-30与C-15/C-17、H-31与C-16/C-30相关. ¹H-¹H COSY数据显示H-2/H-3、H-4/H-5/H-6、H-8/H-9、H-15/H-14/ H-13/H-12/H-11/H-22/H-21/H-20/H-19/H-18/H-17/H-29、H-12/H-19、H-14/H-18、H-22/H-23/H-24相关, 进一步确定了化合物1的平面结构(图 3). ¹H NMR谱显示化合物1中两个双键的偶合常数分别为J_{8, 9}=11.0 Hz和J_{23, 24}=15.1 Hz, 表明双键构型为8Z和23E(表 1). ROE- SY数据显示H-12/H-22/H-14/Me-31/H-18/H-20和Me- 29/H-18相关, 显示它们在5/5/6三环体系同侧; H-17/ H-19/H-11的相关信号显示它们在5/5/6三环体系的另一侧.此外, 由于化合物1与3-deOH-HSAF的电子圆二色(ECD)图谱非常相似^[16], 最终确定了化合物1的绝对构型为2S, 11R, 12S, 14R, 16S, 17S, 18S, 19S, 20R, 22R, 命名为montamide A.

  表 1

  

  表 1  化合物1的¹H NMR和¹³C NMR数据(600/125 MHz)

  Table 1.  ¹H NMR and ¹³C NMR data for compound 1 (600/125 MHz)

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  Position	1H NMR δ (J/Hz)	13C NMR δ
  1		196.0 s
  2	4.00 (q, 6.8)	66.2 d
  3	1.23~1.07 (m)	29.5 t
  4	1.21~1.08 (m)	20.9 t
  5	3.25~3.19 (m) 2.33~2.28 (m)	38.3 t
  6	7.67 (s)
  7		166.0 s
  8	5.72 (d, 11.0)	125.0 d
  9	5.84 (t, 10.9)	138.8 d
  10	3.34~3.30 (m) 1.90~1.83 (m)	28.6 t
  11	1.13~1.08 (m)	44.2 d
  12	1.60~1.55 (m)	48.2 d
  13	1.93~1.88 (m) 0.79~0.75 (m)	37.9 t
  14	2.46~2.41 (m)	40.5 d
  15	1.77~1.74 (m) 1.10~1.06 (m)	45.5 t
  16		85.8 s
  17	1.37~1.35 (m)	49.5 d
  18	1.88~1.83 (m)	56.6 d
  19	1.02~0.97 (m)	59.9 d
  20	3.20~3.16 (m)	73.2 d
  21	1.71~1.69 (m) 1.14~1.08 (m)	43.4 t
  22	1.98~1.92 (m)	44.8 d
  23	6.18~6.14 (m)	143.6 d
  24	7.36 (d, 15.1)	129.5 d
  25		181.1 s
  26
  27		176.8 s
  28
  29	0.92 (d, 6.6)	12.6 q
  30	1.45~1.41 (m) 1.23~1.18 (m)	31.4 t
  31	0.79 (t, 7.3)	9.6 q

  图 3

  

  图 3.  化合物1的化学结构和关键¹H-¹H COSY、HMBC和NOESY相关信号

  Figure 3.  Chemical structure of 1 and the selected ¹H-¹H COSY, HMBC and NOESY correlations of 1

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  采用滤纸片法测定了化合物1的抗菌活性, 结果显示化合物1 (20 μg/滤纸片)对6株细菌(变形杆菌Proteus- bacillus vulgaris CPCC 160013、大肠杆菌E. coli DH5α、沙门氏菌Salmonella typhimurium UK-1 χ8956、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA01、耻垢分枝杆菌Mycobacterium smegmatis MC²155和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 25923)和5株真菌(稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、芦笋茎枯病菌Phomopsis asparagi、大豆炭疽病菌Colletotrichum truncatum、胶孢炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和白色念珠菌Candida albican SC 5314)均无抑菌活性.此外, 采用噻唑蓝(MTT)法测定了化合物1对3株肿瘤细胞(人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺癌细胞A549和人肝癌细胞SMMC-7721)的细胞毒活性, 结果表明化合物1对人肺癌细胞A549有较弱的细胞毒性(表 2).

  表 2

  

  表 2  化合物1的细胞毒性[IC₅₀/(μmol•L^-1)]

  Table 2.  Cytotoxic activity of compound 1 [IC₅₀/(μmol•L^-1)]

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  Number	MDA-MB-231	A549	SMMC-7721
  Compound 1	＞20	22.64±2.36	＞20
  多柔比星	1.192±0.12	0.80±0.15	0.59±0.04

  化合物1与3-deOH HSAF结构类似, 区别仅在于C16位羟基.前期研究显示3-deOH HSAF具有较弱的抗真菌活性和显著的细胞毒性, 其中对人肺癌细胞A549的IC₅₀为(0.95±0.09) μmol•L^{-1 [16]}, 而化合物1对同一细胞株的毒性却显著降低, 提示C16位为细胞毒活性关键位点.此外, 前期研究发现HSAF及其同系物alteramide B可能通过抑制白色念珠菌(Candida albicans) β微管蛋白(β-tubulin)聚合引起细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平上升, 最终导致白色念珠菌凋亡^{[17, 18]}.因此, 我们推测HSAF及其同系物的细胞毒活性可能也是由于干扰了肿瘤细胞的骨架形成, C16位的不同取代可能影响该类化合物与微管蛋白的相互作用, 从而表现出细胞毒活性差异.

  通过与已报道PoTeMs基因簇的比对分析, 预测了mtm基因簇中各基因的功能, 推测了montamide A可能的生物合成途径, 即MtmA催化多烯前体合成, MtmC催化第一个五元环合成, MtmB催化第二个五元环形成, MtmD催化第三个六元环形成, 最后MtmE催化C16位的羟基化修饰形成终产物montamide A(图 4).需要说明的是, MtmE催化C16位羟基化的修饰反应也可能在第二个五元环或第三个六元环形成之前.

  图 4

  

  图 4.  化合物1可能的生物合成途径

  Figure 4.  Proposed biosynthetic pathway of compound 1

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  2.   结论

  从链霉菌S001重组菌株S001-PoTeM_S023的10 L YMG固体发酵产物中分离鉴定了1个新PoTeM类化合物montamide A (1), 并定位了其生物合成基因簇mtm, 提出了可能的生物合成途径.此外, 测定了化合物1的抗细菌、抗真菌和细胞毒活性, 结果显示化合物1在20 μg载样量下对6株细菌和5株真菌无明显抑制活性, 对人肺癌细胞A549有较弱的细胞毒性, C16位为细胞毒活性关键位点.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  核磁共振仪为Bruker公司的DRX-600;质谱仪为Bruker公司的BioESI-Q-TOF; 高效液相色谱系统为Thermo Scientific公司的DIONEX UlitMate 3000;中压液相为Buchi公司的C-615;旋转蒸发仪为Buchi公司的R-100;反相硅胶填料RP18购买自Merck公司; 凝胶填料为GE Healthcare公司的Sephadex LH-20;各种溶剂为分析纯或色谱纯.

  3.2   实验方法

  3.2.1   发酵提取及产物的分离纯化

  采用YMG (Yeast Extract 4 g/L, Malt Extract 10 g/L, Glucose 4 g/L, PH 7.4)固体琼脂平板对菌株S001-

  PoTeM_S023进行了10 L扩大培养(30 ℃, 13 d).发酵培养基连同菌体切成小块, 乙酸乙酯室温浸泡提取三次(每次10 L, 提取16~20 h), 合并三次浸提液25 ℃减压浓缩至干得发酵粗提物.发酵粗提物经乙酸乙酯-水(V: V=1:1)萃取三次, 合并有机相, 25 ℃减压浓缩至干得乙酸乙酯提取物.乙酸乙酯提取物经凝胶柱层析[SephadexLH-20, 100 g, V(CH₃OH):V(CH₂Cl₂)=2:1]分离得到组分a1~a3.组分a2 (166.1 mg)经凝胶柱层析[SephadexLH-20, 60 g, V(CH₃OH):V(CH₂Cl₂)=2:1]分离得到组分a2a和a2b.组分a3经凝胶柱层析[SephadexLH-20, 60 g, V(CH₃OH):V(CH₂Cl₂)=2:1]分离得到组分a3a~a3c.组分a1 (95.8 mg), a2a和a3c合并后经中压液相柱层析(RP-18, 25 g, 30% CH₃CN)洗脱得组分Ⅰ.组分a2b与a3a合并后经中压液相层析(RP-18, 25 g, 30% CH₃CN)洗脱得组分Ⅱ-Ⅲ.组分Ⅰ, Ⅱ和Ⅲ分别经高效液相色谱(YMC Pack Pro C18, 10 mm×150 mm, 5 µm, 36% CH₃CN)制备得化合物1 (9 mg, t_R 7.06 min).

  3.2.2   抗菌活性测定

  采用滤纸片法进行化合物1的抗细菌活性测定.将保存在试管斜面的6株细菌指示菌:沙门氏菌(Salmonella typhimurium UK-1 χ8956)、变形杆菌(Proteusbacillus vulgaris CPCC 160013)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25923)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa PA01)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis MC² 155)、大肠杆菌(E. coli DH5α)分别接种到2 mL液体LB培养基(Tryptone 10 g/L, Yeast Extract 5 g/L, NaCl 5 g/L, pH 7.0)中, 放入摇床震荡培养1 d (250 r/min, 30 ℃).将活化后的待测菌液加入尚未凝固的LB固体琼脂培养基中(指示菌密度约10⁵个/mL)制成细菌指示菌平板.将载药滤纸片(直径0.5 cm, 化合物1为20 μg/滤纸片, 变形杆菌的阳性对照为卡那霉素200 μg/滤纸片, 其它指示菌的阳性对照为氨苄青霉素400 μg/滤纸片)均匀贴于指示菌平板表面, 37 ℃培养24 h后观察抑菌圈直径.

  采用琼脂块法进行化合物1的抗真菌活性测定.用打孔器在PDA固体琼脂(马铃薯200 g/L, 葡萄糖20 g/L, 琼脂15 g/L, pH 7.2)平板中心取出5 mm琼脂块, 再用打孔器分别取同等大小的5株真菌指示菌菌块:胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、芦笋茎枯病菌(Phomopsis asparagi)、白色念珠菌(Candida albican SC5314)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、大豆炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)放入空白PDA固体琼脂平板中心制成真菌指示菌平板.将载药滤纸片(直径0.5 cm, 化合物1为20 μg/滤纸片, 阳性对照为两性霉素100 μg/滤纸片)均匀贴于指示菌平板表面, 30 ℃倒置培养2~3 d后观察抑菌圈直径.

  3.2.3   细胞毒性测定

  采用噻唑蓝(MTT)法测定了化合物1对肿瘤细胞的抑制活性.将3株肿瘤细胞(人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺癌细胞A549和人肝癌细胞SMMC-7721)分别接种于96孔板, 细胞密度为3×10³~4×10³/孔, 置于细胞培养箱(5% CO₂, 37 ℃)培养至细胞贴壁后, 加入化合物1和阳性对照多柔比星梯度稀释, 阴性对照为相同体积的二甲基亚砜(DMSO), 同一浓度的药物设3个重复.加药培养48 h后, 每孔加入20 μL MTT (5 mg/mL), 继续培养4 h后去上清, 每孔加入150 μL DMSO, 震荡10 min, 用酶标仪在570 nm下检测各孔的OD值, 并用Prism 5.0计算IC₅₀值.实验重复3次, 将3次独立计算的IC₅₀值进行统计, 结果用均数±标准值(S.D)表示.

  辅助材料(Supporting Information)   Mtm基因簇所含基因的功能分析及进化分析, 化合物1的一维和二维核磁谱图、电子圆二色谱图和红外谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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  图 1  部分含有氧化修饰的已知PoTeM类化合物的基因簇和化学结构

  Figure 1  Biosynthetic gene clusters and chemical structures of known oxidized PoTeMs

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  图 2  (A) 链霉菌S001中mtm基因簇组成示意图、(B) S001野生型和重组菌株S001-PoTeM_S023代谢产物的高效液相图、(C)化合物1的高分辨质谱、(D)化合物1的紫外吸收光谱

  Figure 2  (A) Genetic organization of mtm gene cluster in Streptomyces sp. S001, (B) HPLC profiles of the metabolites of S001 wild type and recombinant strain S001-PoTeM_S023, (C) HRMS spectrum of 1, and (D) UV spectrum of 1

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  图 3  化合物1的化学结构和关键¹H-¹H COSY、HMBC和NOESY相关信号

  Figure 3  Chemical structure of 1 and the selected ¹H-¹H COSY, HMBC and NOESY correlations of 1

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  图 4  化合物1可能的生物合成途径

  Figure 4  Proposed biosynthetic pathway of compound 1

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  表 1  化合物1的¹H NMR和¹³C NMR数据(600/125 MHz)

  Table 1.  ¹H NMR and ¹³C NMR data for compound 1 (600/125 MHz)

  Position	1H NMR δ (J/Hz)	13C NMR δ
  1		196.0 s
  2	4.00 (q, 6.8)	66.2 d
  3	1.23~1.07 (m)	29.5 t
  4	1.21~1.08 (m)	20.9 t
  5	3.25~3.19 (m) 2.33~2.28 (m)	38.3 t
  6	7.67 (s)
  7		166.0 s
  8	5.72 (d, 11.0)	125.0 d
  9	5.84 (t, 10.9)	138.8 d
  10	3.34~3.30 (m) 1.90~1.83 (m)	28.6 t
  11	1.13~1.08 (m)	44.2 d
  12	1.60~1.55 (m)	48.2 d
  13	1.93~1.88 (m) 0.79~0.75 (m)	37.9 t
  14	2.46~2.41 (m)	40.5 d
  15	1.77~1.74 (m) 1.10~1.06 (m)	45.5 t
  16		85.8 s
  17	1.37~1.35 (m)	49.5 d
  18	1.88~1.83 (m)	56.6 d
  19	1.02~0.97 (m)	59.9 d
  20	3.20~3.16 (m)	73.2 d
  21	1.71~1.69 (m) 1.14~1.08 (m)	43.4 t
  22	1.98~1.92 (m)	44.8 d
  23	6.18~6.14 (m)	143.6 d
  24	7.36 (d, 15.1)	129.5 d
  25		181.1 s
  26
  27		176.8 s
  28
  29	0.92 (d, 6.6)	12.6 q
  30	1.45~1.41 (m) 1.23~1.18 (m)	31.4 t
  31	0.79 (t, 7.3)	9.6 q

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  表 2  化合物1的细胞毒性[IC₅₀/(μmol•L^-1)]

  Table 2.  Cytotoxic activity of compound 1 [IC₅₀/(μmol•L^-1)]

  Number	MDA-MB-231	A549	SMMC-7721
  Compound 1	＞20	22.64±2.36	＞20
  多柔比星	1.192±0.12	0.80±0.15	0.59±0.04

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