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• 小分子生物硫醇, 如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和还原型谷胱甘肽(GSH)是生命体内重要的硫醇分子, 因其在多种生理和病理过程中的重要作用而倍受关注^[1~3].其中, 半胱氨酸是合成谷胱甘肽的前体分子, 参与蛋白质合成, 其浓度异常会诱发肝功能损伤、引起发育迟缓^{[4, 5]}; 人体内同型半胱氨酸水平过高可能增加罹患阿尔茨海默症、高同型半胱氨酸血症和妊娠并发症等疾病的风险^{[6, 7]}; 还原型谷胱甘肽是体内浓度最高的硫醇分子(1×10^-3~5×10^-3 mol/L), 对维持细胞内氧化还原稳态平衡具有重要作用, 内源性谷胱甘肽失调可导致肝硬化、神经退行性疾病、艾滋病和癌症等^{[8, 9]}.基于小分子生物硫醇的重要性, 开发一种能够对其进行实时可视化检测的工具, 将对更加深入理解生物硫醇的生物功能及对与其相关疾病的诊断, 具有重要的意义.

  1981年, Sippel等^[10]报道了首例利用巯基与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应, 实现荧光检测小分子硫醇的荧光探针.基于荧光探针技术选择性好、灵敏度高、可进行高通量筛选、对生物样本无破坏性损伤及易于实现对生物样本内硫醇实时原位检测等优点, 以及小分子探针结构设计灵活、制备简单的优势, 大量优秀的荧光探针被开发出来^[11~14].这些探针主要利用巯基的亲核性以及硫醇巯基与氨基的协同反应性, 对硫醇进行选择性识别, 部分探针分子能实现对三种硫醇分子选择性区分.其中, 基于迈克尔加成反应的探针具有响应迅速的特点, 硝基具有强吸电子能力, 硝基烯烃可以作为迈克尔加成的受体^[15]. 2011年, 郭炜课题组^[16]报道了香豆素3-位修饰硝基烯烃结构的荧光探针R1(图 1), 实现了硫醇的选择性检测.氟硼二吡咯(BODIPY)是一类光谱峰宽窄和发射波长适中、荧光量子产率高、光稳定性好的荧光染料分子. 2012年, 焦丽娟课题组^[17]报道了BODIPY 3-位修饰硝基烯烃结构的打开型荧光探针R2, 该探针可以选择性检测Cys/Hcy.最近, 阴彩霞课题组^[18]报道了BODIPY 2-位修饰硝基烯烃结构的荧光探针R3, 发现探针对GSH/Hcy的比率荧光响应能力优于Cys. 2017年, 曹德荣课题组^[19]设计合成了吡咯并吡咯二酮修饰硝基烯烃的荧光探针R4, 该探针可以与GSH发生迈克尔加成反应, 与Cys/Hcy发生亲核取代-分子内重排反应, 从而选择性区分GSH和Cys/Hcy.上述研究工作结果表明, 荧光探针结构中硝基烯烃所处环境(空间位阻和电子效应)会对硫醇选择性产生影响.

  图 1

  

  图 1.  已报道硝基烯烃基硫醇荧光探针R1~R4

  Figure 1.  Structures of the reported nitroolefin based thiol fluorescent probes R1~R4

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  以BODIPY为荧光团, 在其8位苯环的对位引入硝基烯烃作为巯基识别基团, 经过三步简单有机合成, 得到打开型硫醇荧光探针1 (Scheme 1), 测试了探针对硫醇的选择性和灵敏性, 利用密度泛函理论计算探针及与硫醇反应后产物的激发态轨道能量, 研究了探针对细胞和斑马鱼体内硫醇的共聚焦成像.

  图式 1

  

  图式 1.  探针1的合成路线

  Scheme 1.  Synthetic route of probe 1

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  1.   结果与讨论

  1.1   探针与硫醇反应的光谱研究

  为了研究探针与不同结构硫醇的反应性, 在PBS缓冲溶液(10×10^-3 mol/L, pH 7.4, 含体积分数为40%的CH₃CN)中依次加入探针(5×10^-6 mol/L)和硫醇分子(Cys/ Hcy/GSH, 150×10^-6 mol/L), 测试了探针溶液的紫外吸收光谱和荧光发射光谱变化.如图 2所示, 探针溶液在330和500 nm处显示两个明显的吸收峰.随着反应的进行, 330 nm处吸收峰强度逐渐减弱, 500 nm处吸收峰强度基本保持不变, 但位置发生微弱的蓝移, 这可能是硫醇巯基与硝基烯烃发生迈克尔加成反应, 破坏了探针的共轭结构.从330 nm处的紫外强度变化来看, 三种硫醇分子与探针的反应速度大小依次为Cys＞Hcy＞GSH.

  图 2

  

  图 2.  探针1 (5×10^-6 mol/L)加入不同硫醇分子(150×10^-6 mol/L)后随时间变化的紫外可见吸收光谱

  Figure 2.  Time dependence of UV-Vis spectra of probe 1 (5× 10^-6 mol/L) with different thiols (150×10^-6 mol/L)

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  从探针的荧光光谱变化可以看出, 加入GSH后, 探针溶液的荧光逐渐增强, 紫外灯照射下可以看到明显的绿色荧光(图 3a插图).以510 nm处荧光强度(F_{510 nm})对反应时间(t)作图, 并分别计算硫醇与探针反应的准一级反应动力学常数, 可以看到, 三种硫醇分子与探针的反应速度大小依次为Cys (k_obs＝53.3×10^-3 s^-1)＞Hcy (k_obs＝28.9×10^-3 s^-1)＞GSH (k_obs＝4.63×10^-3 s^-1), 与探针和硫醇分子的紫外反应情况一致(图 3b), 这可能是三种硫醇pK_a不同(Cys约为8.30, Hcy约为8.87, GSH约为9.20)造成巯基亲核能力的差异^{[17, 20]}以及与三种硫醇分子量大小相关.在分别加入GSH、Cys和Hcy后, F_510nm达到基本饱和的时间分别为15, 1和3 min, 因此, 可以利用反应时间来区分GSH和Cys/Hcy.以上实验结果说明, 探针对硫醇响应迅速, 具有实时检测生物样本内硫醇的能力.

  图 3

  

  图 3.  (a) 探针1 (5×10^-6 mol/L)加入GSH (150×10^-6 mol/L)后随时间变化的荧光发射光谱和(b)探针1 (5×10^-6 mol/L)加入不同硫醇分子(150×10^-6 mol/L)后510 nm处荧光强度随时间变化情况

  Figure 3.  (a) Time dependence of emission spectra of probe 1 (5×10^-6 mol/L) with GSH (150×10^-6 mol/L) and (b) time dependence of emission intensities at 510 nm of probe 1 (5×10^-6 mol/L) with biothiols (150×10^-6 mol/L)

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  1.2   探针的选择性研究

  生物体内存在的多种活性分子可能对探针的专一性产生干扰.为了评价探针的选择性, 测试了探针对20种氨基酸、多种金属离子(Fe³⁺, Mg²⁺, Zn²⁺)和活性物种(H₂O₂, NaClO, KO₂, NO, HNO, H₂S)的荧光光谱响应.如图 4所示, 氨基酸、金属离子和活性物种等分析物均没有使探针溶液的荧光强度发生明显变化, H₂S引起小倍数的荧光响应, 只有GSH, Cys和Hcy三种硫醇可以显著增强探针溶液的荧光.说明探针对硫醇具有较强的专一性, 具有在生物系统中应用的潜在价值.

  图 4

  

  图 4.  探针1 (5×10^-6 mol/L)加入各种分析物(150×10^-6 mol/ L)后在510 nm处的荧光响应图

  1, Probe; 2, Ala; 3, Val; 4, Leu; 5, LIe; 6, Phe; 7, Trp; 8, Tyr; 9, Asn; 10, Lys; 11, Gin; 12, Met; 13, Ser; 14, Thr; 15, Pro; 16, His; 17, Arg; 18, Gly; 19, Asp; 20, Glu; 21, Hcy; 22, Cys; 23, c(GSH)＝150×10^-6 mol/L

  Figure 4.  Fluorescence enhancement at 510 nm of probe 1 (5×10^-6 mol/L) upon individual addition of different species

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  1.3   探针的灵敏性研究

  向探针溶液(5×10^-6 mol/L)中加入不同浓度的GSH (0~100×10^-6 mol/L), 测试了探针与不同浓度GSH反应15 min后的荧光发射光谱(图 5).如图 5a所示, 随着GSH浓度增大, 探针溶液的荧光逐渐增强.以F_510nm对GSH浓度作图可以看到, 在GSH浓度为30~100×10^-6 mol/L范围内, 探针溶液荧光强度具有较好的线性关系(线性相关系数R²＝0.9956), 利用3σ/k法^[21]计算探针对GSH的检测极限为11×10^-9 mol/L(图 5b).上述实验结果表明, 探针能够定量检测GSH浓度.

  图 5

  

  图 5.  (a) 探针1 (5×10^-6 mol/L)在不同浓度GSH (0~100×10^-6 mol/L)中的荧光光谱图和(b)探针510 nm处荧光强度与GSH浓度(0~10×10^-6 mol/L)的线性关系

  Linear relationship between the fluorescence intensity and GSH concentration (30~100×10^-6 mol/L) at 510 nm of the probe

  Figure 5.  (a) Fluorescence spectra of probe 1 (5×10^-6 mol/L) in the presence of GSH (0~100×10^-6 mol/L) and (b) linear relationship between the fluorescence intensity (F_510nm) and the concentration of GSH (0~10×10^-6 mol/L)

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  1.4   探针的识别机制研究

  为了验证探针的识别机理, 分别测试了探针与硫醇反应后的高分辨质谱.通过高分辨质谱发现, 探针与GSH/Cys/Hcy反应后, 分别出现了703.2504, 517.1877和531.2037的分子离子峰, 与相应产物的理论分子量相符([M+H]⁺ 703.2533, 517.1892, 531.2049).文献报道, 硝基烯烃结构中硝基可以通过PET效应淬灭荧光^[16~19].用密度泛函理论计算了探针与Cys反应前后化合物的激发态前线轨道能量, 如Scheme 2所示, 探针1中硝基通过d-PET淬灭荧光团BODIPY的荧光.结合探针与硫醇反应的紫外可见吸收光谱, 推测探针结构中的硝基烯烃与巯基发生迈克尔加成反应, 破坏了双键的共轭结构, 释放荧光团的荧光.

  图式 2

  

  图式 2.  探针1对硫醇的识别机制

  Scheme 2.  Sensing mechanism of probe 1 to thiols

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  1.5   生物成像研究

  在进行荧光成像前, 评价了探针的pH适用条件和细胞毒性.结果表明, 探针可在较大pH范围内使用, 在0~20×10^-6 mol/L浓度范围内, 探针对人宫颈癌HeLa细胞和人正常肾HEK293细胞均未表现出明显毒性.接下来, 探针被应用于HeLa细胞的荧光成像实验(图 6).如图 6a所示, HeLa细胞本身没有荧光; 加入探针(5×10^-6 mol/L)孵育30 min后, 可以看到明显的绿色荧光(图 6b); 预先加入内源硫醇清除剂N-乙基马来酰亚胺(NEM, 500×10^-6 mol/L)反应30 min, 再加入探针(5×10^-6 mol/L)孵育30 min, 细胞同样不显示荧光(图 6c).

  图 6

  

  图 6.  Sensing mechanism of probe 1 to thiols

  (a) Images of only HeLa cells, (b) images of only probe treated HeLa cells, (c) images of HeLa cells which was firstly treated with NEM, then incubated with probe. (1) Fluorescent fields, (2) merged images

  Figure 6.  Fluorescence confocal imaging of probe 1

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  斑马鱼作为模式生物, 也被用于荧光成像研究(图 7).斑马鱼本身并没有显示出绿色荧光, 加入探针(2× 10^-6 mol/L)孵育30 min后, 斑马鱼头部、脊索、卵黄和肠球等部分显示出明亮的绿色荧光.预加入巯基清除剂N-乙基马来酰亚胺(NEM, 500×10^-6 mol/L)孵育30 min, 再加入探针(2×10^-6 mol/L)孵育30 min后, 斑马鱼相应部位荧光明显减弱.以上荧光共聚焦成像实验结果表明, 探针具有良好的细胞渗透性, 可以用于细胞和斑马鱼内源硫醇分子的荧光成像研究.

  图 7

  

  图 7.  探针1的斑马鱼荧光共聚焦成像

  a: Images of only zebrafish, b: images of only probe treated zebrafish, c: images of zebrafish which was firstly treated with NEM, then incubated with probe. (1) Fluorescent fields, (2) merged images

  Figure 7.  Fluorescence confocal imaging of probe 1

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  2.   结论

  设计合成了一个利用硝基烯烃的PET效应调控荧光的硫醇荧光探针1.巯基与硝基烯烃发生迈克尔加成反应实现对硫醇的选择性检测.探针与硫醇响应迅速, 对GSH检测极限低至11×10^-9 mol/L.虽然探针1不能对不同硫醇分子选择性区分, 但是探针具有良好的细胞渗透性, 可以用于细胞和斑马鱼内源硫醇分子的荧光成像研究, 具有潜在的应用价值.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  600 MHz核磁共振仪(德国Brucker公司); Ionspec 7.0 T FTICR-MS质谱仪(德国Brucker公司); Hitachi F-7000型荧光光谱仪(日本Hitachi公司); UV-3600型分光光度计(美国Agilent公司).

  柱层析用硅胶(100~200目)及GF254薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂产品.所用试剂和溶剂均为国产分析纯, 无水试剂均按常规方法处理.

  3.2   实验方法

  3.2.1   探针1的合成

  参考文献[18, 22, 23]方法, 氮气保护下, 向500 mL圆底烧瓶中加入4-羟甲基苯甲醛(1.23 g, 9.0 mmol)、2, 4-二甲基吡咯(1.85 g, 19.4 mmol)和三滴冰乙酸, 将其溶解于300 mL脱气无水二氯甲烷, 室温反应过夜.加入二氯二氰基苯醌(2.04 g, 9.0 mmol), 室温搅拌1 h, 加入15 mL三乙胺, 继续搅拌15 min.将反应液降温至零度, 滴加15 mL三氟化硼乙醚溶液, 室温反应3 h.将反应液用饱和碳酸氢钠溶液中和, 二氯甲烷萃取, 饱和食盐水洗, 无水硫酸钠干燥, 柱层析分离[石油醚/乙酸乙酯, V: V＝1:1, R_f＝0.20], 得到832 mg 10-(4'-羟甲基苯基)氟硼荧(2).棕色固体, 产率25%. m.p. 193.8~195.2 ℃ (Lit.^[23] m.p. 194~195 ℃); ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 7.48 (d, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 7.27 (d, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 5.97 (s, 2H), 4.79 (s, 2H), 2.55 (s, 6H), 1.38 (s, 6H).

  将化合物2 (500 mg, 1.4 mmol)溶解于20 mL二氯甲烷中, 加入氯铬酸吡啶盐(600 mg, 2.8 mmol)和硫酸镁(120 mg), 室温反应4 h.将反应液用二氯甲烷萃取, 饱和食盐水洗, 无水硫酸钠干燥, 柱层析分离[二氯甲烷, R_f＝0.25], 得到350 mg 10-(4'-醛基苯基)氟硼荧(3).黄色固体, 产率70%. m.p. 174.6~177.2 ℃ (Lit.^[23] m.p. 174~176 ℃); ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 10.12 (s, 1H), 8.03 (d, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 7.52 (d, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 6.00 (s, 2H), 2.57 (s, 6H), 1.36 (s, 6H).

  将化合物3 (0.35 g, 3.00 mmol)溶解于10 mL硝基甲烷中, 加入乙酸铵(300 mg, 4.00 mmol), 90 ℃反应过夜.将反应液冷却至室温, 用二氯甲烷萃取, 饱和食盐水洗, 无水硫酸钠干燥, 柱层析分离[二氯甲烷/甲醇, V:V＝100/1, R_f＝0.20], 得到335 mg 10-(4'-硝基乙烯基)氟硼荧(1), 产率85%.红色固体, m.p. 233.4~235.4 ℃; ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ: 8.06 (d, J ＝ 12.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J ＝ 6.0 Hz, 2H), 7.67 (d, J ＝ 18.0 Hz, 1H), 7.42 (d, J ＝ 12.0 Hz, 1H), 6.00 (s, 2H), 2.56 (s, 6H), 1.39 (s, 6H); ¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃) δ: 156.2, 142.6, 139.6, 139.0, 138.0, 137.8, 130.9, 130.8, 129.7, 129.4, 121.5, 14.6, 14.5; HRMS calcd for C₂₁H₂₁BF₂N₃O₂ 396.1695, found 396.1686.

  3.2.2   光谱测试

  探针1用二甲基亚砜(DMSO)配制成2×10^-3 mol/L的母液, 测试浓度为5×10^-6 mol/L.选择性测试所用氨基酸为盐酸盐, 金属离子均为氯化物, 干扰物质测试浓度为150×10^-6 mol/L, 测试溶液为PBS缓冲溶液(10×10^-3 mol/L, pH 7.4, 含体积分数为40%的CH₃CN).室温条件下测试荧光光谱, 石英比色皿为1 cm×1 cm×4 cm, 激发波长为480 nm, 激发和发射狭缝宽度分别为2.5和5 nm.

  辅助材料(Supporting Information)  所有化合物的¹H NMR, ¹³C NMR以及HRMS谱图, 探针的pH适用性和毒性, 探针与硫醇反应后的高分辨质谱图谱等.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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  图 1  已报道硝基烯烃基硫醇荧光探针R1~R4

  Figure 1  Structures of the reported nitroolefin based thiol fluorescent probes R1~R4

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  图式 1  探针1的合成路线

  Scheme 1  Synthetic route of probe 1

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  图 2  探针1 (5×10^-6 mol/L)加入不同硫醇分子(150×10^-6 mol/L)后随时间变化的紫外可见吸收光谱

  Figure 2  Time dependence of UV-Vis spectra of probe 1 (5× 10^-6 mol/L) with different thiols (150×10^-6 mol/L)

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  图 3  (a) 探针1 (5×10^-6 mol/L)加入GSH (150×10^-6 mol/L)后随时间变化的荧光发射光谱和(b)探针1 (5×10^-6 mol/L)加入不同硫醇分子(150×10^-6 mol/L)后510 nm处荧光强度随时间变化情况

  Figure 3  (a) Time dependence of emission spectra of probe 1 (5×10^-6 mol/L) with GSH (150×10^-6 mol/L) and (b) time dependence of emission intensities at 510 nm of probe 1 (5×10^-6 mol/L) with biothiols (150×10^-6 mol/L)

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  图 4  探针1 (5×10^-6 mol/L)加入各种分析物(150×10^-6 mol/ L)后在510 nm处的荧光响应图

  Figure 4  Fluorescence enhancement at 510 nm of probe 1 (5×10^-6 mol/L) upon individual addition of different species

  1, Probe; 2, Ala; 3, Val; 4, Leu; 5, LIe; 6, Phe; 7, Trp; 8, Tyr; 9, Asn; 10, Lys; 11, Gin; 12, Met; 13, Ser; 14, Thr; 15, Pro; 16, His; 17, Arg; 18, Gly; 19, Asp; 20, Glu; 21, Hcy; 22, Cys; 23, c(GSH)＝150×10^-6 mol/L

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  图 5  (a) 探针1 (5×10^-6 mol/L)在不同浓度GSH (0~100×10^-6 mol/L)中的荧光光谱图和(b)探针510 nm处荧光强度与GSH浓度(0~10×10^-6 mol/L)的线性关系

  Figure 5  (a) Fluorescence spectra of probe 1 (5×10^-6 mol/L) in the presence of GSH (0~100×10^-6 mol/L) and (b) linear relationship between the fluorescence intensity (F_510nm) and the concentration of GSH (0~10×10^-6 mol/L)

  Linear relationship between the fluorescence intensity and GSH concentration (30~100×10^-6 mol/L) at 510 nm of the probe

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  图式 2  探针1对硫醇的识别机制

  Scheme 2  Sensing mechanism of probe 1 to thiols

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  图 6  Sensing mechanism of probe 1 to thiols

  Figure 6  Fluorescence confocal imaging of probe 1

  (a) Images of only HeLa cells, (b) images of only probe treated HeLa cells, (c) images of HeLa cells which was firstly treated with NEM, then incubated with probe. (1) Fluorescent fields, (2) merged images

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  图 7  探针1的斑马鱼荧光共聚焦成像

  Figure 7  Fluorescence confocal imaging of probe 1

  a: Images of only zebrafish, b: images of only probe treated zebrafish, c: images of zebrafish which was firstly treated with NEM, then incubated with probe. (1) Fluorescent fields, (2) merged images

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