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• 发现药物新骨架是药物化学研究中的核心问题之一^[1~4], 新骨架的发现, 不仅有助于开发出结构新颖的具有自主知识产权的新药, 还有可能发现新的药物作用机制, 从而发现更好的治疗药物.优势结构(Privileged structures)是指那些对多种药物靶标具有高亲和作用的分子骨架, 或者具有不同药理活性的药物分子之间所共有的分子结构片段^[5~8].优势结构的概念首先由哈佛大学的有机化学和药物化学大师Evans提出^[9].目前已经成为药物设计的重要理论指导^[10].由于优势结构单元类药性好, 且易于与生物体内的多种受体或蛋白等产生高亲和作用, 因此在药物化学研究中, 优势结构单元常常被用来作为药物或生物活性分子设计的起点.

  喹唑啉酮^[11~15]是非常重要的含氮杂环, 广泛存在于天然生物碱及生物活性分子中, 其中包括许多具有六元杂环并喹唑啉酮母核结构的喹唑啉酮衍生物(图 1).比如含有母核结构Ⅰ的天然产物mackinazolinone, leucomidines C等, 含有母核结构Ⅱ的天然产物fumiquina- zoline A, fumiquinazoline C, fumiquinazoline F, fumi- quinazoline Q, cottoquinazoline A, prelapatin B, protuboxepin E和glyantrypine等^{[16, 17]}.此外, 含有六元杂环并喹唑啉酮的具有代表性的生物活性化合物还包括图 1中的化合物A~C^[18].另外, 哒嗪也是药物分子设计中一个非常重要的优势结构单元(图 1), 广泛存在各种抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌及抗心血管等药物分子中^[19~21], 其衍生物的合成及活性研究也一直吸引着众多的有机化学和药物化学研究工作者.

  图 1

  

  图 1.  一些具有六元杂环并喹唑啉酮母核结构及哒嗪药物代表化合物

  Figure 1.  Representatives of bioactive compound with six- membered-fused quinazolinone nucleus or pyridazine drugs

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  鉴于这两个优势结构单元在生物活性分子设计上的重要应用及其衍生物的广泛生物活性, 我们拟将这两个优势结构单元进行组合, 获得一个具有六元杂环并喹唑啉酮的含氮杂环新骨架哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉酮, 然后再进一步研究具有这个含氮杂环新骨架的衍生物的生物活性, 拟从中发现药物新化学实体.为此我们发展了以邻氨基苯甲酸甲酯及酮类化合物等为主要原料, 以酰腙α位的碳负离子与酯基的分子内缩合反应为关键步骤, 共经4步反应合成得到了14个具有哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉酮骨架的化合物4a~4n (Scheme 1), 并对这些化合物的抗肿瘤活性、与DNA的相互作用等进行了研究.

  图式 1

  

  图式 1.  目标化合物的合成

  Scheme 1.  Synthesis of the target compounds

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  1.   结果与讨论

  1.1   目标化合物的合成

  酰肼2的合成参考文献[22]报道的方法进行了改动, 将草酸二乙酯的用量由原来的1 equiv.增加到1.2 equiv.在2与酮类化合物的缩合反应中, 我们以苯乙酮跟2的缩合为模型反应, 分别尝试了乙醇、乙酸、二氧六烷及甲苯等4种不同的溶剂在乙酸或对甲苯磺酸催化下进行缩合反应.薄层色谱(TLC)对反应的检测结果表明:在乙醇及乙酸中反应基本不能进行, 而在二氧六烷中反应进行很慢, 最后确定以甲苯为溶剂对甲苯磺酸为催化剂在回流分水条件下反应效果最好, 以36%~84%的收率得到了缩合产物.当酮类化合物是邻氟、邻氯或间甲氧基苯乙酮时, NMR谱图数据显示缩合产物为顺反异构体的混合物.

  酰腙3在碱性条件下发生缩合环化成化合物4是这一合成路线中的关键转化步骤.尝试了乙醇钠、叔丁醇钾及氢化钠三种不同的碱分别在无水乙醇、甲苯、N, N-二甲基甲酰胺(DMF)和四氢呋喃(THF)中进行化合反应.薄层色谱(TLC)对反应的检测结果显示, 以氢化钠为碱在DMF或THF中进行环化, 4a的产率分别达到了88%和90%.以DMF为溶剂时, 反应的后处理比较麻烦.最后用氢化钠为碱, THF为溶剂来制备目标化合物4.

  1.2   化合物的细胞毒活性

  我们用噻唑蓝(MTT)法测试了化合物4对四种人源肿瘤细胞株(卵巢癌细胞SKOV-3, 鼻咽癌细胞CNE-2, 胃癌细胞MGC-803, 肺癌细胞NCI-H460)和人正常肝细胞LO2的体外细胞毒活性, 喜树碱(CPT)和顺铂(Cisplatin)为阳性对照, 测试结果见表 1.

  表 1

  

  表 1  化合物4的体外抗肿瘤活性

  Table 1.  Anticancer activity in vitro of 4

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  Compd.	IC50/(μmol•L-1)a
  	SK-OV-3	CNE-2	MGC-803	NCI-H460	LO2
  4a	21.24±1.72	13.71±1.07	13.56±3.39	19.90±1.29	60.68±4.86
  4b	5.34±0.93	0.85±0.11	3.37±1.28	6.13±2.41	1.49±0.40
  4c	35.85±2.03	36.32±2.81	＞100	25.61±4.10	＞100
  4d	16.08±2.06	5.49±1.96	7.53±1.32	2.31±0.16	30.90±1.36
  4e	9.52±1.04	4.10±0.73	9.63±1.02	18.56±2.36	18.78±1.07
  4f	21.47±3.37	＞100	21.58±2.49	21.96±1.96	＞100
  4g	20.18±2.33	16.94±0.89	15.72±2.11	16.58±1.78	＞100
  4h	＞100	85.97±8.94	44.54±3.24	56.24±4.72	45.18±5.56
  4i	50.11±4.17	＞100	22.77±6.05	54.47±4.01	＞100
  4j	14.91±1.09	33.54±4.60	27.25±4.47	25.52±2.18	＞100
  4k	16.34±1.73	13.07±4.35	11.05±3.68	28.36±2.13	＞100
  4l	＞100	＞100	65.89±2.09	＞100	＞100
  4m	25.47±1.80	＞100	24.61±1.71	＞100	＞100
  4n	27.96±2.57	＞100	25.40±0.94	＞100	＞100
  CPT	1.16±0.11	1.94±0.21	4.52±0.74	2.32±0.18	5.37±1.02
  Cisplatin	12.86±1.85	16.09±2.08	12.42±1.23	16.91±2.86	32.81±3.01
  aResults were expressed as means±SD (standard deviation) from triplicate assay in a single experiment, P＜0.05.

  从表 1可看出, 化合物4b和4d表现出非常强的细胞毒活性, 它们对人鼻咽癌细胞CNE-2及人肺癌细胞NCI-H460的IC₅₀值分别达到0.85和2.31 μmol/L, 与抗肿瘤天然产物喜树碱(CPT)的活性相当, 远高于抗肿瘤药物顺铂.值得注意的是, 4b的细胞毒活性虽然总体上略强于4d, 但其对正常肝细胞LO2的毒性也很大, 达到了1.49 μmol/L, 而4d则总体上表现出对肿瘤细胞具有良好的选择性, 其对正常肝细胞LO2的细胞毒性仅为30.9 μmol/L, 具有发展成抗肿瘤候选化合物的前景及进一步深入研究的价值.而另外12个目标化合物中, 4c, 4h, 4i, 4l, 4m和4n细胞毒活性较低, 其它的6个化合物则显示中等强度的细胞毒活性.

  从构效关系看, 当R¹为芳基, R²为H时, 目标化合物的细胞毒活性要比R¹, R²均为烷基时(4l, 4m, 4n)要强得多.当R¹为芳基, 芳基上取代基的种类与位置均对化合物的细胞毒活性有显著影响.就取代基种类而言, 总体上是Br＞Cl＞F＞H, 当取代基变为OCH₃时, 不管是在邻位(4h)还是对位(4i), 化合物将几乎不显示细胞毒活性; 就芳基上的取代基位置而言, 间位取代(4d)与对位取代(4e)差别不大, 但如果取代基是在芳基的邻位(4c), 则化合物的细胞毒活性将会大幅降低.如果将芳基由苯环变为噻吩(4k)或呋喃环(4j), 则目标化合物依然维持中等的细胞毒活性, 其中以噻吩环优于呋喃环.

  1.3   光谱法研究4b, 4d与DNA的相互作用

  DNA是非常重要的生物大分子, 也是很多药物分子的作用靶标, 特别是各种抗肿瘤药物.紫外吸收光谱法及荧光探针法是光谱法研究小分子化合物与DNA相互作用的两种最常用的方法.根据小分子化合物的作用模式, 一般可分为DNA嵌入剂、沟区结合剂和烷化剂三大类^[23].而具有多芳环骨架的小分子通常可以与DNA发生嵌入作用, 此时由于小分子的芳环骨架与DNA碱基对发生π-π堆积、π-正电荷等相互作用, 会引起化合物或DNA的吸收谱带的最大吸波长和(或)吸收强度发生红移或蓝移及增色或减色等变化, 并以此来初步判断小分子与DNA相互作用的模式及强弱^[24].而荧光探针法则是用来进一步确定小分子化合物与DNA作用模式的简便方法, 其中最常用的荧光探针为溴化乙锭(EB). EB可嵌入DNA并能够使EB-DNA体系的荧光显著增强.当小分子加入到EB-DNA体系后, 如果小分子也容易跟DNA发生嵌入作用, 就会与EB竞争结合到DNA, 使EB-DNA体系荧光强度发生猝灭, 从而可说明化合物与DNA发生嵌入作用, 而荧光的淬灭程度可反应出小分子与DNA相互作用的强弱^[24].

  由于化合物4b与4d均具有一个多芳环骨架, 因此首先分别用紫外光谱法和荧光光谱法研究了化合物4b、4d与小牛胸腺DNA的相互作用, 其结果如图 2所示.由图 2A和2B可知, 黑色虚线表示ct-DNA在缓冲液中的紫外吸收光谱, 其在约215 nm附近有较强吸收峰, 在280 nm附近有弱吸收峰.随着4b或4d的加入, DNA在280 nm附近的吸收峰会随着化合物浓度的增加而显著增强, 同时发生明显的蓝移现象, 其在215 nm附近的吸收强度也随着化合物浓度的增加逐步增加.表明化合物4b和4d可与DNA发生相互作用.而由图 2C和2D可知, 黑色虚线表示没有加入4b或4d的EB-DNA体系的荧光发射光谱, 该体系在大约660 nm处有强的荧光发射.随着4b或4d的加入, DNA-EB体系的荧光强度逐渐减弱, 发生明显的荧光淬灭现象, 表明4b和4d均可通过嵌入方式与DNA作用, 其中化合物4d导致荧光淬灭的程度明显强于4b, 说明4d表现出更强的DNA嵌入作用.由于总体上4b的细胞毒要稍微强于4d, 因此这也预示着这个化合物骨架的细胞毒, 可能不是直接源于与DNA的相互作用, 或者至少不是只来自于化合物与DNA的相互作用.

  图 2

  

  图 2.  光谱法研究化合物4b and 4d与DNA的相互作用

  Figure 2.  Spectroscopy to investigate the interaction of 4b and 4d with DNA

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  1.4   免疫印迹法研究4b与4d对LO2细胞的双链DNA的断裂作用

  由于4b虽然总体上表现出比4d更强的抗肿瘤效果, 但其对人的正常肝细胞LO2也表现出很强的细胞毒.为了初步探索这一现象, 用免疫印迹法研究了4b与4d对LO2细胞的DNA损伤的作用情况. γH2AX是DNA损伤的标志物, 它的形成意味着DNA双链断裂的发生.由图 3可知, 4b作用于LO2细胞后, 其γH2AX的表达出现了明显的上调, 并显示出明显的浓度依赖性, 而在相同浓度下4d对γH2AX的表达并没有明显影响.表明4b可引起细胞LO2中双链DNA的断裂, 这可能是其对正常肝细胞LO2具有强的细胞毒作用的主要原因之一.

  图 3

  

  图 3.  与4b或4d孵育后LO2细胞中γH2AX的表达量

  Figure 3.  Level of γH2AX in LO2 cell treated with 4b or 4d

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  1.5   4d对NCI-H460肿瘤细胞的细胞周期阻滞作用

  由于化合物4d不仅对肿瘤细胞具有很强的细胞毒作用, 特别是对人肺癌细胞NCI-H460的IC₅₀值分别达到2.31 μmol/L, 与CPT相当, 远高于抗肿瘤药物顺铂, 而且其对正常细胞的毒性也很低, 具有良好的发展成为抗肿瘤先导化合物的前景, 因此我们进一步用流式细胞术研究了4d对肿瘤细胞的细胞周期阻滞作用, 从图 4可以看出, 当化合物浓度由0增加到1和10 μmol/L时, G1期细胞的百分数从61.94%增加到从66.91%及76.69%, 而G2期分别由5.5.%减小到4.99%和1.30%, S期的细胞则从32.54减小到28.10%和22.01%, 表明化合物4d可将NCI-H460细胞阻滞在G1期.

  图 4

  

  图 4.  4d对NCI-H460细胞的细胞周期阻滞作用

  Figure 4.  Inhibitory effects of 4d on cell cycle of NCI-H460 cell

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  1.6   4d诱导NCI-H460肿瘤细胞发生凋亡

  证实了4d可以引起肿瘤细胞的细胞周期阻滞, 接下来我们又研究了4d诱导肿瘤细胞凋亡的情况.由图 5可知, 当4d的浓度由0增加到1和10 μmol/L时, NCI- H460细胞发生凋亡的比例由4.3%依次增加到7.6%和52.1%, 特别是浓度由1增加到10 μmol/L, 凋亡细胞的比例发生了显著的增加, 确定了4d确实具有很强的诱导肿瘤细胞凋亡的作用.

  图 5

  

  图 5.  化合物4d对NCI-H460细胞的凋亡结果

  Figure 5.  Apoptosis induction of 4d on NCI-H460 cells

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  2.   结论

  根据药物分子设计的优势结构等理论, 设计并合成得到了14个具有哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉酮骨架的系列化合物.用¹H NMR, ¹³C NMR和HRMS对它们的结构进行了表征和确认.这14个化合物对人肿瘤细胞SK-OV- 3, CNE-2, MGC-803, NCI-H460和人正常肝细胞LO2的体外细胞毒活性结果表明:化合物4b对人鼻咽癌细胞CNE-2和4d对人肺癌细胞NCI-H460的IC₅₀值分别达到了0.85和2.31 μmol/L.化合物与DNA的相互作用研究结果表明, 4b和4d均可通过嵌入DNA的方式与DNA相互作用. 4d还可以将人肺癌细胞NCI-H460的细胞周期阻滞在G1期, 并显著诱导肿瘤细胞发生凋亡.研究还发现化合物4b可直接引起LO2细胞的DNA双键发生断裂, 这可能是其对正常肝细胞LO2显示出强毒性的主要原因.而化合物4d则表现出活性强毒性低的特点, 具有良好的进一步深入研究的价值.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  超导核磁共振仪: Bruker AV 400 MHz, Bruker AV 500 MHz(内标: TMS); 高分辨质谱仪: ESQUIRE HCT型(美国, 布鲁克•道尔顿公司); 熔点仪: XT4A熔点测定仪(北京科仪电光仪器厂); M1000多功能酶标仪(Tecan公司); 流式细胞仪(BD公司); 硅胶和硅胶板均产自青岛海洋化工集团公司.实验所用的各种化学试剂均为市售的国产化学纯或分析纯试剂.生物测试所用的各种生物试剂及试剂盒主要购自Solarbio公司, Sigma公司及TaKaRa公司.

  3.2   实验方法

  3.2.1   化合物2的合成

  将邻氨基苯甲酸甲酯(10 g)和50 mL的水合肼(80%)加入到的圆底烧瓶中, 氮气保护下搅拌回流约4 h (TLC监测, 展开剂: V_乙酸乙酯/V_石油醚=2/1).待反应完成后, 室温冷却后进一步用冰水冷却, 使得固体产物尽量析出, 抽滤, 冰水洗涤后烘干, 得白色肼解产物7.2 g, 收率72%.

  将合成的的酰肼1.51 g (1 mmol)、草酸二乙酯1.22 g (1.2 mmol)和10 mL乙酸加入到圆底烧瓶中, 在氮气保护下回流反应约1 h (TLC监测, 展开剂: V_乙酸乙酯/V_石油醚=1/4).待反应完成后, 冷却至室温.减压除去大部分乙酸, 然后加入30 mL NaHCO₃溶液, DCM萃取(30 mL×5).合并有机层, 30 mL NaHCO₃溶液洗涤, 无水Na₂SO₄干燥, 浓缩, 柱层析提纯(洗脱剂: V_乙酸乙酯/ V_石油醚=1/4)得化合物2, 白色固体, 收率36%. m.p. 133~134 ℃(文献值^[22] 133~135 ℃).

  3.2.2   化合物3的合成

  以化合物3a为例.依次将化合物2 (1 mmol, 0.335 g), 甲苯(5 mL), 苯乙酮(2 mmol, 0.180 g)和对甲苯磺酸(0.06 mmol, 10 mg)加入到50 mL的圆底烧瓶中, 置于油浴锅中, 安装分水器加热回流分水, 反应约5 h(用TLC监测反应, 展开剂: V_乙酸乙酯:V_石油醚=1:6).待反应完成后, 减压除去甲苯, 柱层析提纯(洗脱剂: V_乙酸乙酯:V_石油醚=1:6), 得化合物3a白色固体0.332 g, 收率69%.利用同样的方法可合成化合物3b~3n.

  3-(2-苯基)乙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3a):白色固体, m.p. 102~104 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.35 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.95 (d, J=7.9 Hz, 2H), 7.87~7.83 (m, 2H), 7.82~7.57 (m, 2H), 7. 54~7.45 (m, 2H), 4.38 (q, J=7.1 Hz, 2H), 2.37(s, 3H), 1.30 (t, J=7.1 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 178.06, 160.35, 155.70, 145.74, 144.95, 135.42, 134.10, 131.58, 128.27, 127.94, 127.88, 127.34, 126.86, 122.19, 62.61, 17.51, 13.67.

  3-[2-(4-溴苯基)]乙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3b):白色固体, 收率71%. m.p. 133~135 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.35 (dd, J=7.6, 0.5 Hz, 1H), 7.87~7.80 (m, 4H), 7.62~7.57 (m, 3H), 4.38 (q, J=7.1 Hz, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.30 (t, J=7.1 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 176.50, 159.92, 155.23, 145.30, 144.38, 133.88, 133.85, 131.21, 128.48, 127.64, 126.52, 126.15, 121.77, 62.30, 17.02, 13.36.

  3-[2-(2-氯苯基)]乙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3c):白色固体, 收率69%. NMR谱图数据显示存在顺反异构体, 比例约为1:5.含量较多的异构体的核磁共振数据: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.35 (dd, J=7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.89 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.85~7.82 (m, 2H), 7.61~7.57 (m, 1H), 7.43 (d, J=8.4 Hz, 2H), 4.39 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H), 1.30 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 177.05, 160.60, 155.89, 145.97, 145.12, 138.26, 134.52, 134.10, 129.70, 129.01, 128.90, 128.84, 128.28, 127.18, 126.61, 122.45, 62.96, 17.72, 14.05.

  3-[2-(3-氯苯基)]乙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3d):白色固体, 收率54%. m.p. 123~124 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.35 (dd, J=7.8, 1.2 Hz, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.95~7.80 (m, 3H), 7.61~7.57 (m, 2H), 7.43~7.39 (m, 1H), 4.40 (q, J=7.4 Hz, 2H), 2.35 (s, 3H), 1.32 (t, J=7.4 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 176.96, 160.58, 155.82, 145.95, 145.01, 137.44, 134.79, 134.53, 131.82, 129.87, 128.33, 128.32, 127.74, 127.21, 125.82, 122.43, 63.03, 17.92, 14.03.

  3-[2-(4-氯苯基)]乙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3e):白色固体, 收率60%. m.p. 135~136 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.35 (dd, J=7.6, 1.0 Hz, 1H), 7.96~7.95 (m, 1H), 7.86~7.81 (m, 3H), 7.62~7.58 (m, 2H), 7.44~7.40 (m, 1H), 4.42 (q, J=7.4 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H), 1.33 (t, J=7.4 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 177.02, 160.65, 155.88, 146.01, 145.07, 137.50, 134.85, 134.59, 131.88, 129.93, 128.39, 128.38, 127.80, 127.27, 125.88, 122.48, 63.09, 17.98, 14.08.

  3-[2-(2-氟苯基)]乙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3f):白色固体, 收率48%. NMR谱图数据显示存在顺反异构体, 比例约为1:4.含量较多的异构体的核磁共振数据: ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.34 (dd, J=7.6, 1.0 Hz, 1H), 7.85~7.82 (m, 2H), 7.72~7.68 (m, 2H), 7.61~7.57 (m, 1H), 7.45~7.43 (m, 1H), 7.24 (d, J=2.4 Hz, 1H), 4.39 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H), 1.31 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 177.30, 177.27, 162.50 (d, J=247.3 Hz, C—F), 160.88, 156.15, 146.26, 145.98, 145.34, 138.18, 138.11, 134.83, 134.56, 130.54, 130.47, 128.62, 128.61, 128.40, 128.34, 127.50, 127.38, 123.81, 123.78, 122.74, 122.69, 121.86, 121.83, 119.27, 119.06, 117.21, 114.94, 114.71, 113.66, 113.43, 63.47, 63.31, 26.06, 14.35, 14.31.

  3-[2-(4-氟苯基)]乙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3g):白色固体, 收率52%. m.p. 98~99 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.34 (dd, J=8.0, 1.0 Hz, 1H), 8.00~7.96 (m, 2H), 7.85~7.82 (m, 2H), 7.61~7.51 (m, 1H), 7.17~7.13 (m, 2H), 4.40 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.36 (s, 3H), 1.31 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 177.30, 165.45 (d, J=254.3 Hz, C—F), 160.97, 156.34, 146.35, 145.48, 134.81, 130.33, 130.24, 128.62, 128.60, 127.51, 122.80, 116.18, 115.96, 63.27, 18.04, 14.34.

  3-[2-(3-甲氧苯基)]乙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3h):白色固体, 收率46%. NMR谱图数据显示存在顺反异构体, 比例约为1:1. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.35~7.00 (m, 16H, ArH), 4.51 (q, J=7.2 Hz, 2H), 4.37 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.58 (s, 3H), 2.34 (s, 3H), 1.50 (t, J=7.2 Hz, 3H), 1.28 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 180.84, 178.54, 161.22, 160.89, 159.89, 159.39, 156.22, 155.41, 146.28, 146.02, 145.47, 145.40, 137.48, 137.29, 134.69, 134.38, 129.88, 129.83, 128.50, 128.47, 128.22, 128.13, 127.41, 127.31, 122.74, 120.55, 118.41, 118.29, 116.13, 112.70, 111.10, 63.34, 63.17, 55.62, 55.44, 26.06, 18.18, 14.30, 14.27.

  3-[2-(4-甲氧苯基)]乙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3i):白色固体, 收率50%. m.p. 133~135 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.35 (dd, J=7.6, 1.0 Hz, 1H), 7.95 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.85~7.78 (m, 2H), 7.59~7.55 (m, 1H), 6.95 (d, J=8.4 Hz, 2H), 4.36 (q, J=7.2 Hz, 2H), 3.87 (s, 3H), 2.32 (s, 3H), 1.27 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 177.70, 163.02, 161.06, 156.59, 146.44, 145.82, 134.64, 129.86, 128.51, 128.39, 127.44, 122.84, 114.20, 63.15, 55.73, 17.61, 14.33.

  3-(2-呋喃基)乙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3j):白色粘稠状, 收率39%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.34 (dd, J=8.0, 1.0 Hz, 1H), 7.80~7.85 (m, 2H), 7.64~7.56 (m, 2H), 7.16 (d, J=4.0 Hz, 1H), 6.58~6.57 (m, 1H), 4.39 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.30 (s, 3H), 1.31 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 168.82, 160.91, 156.45, 150.37, 146.63, 146.29, 145.60, 134.75, 128.59, 128.52, 127.53, 122.73, 116.30, 112.72, 63.23, 16.82, 14.21.

  3-(2-噻吩基)乙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3k):白色固体, 收率60%. m.p. 99~101 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.35(d, J=7.6, 1H), 7.83~7.85(m, 2H), 7.82~7.79 (m, 3H), 7.13 ~7.15(m, 1H), 4.38 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.37 (s, 3H), 1.29 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 172.91, 160.98, 156.55, 146.32, 145.79, 140.51, 134.75, 132.40, 131.88, 128.55, 128.48, 128.00, 127.49, 122.75, 63.28, 17.94, 14.34.

  3-(2-乙基)丙亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3l):白色粘稠状, 收率34%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.27~8.29 (m, 1H), 7.76~7.78 (m, 2H), 7.51~7.54 (m, 1H), 4.40 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.59 (q, J=7.2 Hz, 2H), 4.28 (q, J=7.6 Hz, 2H), 1.38 (t, J=7.2 Hz, 3H), 1.23 (t, J=7.6 Hz, 3H), 1.12 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 190.00, 160.91, 156.49, 146.35, 145.52, 134.51, 128.33, 128.25, 127.25, 122.70, 63.06, 29.01, 26.37, 14.26, 10.59, 10.06.

  3-环戊亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3m):白色粘稠状, 收率80%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.27~8.29 (m, 1H), 7.75~7.77 (m, 2H), 7.50~7.54 (m, 1H), 4.40 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.68 (t, J=7.4 Hz, 2H), 2.40 (t,

  J=7.4 Hz, 2H), 1.83~1.91 (m, 4H), 1.38 (t, J=7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 195.40, 160.34, 155.46, 145.70, 144.58, 133.98, 127.78, 127.70, 126.70, 122.37, 62.58, 33.83, 32.39, 24.32, 24.20, 13.70.

  3-环己亚胺基喹唑啉-4-酮-2-甲酸乙酯(3n):白色粘稠状, 收率62%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 8.30~8.32 (m, 1H), 7.78~7.82 (m, 2H), 7.53~7.58 (m, 1H), 4.45(q, J=7.0 Hz, 2H), 2.60 (t, J=6.4 Hz, 2H), 2.28 (t,

  J=6.0 Hz, 2H), 1.90 (br, 2H), 1.78 (br, 2H), 1.70 (br, 2H), 1.42 (t, J=7.0 Hz, 3H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 178.42, 160.97, 156.40, 134.73, 134.32, 128.29, 128.24, 128.19, 127.10, 124.72, 63.10, 42.00, 35.61, 31.29, 27.03, 26.14, 13.90.

  3.2.3   化合物4的合成(以化合物4a为例)

  依次将化合物3a (0.5 mmol, 0.167 g), 60% NaH (2 mmol, 0.077 g), 无水THF (5 mL)加入到50 mL的双口圆底烧瓶中, 置于油浴锅中, 加热至回流, 反应约1 h(用TLC监测反应, 展开剂: V_乙酸乙酯:V_石油醚=1:6).待反应完成后, 加入稀盐酸调pH至4左右, 抽滤, 用少量水洗涤滤饼即得, 得化合物4a黄色固体0.130 g, 3a环化生成4a的收率为90%.利用同样的方法可合成化合物4b~4n, 收率42%~90%.

  4-羟基-2-苯基-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-10-酮(4a):黄色固体, 收率90%. m.p. 221~224 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.35 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.09~8.07 (m, 2H), 7.97~7.96 (m, 2H), 7.63~7.55 (m, 4H), 7.25 (s, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 158.65, 158.40, 152.82, 144.36, 144.00, 135.92, 135.48, 130.74, 129.36, 127.70, 127.36, 126.59, 125.72, 118.81, 102.93. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₇H₁₂O₂N₃ [M-H]^- 290.0931, found 290.0923.

  (4-溴苯基)-4-羟基-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-10-酮(4b):黄色固体, 收率43%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.34 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.04 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7.97 (d, J=2.7 Hz, 2H), 7.77 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7.63~7.59 (m, 1H), 7.22 (s, 1H); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ: 158.33, 151.90, 144.19, 135.61, 135.05, 132.37, 129.40, 127.87, 126.64, 125.22, 124.37, 118.48, 102.76. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₇H₁₁O₂N₃Br [M-H]^- 368.0036, found 368.0031.

  2-(2-氯苯基)-4-羟基-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-10-酮(4c):黄色固体, 收率90%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.25~8.23 (m, 1H), 8.05 (d, J=8.3 Hz, 1H), 7.86~7.76 (m, 1H), 7.59~7.53 (m, 2H), 7.50~7.43 (m, 3H), 5.99 (s, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 166.89, 159.90, 155.18, 150.20, 146.94, 138.52, 133.87, 131.97, 131.52, 130.44, 130.04, 128.22, 127.67, 127.53, 126.94, 125.11, 118.63, 103.43. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₇H₁₁O₂N₃Cl [M-H]^- 324.0542, found 324.0931.

  2-(3-氯苯基)-4-羟基-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-10-酮(4d):黄色固体, 收率85%. m.p. 295~296 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.34 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.13~8.12 (m, 1H), 8.06 ~8.01 (m, 1H), 7.99~7.92 (m, 2H), 7.63~7.56 (m, 3H), 7.16 (s, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.02, 158.50, 151.78, 144.92, 143.93, 138.37, 135.52, 134.17, 131.26, 130.40, 127.73, 127.42, 126.95, 126.55, 126.05, 125.37, 118.59, 102.67, 99.99. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₇H₁₁O₂N₃Cl [M-H]^- 324.0542, found 324.0527.

  2-(4-氯苯基)-4-羟基-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-10-酮(4e):黄色固体, 收率72%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.34 (d, J=6.9 Hz, 1H), 8.11 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7.97 (s, 2H), 7.64~7.58 (m, 3H), 7.18 (s, 1H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ: 160.21, 154.59, 146.97, 137.67, 135.94, 134.76, 134.17, 133.03, 131.91, 123.47, 123.01, 120.81, 120.57, 115.87, 109.75. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₇H₁₁O₂N₃Cl [M-H]^- 324.05415, found 324.0525.

  2-(2-氟苯基)-4-羟基-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-10-酮(4f):黄色固体, 收率46%. m.p. 294~296 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.34 (d, J=8.0 Hz, 1H), 8.01~7.94 (m, 2H), 7.86 (dd, J=7.7, 1.6 Hz, 1H), 7.65~7.57 (m, 2H), 7.45~7.38 (m, 2H), 6.94 (d, J=2.1 Hz, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.34 (d, J=250.3 Hz, C—F), 158.44, 158.32, 150.73, 144.29, 143.67, 135.73, 132.65, 132.57, 131.23, 131.20, 127.81, 126.74, 125.44, 125.41, 125.11, 124.72, 124.60, 118.58, 117.06, 116.84, 106.18. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₇H₁₁O₂N₃F [M-H]^- 308.0837, found 308.0822.

  2-(4-氟苯基)-4-羟基-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-10-酮(4g):黄色固体, 收率42%. m.p. 303~305 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.35 (d, J=6.7 Hz, 1H), 8.17~8.12 (m, 2H), 7.97 (s, 2H), 7.60 (s, 1H), 7.40 (t, J=8.8 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H).因4g溶解性较差, 无法对其¹³C NMR进行表征. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₇H₁₁- O₂N₃F [M-H]^- 308.0836, found 308.0820.

  4-羟基-2-(3-甲氧苯基)-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-10-酮(4h):黄色固体, 收率43%. m.p. 256~258 ℃; ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.35 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.97 (s, 2H), 7.75~7.54 (m, 3H), 7.48 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.14~7.12 (m, 1H), 3.86 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.11, 158.66, 158.38, 152.75, 144.14, 137.41, 135.55, 130.52, 127.76, 126.62, 125.51, 119.76, 118.77, 116.33, 112.79, 103.20, 55.79. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₈H₁₄O₃N₃ [M-H]^- 320.1037, found 320.1029.

  4-羟基-2-(4-甲氧苯基)-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉- 10-酮(4i):黄色固体, 收率42%. m.p. 263~265 ℃; ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.33 (d, J=8.05 Hz, 1H), 8.05 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.94 (d, J=2.95 Hz, 2H), 7.60~7.57 (m, 1H), 7.24 (s, 1H), 7.10 (d, J=8.8Hz, 2H), 3.84 (s, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ: 161.54, 158.34, 158.04, 152.33, 144.45, 143.70, 135.42, 128.89, 128.03, 127.71, 126.56, 125.77, 118.89, 114.76, 102.69, 55.83. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₈H₁₄O₃N₃ [M-H]^- 320.1037, found 320.1028.

  2-(呋喃-2-基)-4-羟基-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-10-酮(4j):黄色固体, 收率45%. m.p. 285~287 ℃; ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.32 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.99~7.97 (m, 3H), 7.64~7.60 (m, 1H), 7.31 (d, J=3.3 Hz, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.77~6.75 (m, 1H); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ: 158.18, 149.66, 145.99, 145.46, 144.03, 135.50, 127.71, 126.70, 125.55, 118.81, 112.95, 112.36, 101.35. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₅H₁₀O₃N₃ [M-H]^- 280.0724, found 280.0717.

  4-羟基-2-(噻吩-2-基)-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-10-酮(4k):黄色固体, 收率48%. m.p. 297~300 ℃; ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.32 (d, J=8.1 Hz, 1H), 7.95 (d, J=3.3 Hz, 2H), 7.90 (d, J=2.7 Hz, 1H), 7.78 (d, J=4.1 Hz, 1H), 7.63~7.57 (m, 1H), 7.23~7.21 (m, 2H); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ: 158.26, 158.03, 149.14, 144.07, 143.99, 140.11, 135.46, 130.60, 128.97, 128.62, 127.68, 126.69, 125.54, 118.83, 101.95. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₅H₁₀O₂N₃S [M-H]^- 296.0496, found 296.0484.

  3-甲基-2-乙基-4-羟基-10H-哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-10-酮(4l):黄色固体, 收率43%. m.p. 234~236 ℃; ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.29 (d, J=7.9 Hz, 1H), 7.90 (d, J=6.3 Hz, 2H), 7.58~7.49 (m, 1H), 2.83 (q, J=7.4 Hz, 2H), 2.20 (s, 3H), 1.26 (t, J=7.4 Hz, 3H); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ: 158.41, 158.21, 153.06, 145.34, 142.48, 135.30, 127.62, 125.97, 125.88, 118.50, 114.61, 27.24, 12.12, 10.97. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₄H₁₄O₂N₃ [M-H]^- 256.1088, found 256.1082.

  12-羟基-2, 3-二氢环戊烯[3, 4]哒嗪并[6, 1-b]喹唑啉-6-酮(4m):黄色固体, 收率42%. m.p.＞300 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.31 (d, J=7.92 Hz, 1H), 7.94~7.92 (m, 2H), 7.59~7.54 (m, 1H), 2.98 (t, J=7.6 Hz, 2H), 2.89 (t, J=7.28 Hz, 2H), 2.10~2.06 (m, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, DMSO-d₆) δ: 164.02, 158.45, 151.80, 144.16, 143.69, 135.46, 127.71, 126.20, 125.07, 119.68, 118.05, 32.66, 27.66, 23.04. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₄H₁₂O₂N₃ [M-H]^- 254.0931, found 254.0925.

  13-羟基-1, 2, 3, 4-四氢-7H-喹唑啉并[3, 2-b]噌啉-7-酮(4n):黄色固体, 收率47%. m.p. 286~288 ℃; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃-CD₃OD) δ: 8.50 (d, J=8.15 Hz, 1H), 7.89 (t, J=8.2 Hz, 1H), 7.85 (d, J=8.05 Hz, 1H), 7.55 (t, J=7.9 Hz, 1H), 3.01 (t, J=5.95 Hz, 2H), 2.86 (t, J=6.45 Hz, 2H), 1.93~1.88 (m, 4H); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃-CD₃OD) δ: 158.15, 156.40, 141.97, 135.57, 128.27, 126.06, 123.41, 117.70, 117.22, 30.49, 22.43, 22.01, 21.38. HRMS (ESI^-) calcd for C₁₅H₁₄O₂N₃ [M-H]^- 268.1088, found 268.1085.

  3.2.4   化合物的细胞毒活性测试实验

  采用MTT法, 以CPT和顺铂为阳性对照药, 测试了化合物4a~6d对四种人源肿瘤细胞株(卵巢癌细胞KOV3, 鼻咽癌细胞CNE-2, 胃癌细胞MGC-803, 肺癌细胞NCI-H460)和人正常肝细胞LO2的体外细胞毒活性, 具体实验过程参照文献方法^[25].

  3.2.5   紫外与荧光光谱法研究4b与4d与DNA的相互作用实验

  紫外吸收实验中, 以缓冲溶液作为空白对照液, 1 mL比色皿中加缓冲液和ct-DNA, DNA浓度固定为1.0 μg/mL, 然后向此样品池中逐次加入4b或4d溶液, 使得4b或4d的浓度分别为0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 μmol/L, 在室温下反应5 min后进行紫外扫描.与EB的竞争试验中, 比色皿中EB和DNA的浓度分别固定为10和1.0 μg/mL, 分别逐次加入4b或4d, 使得4b或4d的浓度分别为0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 μmol/L.室温反应5 min后, 荧光仪扫描测试荧光强度.荧光扫描测试条件为:激发波长527 nm, 激发与发射狭缝宽度均为5 nm, 扫描速度为600 nm•min^-1.

  3.2.6   免疫印迹法研究化合物4b与4d对LO2细胞的双链DNA的断裂作用实验

  所用细胞为人正常肝细胞LO2细胞, 化合物的浓度设0, 0.5, 1.0到2.5 μmol/L三个浓度梯度, 以β-actin为参照.具体实验过程参照文献[26]方法.

  3.2.7   化合物4d对肿瘤细胞的细胞周期阻滞作用实验

  实验参照文献[27]方法并进行了微小调整.将NCI- H460细胞接种到6孔板中, 孵化24 h.再根据组别设置加入不同浓度的培养基.作用48 h后收割细胞并离心分离, 70%冰乙醇固定.加RNase A孵化30 min, 再加入PI染色.用流式细胞仪检测488 nm处荧光值.

  3.2.8   化合物4d诱导肿瘤细胞发生凋亡实验

  实验主要参照文献[28]方法.实验操作参照ArmexinV FITC/P工细胞凋亡检测试剂盒说明书, 取对数期NCI-H460肿瘤细胞消化制成细胞悬液, 加入1 mL密度约4×10⁵个/mL细胞于六孔细胞培养板内培养过夜, 然后加入化合物4d (0, 1, 10 μmol/L)孵育24 h.收集经不同浓度处理后的细胞, PBS洗涤, 置0 ℃水浴中, 加Annexin Binding Buffer轻轻重悬细胞, 再加入Armexin V和PI, 轻轻混匀细胞, 冰浴中避光放置10 min后, 用流式细胞仪进行检测.

  辅助材料(Supporting Information)  化合物3a~3n和4a~4n的¹H NMR, ¹³C NMR及HRMS谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
• 1. [1]

     Hu, Y.; Zhao, T.; Zhang, N.; Zhang, Y.; Cheng, L. Curr. Drug Metab. 2019, 20, 209. doi: 10.2174/1389200219666180925091851

  2. [2]

     Regalado, E. L.; Haidar Ahmad, I. A.; Bennett, R.; D'Atri, V.; Makarov, A. A.; Humphrey, G. R.; Mangion, I.; Guillarme, D. Acc. Chem. Res. 2019, 52, 1990. doi: 10.1021/acs.accounts.9b00068

  3. [3]

     Surabhi; Singh, B. K. J. Drug Delivery Ther. 2018, 8, 504. doi: 10.22270/jddt.v8i5.1894

  4. [4]

     Flick, A. C.; Leverett, C. A.; Ding, H. X.; McInturff, E.; Fink, S. J.; Helal, C. J.; O'Donnell, C. J. J. Med. Chem. 2019, 62(16), 7340. doi: 10.1021/acs.jmedchem.9b00196

  5. [5]

     Kim, J.; Kim, H.; Park, S. B. J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 14629. doi: 10.1021/ja508343a

  6. [6]

     Kalaria, P. N.; Karad, S. C.; Raval, D. K. Eur. J. Med. Chem. 2018, 158, 917. doi: 10.1016/j.ejmech.2018.08.040

  7. [7]

     Meyers, J.; Chessum, N. E. A.; Ali, S.; Mok, N. Y.; Wilding, B.; Pasqua, A. E.; Rowlands, M.; Tucker, M. J.; Evans, L. E.; Rye, C. S.; O'Fee, L.; Le Bihan, Y.-V.; Burke, R.; Carter, M.; Workman, P.; Blagg, J.; Brown, N.; van Montfort, R. L. M.; Jones, K.; Cheeseman, M. D. ACS Med. Chem. Lett. 2018, 9, 1199. doi: 10.1021/acsmedchemlett.8b00364

  8. [8]

     Duarte, C. D.; Barreiro, E. J.; Fraga, C. A. M. Mini-Rev. Med. Chem. 2007, 7, 1108. doi: 10.2174/138955707782331722

  9. [9]

     Evans, B. E.; Rittle, K. E.; Bock, M. G.; DiPardo, R. M.; Freidinger, R. M.; Whitter, W. L.; Lundell, G. F.; Veber, D. F.; Anderson, P. S.; Chang, R. S. L.; Lotti, V. J.; Cerino, D. J.; Chen, T. B.; Kling, P. J.; Kunkel, K. A.; Springer, J. P.; Hirshfieldt, J. J. Med. Chem. 1988, 31, 2235. doi: 10.1021/jm00120a002

  10. [10]

      Patchett, A. A.; Nargund, R. P. Annu. Rep. Med. Chem. 2000, 35, 289.

  11. [11]

      Alagarsamy, V.; Chitra, K.; Saravanan, G.; Solomon, V. R.; Sulthana, M. T.; Narendhar, B. Eur. J. Med. Chem. 2018, 151, 628. doi: 10.1016/j.ejmech.2018.03.076

  12. [12]

      Hameed, A.; Ali, S. A.; Arshia; Ishtiaq, M.; Khan, K. M.; Al-Rashida, M.; Uroos, M. Expert Opin. Ther. Pat. 2018, 28, 281. doi: 10.1080/13543776.2018.1432596

  13. [13]

      He, D.; Wang, M.; Zhao, S.; Shu, Y.; Zeng, H.; Xiao, C.; Lu, C.; Liu, Y. Fitoterapia 2017, 119, 136. doi: 10.1016/j.fitote.2017.05.001

  14. [14]

      曹泉诚, 王辉, Reddy, T. V. K.; Lavanya, G.; 蔡桂鑫, 周成合, 中国科学:化学, 2017, 47, 844. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-JBXK201707004.htmCao, Q. C.; Wang, H.; Reddy, T. V. K.; Lavanya, G.; Cai, G. X.; Zhou, C. H. Sci. Sin. Chim. 2017, 47, 844(in Chinese). http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-JBXK201707004.htm

  15. [15]

      杜欢, 范治江, 杨岚, 鲍小平, 有机化学, 2018, 38, 531. doi: 10.6023/cjoc201708051Du, H.; Fan, Z. J.; Yang, L.; Bao, X. P. Chin. J. Org. Chem. 2018, 38, 531(in Chinese). doi: 10.6023/cjoc201708051

  16. [16]

      Luo, X.; Zhou, X.; Lin, X.; Qin, X.; Zhang, T.; Wang, J.; Tu, Z.; Yang, B.; Liao, S.; Tian, Y.; Pang, X.; Kaliyaperumal, K.; Li, J. L.; Tao, H.; Liu, Y. Nat. Prod. Res. 2017, 31, 1958. doi: 10.1080/14786419.2016.1266353

  17. [17]

      Zhang, H.; Liu, R.; Yang, J.; Li, H.; Zhou, F. Chem. Nat. Compd. 2017, 53, 802. doi: 10.1007/s10600-017-2128-7

  18. [18]

      Motegi, M.; Nugroho, A. E.; Hirasawa, Y.; Arai, T.; Hadi, A. H. A.; Morita, H. Tetrahedron Lett. 2012, 53, 1227. doi: 10.1016/j.tetlet.2011.12.116

  19. [19]

      Jaballah, M.; Serya, R.; Abouzid, K. Drug Res. 2017, 67, 138. doi: 10.1055/s-0042-119992

  20. [20]

      Asif, M. Curr. Med. Chem. 2012, 19, 2984. doi: 10.2174/092986712800672139

  21. [21]

      Lamberth, C. J. Heterocycl. Chem. 2017, 54, 2974. doi: 10.1002/jhet.2945

  22. [22]

      Shemchuk, L. A.; Chernykh, V. P.; Arzumanov, P. S. Russ. J. Org. Chem. 2007, 43, 719. doi: 10.1134/S1070428007050120

  23. [23]

      田沺, 肖珩, 翁小成, 王少儒, 周翔, 中国科学:化学, 2012, 42, 1700. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-JBXK201212007.htmTian, T.; Xiao, H.; Weng, X. C.; Wang, S. R.; Zhou, X. Sci. Sin. Chim. 2012, 42, 1700(in Chinese). http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-JBXK201212007.htm

  24. [24]

      刘军, 罗国安, 王义明, 孙汉文, 药学学报, 2001, 36, 74.Liu, J.; Luo, G. A.; Wang, Y. M.; Sun, H. W. Acta Pharm. Sin. 2001, 36, 74(in Chinese).

  25. [25]

      王增博, 田成, 刘晴晴, 张玮, 潘成学, 苏桂发, 有机化学, 2019, 39, 1962.Wang, Z. B.; Liu, Q. Q.; Zhang, W.; Pan, C. X.; Su, G. F. Chin. J. Org. Chem. 2019, 39, 1962(in Chinese).

  26. [26]

      余艳柯, 朱心强, 杨军, 毒理学杂志, 2006, 20, 408. doi: 10.3969/j.issn.1002-3127.2006.06.023Yu, Y. K.; Zhu, X. Q.; Yang, J. J. Toxicol. 2006, 20, 408(in Chinese). doi: 10.3969/j.issn.1002-3127.2006.06.023

  27. [27]

      张磊, 刘来, 郑诚月, 王杨, 王京, 姚其正, 有机化学, 2017, 37, 1523. doi: 10.6023/cjoc201704018Zhang, L.; Liu, L.; Zheng, C. Y.; Wang, Y.; Wang, J.; Yao, Q. Z. Chin. J. Org. Chem. 2017, 37, 1523(in Chinese). doi: 10.6023/cjoc201704018

  28. [28]

      黎勇坤, 刘蓓, 张丽君, 朱加洪, 万春平, 毛泽伟, 有机化学, 2018, 38, 949. doi: 10.6023/cjoc201711005Li, Y. K.; Liu, P.; Zhang, L. J.; Zhu, J. H.; Wan, C. P.; Mao, Z. W. Chin. J. Org. Chem. 2018, 38, 949(in Chinese). doi: 10.6023/cjoc201711005

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  图 1  一些具有六元杂环并喹唑啉酮母核结构及哒嗪药物代表化合物

  Figure 1  Representatives of bioactive compound with six- membered-fused quinazolinone nucleus or pyridazine drugs

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  图式 1  目标化合物的合成

  Scheme 1  Synthesis of the target compounds

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  图 2  光谱法研究化合物4b and 4d与DNA的相互作用

  Figure 2  Spectroscopy to investigate the interaction of 4b and 4d with DNA

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  图 3  与4b或4d孵育后LO2细胞中γH2AX的表达量

  Figure 3  Level of γH2AX in LO2 cell treated with 4b or 4d

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  图 4  4d对NCI-H460细胞的细胞周期阻滞作用

  Figure 4  Inhibitory effects of 4d on cell cycle of NCI-H460 cell

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  图 5  化合物4d对NCI-H460细胞的凋亡结果

  Figure 5  Apoptosis induction of 4d on NCI-H460 cells

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  表 1  化合物4的体外抗肿瘤活性

  Table 1.  Anticancer activity in vitro of 4

  Compd.	IC50/(μmol•L-1)a
  	SK-OV-3	CNE-2	MGC-803	NCI-H460	LO2
  4a	21.24±1.72	13.71±1.07	13.56±3.39	19.90±1.29	60.68±4.86
  4b	5.34±0.93	0.85±0.11	3.37±1.28	6.13±2.41	1.49±0.40
  4c	35.85±2.03	36.32±2.81	＞100	25.61±4.10	＞100
  4d	16.08±2.06	5.49±1.96	7.53±1.32	2.31±0.16	30.90±1.36
  4e	9.52±1.04	4.10±0.73	9.63±1.02	18.56±2.36	18.78±1.07
  4f	21.47±3.37	＞100	21.58±2.49	21.96±1.96	＞100
  4g	20.18±2.33	16.94±0.89	15.72±2.11	16.58±1.78	＞100
  4h	＞100	85.97±8.94	44.54±3.24	56.24±4.72	45.18±5.56
  4i	50.11±4.17	＞100	22.77±6.05	54.47±4.01	＞100
  4j	14.91±1.09	33.54±4.60	27.25±4.47	25.52±2.18	＞100
  4k	16.34±1.73	13.07±4.35	11.05±3.68	28.36±2.13	＞100
  4l	＞100	＞100	65.89±2.09	＞100	＞100
  4m	25.47±1.80	＞100	24.61±1.71	＞100	＞100
  4n	27.96±2.57	＞100	25.40±0.94	＞100	＞100
  CPT	1.16±0.11	1.94±0.21	4.52±0.74	2.32±0.18	5.37±1.02
  Cisplatin	12.86±1.85	16.09±2.08	12.42±1.23	16.91±2.86	32.81±3.01
  aResults were expressed as means±SD (standard deviation) from triplicate assay in a single experiment, P＜0.05.

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