English

• 丙卡巴肼(procarbazine, Pcb), 化学名为N-异丙基- 4-(2'-甲基肼基)甲基苯甲酰胺, 属于肼类衍生物, 在体内可以被氧化酶如细胞色素P450单氧化酶和过氧化酶等转化为偶氮丙卡巴肼(azoprocarbazine)和N-氧偶氮丙卡巴肼(azoxyprocarbazine), 并进一步转化为甲基和芳基自由基^[1]. Pcb的抗肿瘤机制主要是通过烷化作用来实现, 因此, 它没有靶向作用, 导致了诸多副作用, 包括胃肠道紊乱(如恶心和呕吐)、骨髓抑制毒性(如白细胞和血小板减少)和中枢神经系统的影响(如头痛、抑郁、神经质和失眠).它对人体生殖系统也会造成影响, 比如损伤精子和导致卵巢衰竭等^{[2, 3]}.虽然如此, 因Pcb不与其他烷化剂、长春新碱(VCR)和皮质激素等交叉耐药, 它又重新进入人们的视野.近年来, 通过与阿霉素(Dox)、环磷酰胺(CTX)和VCR等联合用药, 在治疗霍奇金淋巴瘤和神经胶质瘤等肿瘤时取得了相当不错的治疗效果, 成为治疗黑色素瘤、肺癌和神经脑胶质瘤等联合用药中的一部分^{[4, 5]}.

  针对Pcb的临床毒副作用, 本课题组^[6]利用靶向药物设计的策略, 设计合成了靶向成纤维细胞激活蛋白酶α (FAPα)的新型抗肿瘤药物N-(Nꞌ-苄氧羰基甘氨酰脯氨酰)丙卡巴肼(Z-GP-Pcb), 并通过体外和体内实验证明了该化合物能够靶向FAPα, 酶切后释放抗癌活性成分Pcb, 在保持抗癌药效的同时降低了Pcb的生殖毒性以及骨髓抑制毒性, 是一个很有前景的候选广谱抗肿瘤新药.

  该工作通过5步合成Z-GP-Pcb.首先是Pcb的4步法合成, 然后直接用N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸(Z-GP- OH)与Pcb缩合得到终产物, 总收率32.2%.但在Pcb的合成中, 第一步采用SOCl₂将对甲基苯甲酸转化为对甲基苯甲酰氯, 这步反应对环境不友好.因为SOCl₂本身是低沸点的腐蚀性液体, 反应过程释放出SO₂和HCl, 对环境造成严重污染.另外, 第三步在100 ℃下利用Ce(NH₄)₂(NO₃)₆/HNO₃将N-异丙基-4-甲基苯甲酰胺转化为N-异丙基-4-甲酰基苯甲酰胺, 该反应采用了强氧化性、强腐蚀性试剂, 对环境不友好.另外需要在100 ℃下长时间反应, 比较耗能.因此, 有必要对Pcb的合成方法进一步优化, 探索一条环境更友好、更高效的合成途径.

  鉴于此, 本课题组在Z-GP-Pcb合成方面进行进一步探索, 实现了Pcb的三步合成(Scheme 1).另外, 考虑到Z-GP- Pcb有可能成为治疗脑瘤及神经胶质瘤的候选新药, 测试了Pcb和Z-GP-Pcb透过血脑屏障(BBB)的活性.

  图式 1

  

  图式 1.  Z-GP-Pcb的4步法合成

  Reagent and conditions: (a) dibromocyanuric acid/DCM, r.t., 3~4 h; then (CH₃)₂CHNH₂/Et₃N, r.t., 10 min, 92.1%; (b) IBX/DMSO, 80 ℃, 8~12 h, 88.6%; (c) methylhydrazinium sulfate/EtOH/Et₃N, r.t., 20 min, 60 ℃, 6 h; then NaBH₃CN/DMF, r.t., overnight, 75.2%; (d) Z-GP-OH, EDCI/HOBt/DIPEA, DCM, r.t., 3~4 h, 81.3%.

  Scheme 1.  Four-step synthesis of Z-GP-Pcb

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  1.   结果与讨论

  Z-GP-Pcb的合成路线如Scheme 1所示.首先是Pcb的合成.第一步采用将醛直接氧化酰胺化策略, 将起始原料4-甲基苯甲醛直接转化为N-异丙基-4-甲基苯甲酰胺, 所用试剂为二溴异氰尿酸(DBI).反应条件温和, 只需在室温下搅拌反应3~4 h, 收率高达92.1%.该方法是目前报道的直接将醛转化为酰胺的较好方法之一^[7].该反应的机理是, DBI首先将醛氧化为酰溴, 再与胺发生酰化反应得酰胺.第二步反应采用将N-异丙基-4-甲基苯甲酰胺上的甲基直接氧化为甲酰基的策略.关于将芳甲基直接氧化为芳醛的反应, 迄今已经报道了许多方法, 包括我们已经使用过的Ce(NH₄)₂(NO₃)₆/HNO₃氧化法^[6]、Na₂S₂O₈/AgNO₃或Ag(Py)₄S₂O₈氧化法^{[8, 9]}、Cu²⁺催化的Na₂S₂O₈氧化法^{[10, 11]}、(PhSeO)₂O在130 ℃下的氧化法^{[12, 13]}、H₂O₂/HBr在85 ℃下的氧化法^[14]和Br₂/二甲基亚砜(DMSO)在120 ℃下的氧化法^[15].这些氧化法存在需要使用强酸、有毒金属和反应条件难以控制等缺陷.为此, Togo等^[16]提出一锅法转化芳甲基成芳醛的策略, 但该方法需要将芳甲基溴化, 再用N-甲基吗啡啉氧化物氧化为芳醛.

  考虑到所合成的终产物为Z-GP-Pcb, 若需要先将N-异丙基-4-甲基苯甲酰胺转化为N-异丙基-4-溴甲基苯甲酰胺后再氧化, 没有采用曾经报道过的另一条合成路线^[17]方便.该路线是将N-异丙基-4-甲基苯甲酰胺在N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)/(PhCOO)₂作用下生成N-异丙基- 4-溴甲基苯甲酰胺, 再与N, N'-二甲酰基甲肼反应, 随后在浓盐酸的作用下脱去N上的甲酰基得到产物.最终, 采用2-碘酰基苯甲酸(IBX)在二甲基亚砜(DMSO)中的氧化法^[18]将N-异丙基-4-甲基苯甲酰胺上的甲基直接氧化为N-异丙基-4-甲酰基苯甲酰胺, 收率88.6%.该反应的机制已经被证实为单电子转移(SET)历程^[19].

  第三步反应采用传统的还原胺化方法, 收率75.2%.最后一步反应是Pcb与Z-GP-OH的缩合反应, 采用的缩合剂为1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳二亚胺(EDCI)/1-羟基苯骈三氮唑(HOBt), 收率为81.3%. EDCI首先将Z-GP-OH的羧基活化为混合酸酐, 在HOBt存在下转化为活泼酯, 然后与Pcb的肼基反应.文献[6, 20]采用的缩合剂为2-(7-氮杂苯骈三氮唑醇-1-基)-N, N, N', N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)/HOBt, 所报道的收率分别为69%和65%.显然, 用EDCI/HOBt作为缩合剂, 反应收率有很大程度提高, 我们认为这与EDCI的碳二亚胺结构对羧基具有较高的活化能力有关.

  近年来, Pcb已经作为联合用药的一部分用于脑瘤和神经胶质瘤的治疗^{[21, 22]}.作为治疗脑瘤和神经胶质瘤的药物, 首要条件是它们能够透过血脑屏障(BBB), Pcb无疑能够透过血脑屏障^[23].考虑到我们有意向将Z-GP-Pcb发展成为治疗脑瘤和神经胶质瘤的潜在候选药物, 因此, 在本研究中采用PAMPA-BBB体外测定法^{[24, 25]}评价了Z-GP-Pcb的透过血脑屏障活性.

  首先测试了7个上市药物的透膜常数(P_e), 并与文献[24]报道的数据对比, 验证方法的可靠性, 结果如表 1所示.将测试得到的上市药物的透膜常数(P_e)与文献数据对比, 得到的线性方程为: P_e(exp.)＝1.1719P_e(bibl.)-0.0221 (R²＝0.9404), 可以看出, 实测数据与文献报道的数据具有较好的线性关系(图 1A), 证实测试条件可行.

  表 1

  

  表 1  7个上市药物实测的透膜常数与文献报道数据比较

  Table 1.  Permeability in the PAMPA-BBB assay for 7 commercial drugs used in the experiment validation

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  Commercial drug	Bibl./(10-6 cm•s-1)	Pea/(10-6 cm•s-1)
  Testosterone	17	21.33±4.57
  Progesterone	9.3	7.71±0.33
  Piroxicam	2.5	5.60±0.82
  Hydrocortisone	1.9	1.35±0.54
  Atenolol	0.8	1.13±0.16
  Ofloxacin	0.8	0.29±0.22
  Theophtlline	0.1	0.38±0.31
  a [V(PBS):V(EtOH)＝70:30].

  图 1

  

  图 1.  PAMPA-BBB法实验结果

  Figure 1.  Experimental results of PAMPA-BBB assay

  (A) Lineal correlation between experimental and reported permeability of commercial drugs using the PAMPA-BBB assay; (B) experimental P_e values of Pcb and Z-GP-Pcb. ^*p < 0.05 vs Pcb group (n＝3).

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  综合文献报道的P_e临界值和实测值与文献值之间的线性关系, 得出两个临界P_e值:当化合物实测的P_e＞4.67×10^-6 cm•s^-1时, 该化合物能透过BBB; 当化合物实测的P_e＜2.32×10^-6 cm•s^-1时, 则不能透过BBB; 当化合物实测的P_e介于两者之间时, 不能判定该化合物是否能透过BBB.

  从图 1B的实验结果来看, Z-GP-Pcb的透膜常数为(19.22±4.25)×10^-6 cm•s^-1, 大于母药Pcb的透膜常数[(11.14±1.34)×10^-6 cm•s^-1].可见, 引入了Z-GP结构模块后, Z-GP-Pcb透过BBB的活泼性比Pcb要高, 证明该化合物有可能发展成为靶向抗脑瘤和神经胶质瘤的临床药物.当然, 这方面还需要有大量的在体药效实验进一步验证.

  2.   结论

  开发了3步法合成丙卡巴肼方法, 并以此为基础4步合成Z-GP-Pcb.首先以4-甲基苯甲醛为原料, 经DBI转化为N-异丙基-4-甲基苯甲酰胺.该化合物经IBX直接转化为N-异丙基-4-甲酰基苯甲酰胺, 随后还原胺化为Pcb, Pcb与Z-GP-OH缩合得总产物, 总收率49.9%.同时, 建立了体外PAMPA-BBB法评价Z-GP-Pcb透过BBB活性, 发现其透膜常数(P_e)为(19.22±4.25)×10^-6 cm•s^-1, 大于母药Pcb [(11.14±1.34)×10^-6 cm•s^-1], 推测Z-GP-Pcb可以很好透过血脑屏障.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  Bruker-AV 300 MHz型核磁共振仪(瑞士Bruker公司); DHG-9140A型恒温干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司); CLJBQ-3型恒温磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司); EYELA型旋转蒸发仪(东京理化器械独资工厂); LGJ-12冷冻干燥机(巩义市英峪予华仪器有限公司); FA2104型电子天平(上海恒平科学仪器有限公司); TU-1810S紫外分光光度计(北京普析通仪器有限公司); LC-UV100液相色谱仪(上海伍丰科学仪器有限公司); Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ色谱柱(Nacalai Tesque Inc., 日本); DZF-150型小型真空干燥箱(郑州长城科工贸有限公司); KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); RS-232熔点仪(美国SRS公司).

  4-甲基苯甲醛、异丙胺、二溴异氰脲酸、甲基肼硫酸盐、氰基硼氢化钠和2-碘酰基苯甲酸均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司; HOBt, HATU, EDCI和N, N-二异丙基乙胺(DIPEA)均购自上海吉尔生化有限公司.

  7个上市药物Testosterone、Progesterone、Piroxicam、Hydrocortisone、Atenolol、Ofloxacin和Theophtlline均购自Sigma和Alfa Aesar公司; 猪脑膜(PBL)购自Avanti Polar Lipids公司; 供体微版MAIPN4550和受体微版MATRNPS50均购自Millipore公司; 96-孔UV微版(Costar)购自Corning有限公司.

  二氯甲烷(DCM)加P₂O₅回流3~4 h, 蒸馏备用; 四氢呋喃(THF)加钠丝回流3~4 h, 蒸馏备用; 氟苯加无水硫酸镁回流4~6 h, 蒸馏备用; DMSO加CaH₂回流3~4 h, 减压蒸馏备用.

  3.2   实验方法

  3.2.1   N-异丙基-4-甲基苯甲酰胺的合成

  称取240.2 mg (2.0 mmol) 4-甲基苯甲醛于25 mL的圆底烧瓶中, 加入5.0 mL干燥DCM中, 称取343.2 mg (1.2 mmol)二溴异氰脲酸加入到体系中, 在室温下反应4 h, 称取303.3 mg (3.0 mmol)三乙胺和178.2 mg (3.0 mmol)异丙胺, 用2 mL DCM溶解后, 缓慢加入到反应体系中, 随后反应10 min, 薄层色谱(TLC)监测反应, 待反应毕, 加入50 mL水, 用DCM萃取三次(50 mL×3), 合并有机相, 再用水洗两次, 无水硫酸钠干燥后, 旋干有机溶剂得无色油状液体.硅胶柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚, V:V＝1:3), 得313. 3 mg白色固体化合物N-异丙基-4-甲基苯甲酰胺, 收率92.1%. m.p. 133~134 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7.64 (d, J＝8.2 Hz, 2H), 7.17 (d, J＝7.9 Hz, 2H), 4.31~4.19 (m, 1H), 2.35 (s, 3H), 1.23 (s, 3H), 1.22 (s, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ: 166.7, 141.5, 132.2, 129.1, 129.1, 126.9, 126.9, 41.8, 22.8, 21.4; ESI-HRMS calcd. for C₁₁H₁₆NO [M+H]⁺ 178.1226, found 178. 1226.以上数据与文献[6]同.

  3.2.2   N-异丙基-4-甲酰基苯甲酰胺的合成

  称取342.2 mg (2.0 mmol) N-异丙基-4-甲苯甲酰胺, 10 mL的氟苯/DMSO混合溶剂(体积比为2:1), 室温下分批加入1.68 g (6.0 mmol) 2-碘酰基苯甲酸, 搅拌下升温至85 ℃, 在此温度下反应8~10 h.停止反应, 混合物降至室温后, 搅拌下慢慢倒入加了碎冰的100 mL饱和NaCl水溶液, 用DCM萃取(100 mL×3), 合并有机相, 加入无水硫酸钠干燥, 过滤, 旋干有机溶剂得粗品, 用硅胶柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚, V:V＝1:5), 得白色固体N-异丙基-4-甲酰基苯甲酰胺191.1 mg, 收率88.6%. m.p. 151~152 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ: 10.01 (s, 1H), 8.02 (d, J＝1.6 Hz, 2H), 7.84 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 7.59 (d, J＝8.2 Hz, 1H), 4.10~4.30 (m, 1H), 1.31 (d, J＝6.6 Hz, 6H); ¹³C NMR (75 MHz, CD₃OD) δ: 193.5, 168.3, 130.6, 130.6, 129.0, 129.0, 128.1, 127.2, 43.4, 22.5, 22.5; ESI-HRMS calcd for C₁₁H₁₄NO₂ [M+ H]⁺ 192.1019, found 192.1018.以上数据与文献[6]相同.

  3.2.3   丙卡巴肼(Pcb)的合成

  称取191.1 mg (1.0 mmol) N-异丙基-4-甲酰基苯甲酰胺和504.5 mg (3.5 mmol)甲基肼硫酸盐于25 mL反应瓶中, 加入20.0 mL无水乙醇, 搅拌20 min后, 加入1.0 mL三乙胺, 于60 ℃条件下搅拌反应6 h.反应结束, 旋干溶剂, 加入10.0 mL的N, N-二甲基甲酰胺(DMF)将其重新溶解, 在0 ℃条件下分批加入125.6 mg (2.0 mmol)氰基硼氢化钠.加完后, 将反应体系逐渐升至室温, 反应过夜.反应结束后, 加水淬灭反应.加入200 mL的饱和NaCl水溶液, 用乙酸乙酯萃取(200 mL×3), 合并有机相, 加入无水硫酸钠干燥, 过滤, 旋干得粗品.粗品经硅胶柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚, V:V＝1:3), 得丙卡巴肼164.5 mg, 收率75.2%. m.p. 144~145 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CD₃OD) δ: 7.86 (d, J＝8.3 Hz, 2H), 7.54 (d, J＝8.3 Hz, 2H), 4.24~4.19 (m, 3H), 2.87 (s, 3H), 1.27 (d, J＝6.6 Hz, 6H); ¹³C NMR (75 MHz, CD₃OD) δ: 168.8, 136.1, 130.1, 130.1, 129.0, 128.8, 128.8, 52.9, 43.1, 35.5, 22.5, 22.5; ESI-HRMS calcd for C₁₂H₂₀N₃O [M+ H]⁺ 222.1601, found 222.1602.以上数据与文献[6]相同.

  3.2.4   N-(N'-苄氧羰基甘氨酰脯氨酰)丙卡巴肼(Z-GP-Pcb)的合成

  称取612.2 mg (2.0 mmol)N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸, 283.2 mg (2.1 mmol) HOBt和402.2 mg (2.1 mmol) EDCI溶于10 mL干燥DCM, 将其倒入50 mL圆底烧瓶中, 加入0.3 mL DIPEA, 将反应瓶置于0 ℃条件下搅拌活化30 min, 得活化液A.随后, 称取442.1 mg (2.0 mmol)丙卡巴肼溶于5 mL干燥DCM, 将其倒入10 mL圆底烧瓶中, 加入DIPEA 0.5 mL, 反应30 min后, 将活化液A缓慢滴加到反应瓶中, 随后将反应瓶移至室温反应3~4 h.待反应毕, 加入50.0 mL饱和NaCl水溶液, 用DCM萃取(50 mL×3), 合并有机相, 依次用水、饱和NaCl溶液洗涤, 无水Na₂SO₄干燥, 过滤, 旋干得粗品.粗品经硅胶柱层析纯化(CHCl₃/MeOH, V:V＝10:1)和RP-HPLC分离纯化(淋洗剂为MeOH/水, V:V＝50:50, V/V), 得863.1 mg白色固体, 收率81.3%, m.p. 102~103 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7.77~7.68 (m, 2H), 7.42~7.31 (m, 7H), 5.08 (s, 2H), 4.31~4.20 (m, 1H), 4.15~4.01 (m, 2H), 3.96~3.93 (m, 1H), 3.87 (s, 2H), 3.60~3.40 (m, 2H), 3.14 (s, 3H), 2.10~1.67 (m, 4H), 1.24 (d, J＝6.5 Hz, 6H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ: 174.1, 166.8, 166.5, 156.3, 139.9, 136.5, 134.5, 129.5, 129.2, 129.0, 129.0, 128.6, 128.5, 127.3, 127.3, 127.1, 66.9, 56.8, 52.7, 46.4, 43.4, 42.1, 33.2, 29.0, 24.7, 22.8, 22.8; ESI-HRMS calcd for C₂₇H₃₆N₅O₅ [M+H]⁺ 510.2711, found 510.2713.以上数据与文献[6]一致.

  3.2   体外透过血脑屏障活性评价(PAMPA-BBB法)

  3.3.1   试剂配制

  (1) 质量分数为2%的猪脑组织提取物(PBL)溶液(现配现用):称取20 mg PBL, 加入1.0 mL十二烷, 超声溶解.

  (2) 50 mmol•L^-1磷酸缓冲盐溶液(PBS):称取41.36 g K₂HPO, 加入200 mL去离子水, 用少量KOH水溶液调节溶液pH值至7.4.

  (3) 5 mg/mL对照药物储备液:精密称定对照药物5.0 mg, 加DMSO溶解配制成浓度5 mg/mL的对照药物储备液.

  (4) 5 mg/mL测试药物储备液:精密称取测试一定量化合物, 用DMSO配制为10 mmol•L^-1的储备液, 再根据不同化合物的分子量换算稀释成浓度为5 mg/mL.

  (5) 25 µg/mL对照药物、测试化合物测试液:取5 µL储备液, 加995 µL pH＝7.4的PBS/乙醇(V:V＝70:30)溶液稀释制备而成, 化合物应不析出.

  3.3.2   PAMPA-BBB法实验步骤

  取4 µL质量分数为2%的猪脑组织提取物(PBL)溶液加于MAIPN4550的96孔板的疏水膜上, 沿壁轻轻滴入, 避免枪头直接触碰疏水膜; 吸取200 µL待测样品液(100 µg/mL)加入到96孔板中的膜上方作为给药池, 膜的另一侧底部为MATRNPS50的接收板, 加入300 µL缓冲溶液(pH 7.4的PBS/乙醇, V:V＝70:30)为接受池, 注意保持接受液与膜平行放置, 充分接触, 室温静止10 h后, 小心移除给药池, 用紫外光谱仪测试接受池内化合物吸光度值(250~500 nm).将200 µL待测样品液与300 µL缓冲溶液(pH 7.4的PBS/乙醇, V:V＝70:30)充分混匀, 作为理论平衡溶液, 测试其吸光度值(250~500 nm), 选取化合物最大吸收波长进行检测.根据如下公式计算P_e值:

  (1)

  其中, V_d:给药池体积(上层); V_a:接受池体积(下层); A:疏水膜表面积; t:作用时间; [drug]_acceptor:接收池中化合物吸光度; [drug]_equilibrium:理论上接收池中化合物吸光度.

  辅助材料(Supporting Information)   N-异丙基-4-甲基苯甲酰胺、N-异丙基-4-甲酰基苯甲酰胺、丙卡巴肼(Pcb)和N-(N'-苄氧羰基甘氨酰脯氨酰)丙卡巴肼(Z-GP-Pcb)的¹H NMR、¹³C NMR以及HRMS谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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  图式 1  Z-GP-Pcb的4步法合成

  Scheme 1  Four-step synthesis of Z-GP-Pcb

  Reagent and conditions: (a) dibromocyanuric acid/DCM, r.t., 3~4 h; then (CH₃)₂CHNH₂/Et₃N, r.t., 10 min, 92.1%; (b) IBX/DMSO, 80 ℃, 8~12 h, 88.6%; (c) methylhydrazinium sulfate/EtOH/Et₃N, r.t., 20 min, 60 ℃, 6 h; then NaBH₃CN/DMF, r.t., overnight, 75.2%; (d) Z-GP-OH, EDCI/HOBt/DIPEA, DCM, r.t., 3~4 h, 81.3%.

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  图 1  PAMPA-BBB法实验结果

  Figure 1  Experimental results of PAMPA-BBB assay

  (A) Lineal correlation between experimental and reported permeability of commercial drugs using the PAMPA-BBB assay; (B) experimental P_e values of Pcb and Z-GP-Pcb. ^*p < 0.05 vs Pcb group (n＝3).

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  表 1  7个上市药物实测的透膜常数与文献报道数据比较

  Table 1.  Permeability in the PAMPA-BBB assay for 7 commercial drugs used in the experiment validation

  Commercial drug	Bibl./(10-6 cm•s-1)	Pea/(10-6 cm•s-1)
  Testosterone	17	21.33±4.57
  Progesterone	9.3	7.71±0.33
  Piroxicam	2.5	5.60±0.82
  Hydrocortisone	1.9	1.35±0.54
  Atenolol	0.8	1.13±0.16
  Ofloxacin	0.8	0.29±0.22
  Theophtlline	0.1	0.38±0.31
  a [V(PBS):V(EtOH)＝70:30].

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