English

• 肼的高还原性使其在医药、化工等领域得到了广泛的应用^[1].肼有较高的燃烧热, 是一种有用的航空航天推进剂^[2].然而, 肼对人体内脏有严重损伤作用, 对人体神经系统产生损伤^[3].动物实验证明, 肼还具有遗传毒性.美国环境保护署(EPA)规定饮用水中肼的含量应低于0.312 μmol•L^-1[4].因此, 开发一种有效可靠的检测肼的方法是十分必要的.

  许多经典的方法已用于肼的检测, 如气相色谱法、电化学方法和紫外光谱法等.然而, 这些方法存在操作复杂及耗时等缺点^[5~7].与之相比, 荧光法具有灵敏度高和操作简单等优点.根据识别点, 我们可以将肼探针分为乙酸酯类^[8~10]、醛类^[11~13]、氰基乙烯类^[14~16]、邻苯二甲酰亚胺类^{[17, 18]}、4-溴丁酸酯类^[19~21]、乙酰丙酸酯类^[22~23]、β-二酮类^{[24, 25]}、α, β-不饱和羰基几类^[26~28]等^[29~32].虽然文献已经报道多种反应型肼探针, 这些探针仍有一定的局限性, 如选择性差(尤其是胺类化合物容易对肼检测产生干扰)和对肼的灵敏度低等.我们提出将双位点协同效应引入到肼探针的设计中, 在发色团上引入两种不同的识别位点.只有两种识别位点均与探针反应, 才能引起相应的荧光变化, 提高探针对肼的选择性.另外, 利用两种不同的响应机制, 可以产生两种效应的协同, 从而提高探针对肼的灵敏性.近年来, 我们^{[33, 34]}报道了两种基于协同效应的肼荧光探针, 该探针对肼均具有较高的选择性和敏感性.作为这一策略的进一步研究, 我们以1, 8-萘酰亚胺为荧光团, 设计合成了一种新型肼探针(Scheme 1).该探针的设计思想在于, 同时采用乙酸酯基和邻苯二甲酰亚胺作为识别位点, 近似“双锁原理”, 可以提高探针对肼的选择性; 对探针两种不同分子内电荷转移(ICT)过程进行调控, 两种效应的叠加使得探针对肼的灵敏度得到了提高.

  图式 1

  

  图式 1.  探针的合成路线

  Scheme 1.  Synthetic procedure of the probe

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  1.   结果与讨论

  1.1   紫外光谱和荧光光谱研究

  研究了在肼存在下探针的吸收光谱和发射光谱变化.实验结果显示, 游离探针在310 nm处有最大吸收.随着肼的加入, 310 nm处的吸收峰逐渐减弱.同时, 在454 nm处出现新的吸收峰, 并在360 nm处出现等吸收点.溶液的颜色由无色逐渐变为橙色, 显示该探针可用于肼的比色检测.

  通过荧光滴定实验对探针与肼的相互作用进行了研究.如图 1所示, 在365 nm激发波长下, 探针在398 nm处显示最大发射峰.随着肼的添加, 探针在398 nm处的荧光强度逐渐减弱, 而510 nm处的荧光强度逐渐增强.当肼的浓度达到探针的150倍时, 510 nm处的荧光强度达到平衡.随着肼的加入, 探针溶液的荧光颜色逐渐由蓝色变为绿色.在510 nm处探针的荧光强度与N₂H₄浓度(0.05~10.0 μmol•L^-1)呈线性关系(R²＝0.997).根据LOD＝3σ/k, 计算出探针对肼的检测限为0.014 μmol•L^-1, 低于美国环境保护署规定的0.312 μmol•L^-1.

  图 1

  

  图 1.  探针的荧光滴定曲线

  Figure 1.  Fluorescence titration curve of the probe

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  1.2   滴定体系pH筛选

  为了获得更好的检测灵敏度, 分别对溶液的酸碱度和反应时间进行了优化.研究了不同pH值(3.0~12.0)溶液中探针对肼的荧光响应.实验结果显示, 在没有肼的情况下, 在pH 3.0~7.0的范围内探针没有明显的荧光变化, 这说明探针本身在3.0~7.0范围内是稳定的.探针与肼作用后, 在pH 4.0~7.0之间荧光强度变化较大, 并且在pH值为6时荧光强度变化最大.

  1.3   选择性识别研究

  实际样品的复杂性要求该探针对肼的选择性必须高于其它干扰物.因此考察了多种可能的干扰物, 包括各种阳离子(Mg²⁺, Hg²⁺, Ca²⁺, K⁺, Na⁺, NH₄⁺)、阴离子(F^-, Br^-, NO₂^-, OAc^-)、氨基酸(GSH, Pro, Hcy)和胺类[semicarbazide hydrochloride (SEM), urea, isoniazid (Inh)].如图 2所示, 除肼以外, 所有这些干扰物均未产生显著的荧光变化.随后, 利用该探针对实际水样(自来水)中的肼进行了检测.分别在自来水和蒸馏水中加入一定量的肼, 调节pH至6.0, 测试荧光变化.实验表明, 在一定浓度范围(2.5~7.5 μmol•L^-1)内, 两种溶剂体系的荧光强度基本一致.在自来水和蒸馏水中肼的回收率分别为97.20%~99.60%和99.20%~102.60%.结果表明, 该探针具有较强的抗干扰能力, 可用于实际水样中肼的检测.

  图 2

  

  图 2.  肼及各种干扰物对探针荧光强度的影响

  Figure 2.  Fluorescence response of hydrazine and various interfering substances to the probe

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  1.4   识别机理研究

  为了阐明识别机理, 对识别产物进行了分离和表征, 并与探针的谱图进行了对比.对探针与产物的氢谱进行比较发现, 探针在δ 2.53处的质子峰消失, 说明乙酯基发生了肼解.与此同时, 识别产物的芳香氢由δ 8.62向高场移至δ 8.26, 表明醛基转化为亚胺结构.对比探针与识别产物的红外光谱发现, 探针在1767和1704 cm^-1处有红外吸收, 分别归属于酯羰基和醛羰基.随着肼的加入, 1767和1704 cm^-1处的红外吸收消失, 而在3400和1694 cm^-1处出现红外吸收, 这两个吸收峰归属于腙.实验结果证明, 酯基发生肼解, 同时醛基与肼反应生成腙(Scheme 1).利用高分辨质谱对识别产物进行了确认(calcd for C₁₇H₁₈N₃O₃ [M+H]⁺ 312.1348, found 312.1341).并且分别测定了识别产物的紫外光谱和荧光光谱, 并与探针的紫外滴定和荧光滴定图相比较, 发现二者基本吻合.

  图式 2

  

  图式 2.  可能的识别机理

  Scheme 2.  Proposed mechanisms for the detection of N₂H₄

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  1.5   理论计算

  为了进一步将探针的结构变化与光学响应相关联, 利用高斯软件(Gaussian 09 program), 通过密度函数理论(hf/3-21g method)进行了计算.结果表明, 在探针中基态的电子云主要分布在萘环部分, 而激发态的电子云移至醛基部分, 这表明在萘环与醛基之间存在着分子内电荷转移(ICT).与肼反应后, 基态电子主要分布在萘酚部分, 在激发下电子会转移至萘环部分, 说明酚羟基与萘环间同样存在着ICT.此外, 探针和产物最低空轨道与最高已占轨道之间的能级差分别为9.73和9.48 eV, 该计算结果与紫外光谱的红移相一致.

  1.6   细胞成像研究

  鉴于该探针对肼具有良好的识别性能, 将该探针应用于细胞中肼的检测.首先, 用噻唑蓝(MTT)法测定了探针的细胞毒性. MTT实验表明, 该探针对活细胞具有较低的细胞毒性.随后, 使用BT-474细胞来研究探针在细胞成像中的实际应用.当BT-474细胞与探针(5 μmol• L^-1)共孵育24 h后, 细胞呈蓝色荧光, 绿色通道内未见荧光(图 3).当BT-474细胞与探针(5 μmol•L^-1)共孵育24 h后, 再与不同浓度的N₂H₄ (15, 30和45 μmol•L^-1)孵育1 h, 绿色通道的荧光强度逐渐增强, 蓝色通道的荧光强度逐渐减弱并消失.细胞成像实验证明, 该探针可以用于细胞中肼的检测.虽然肼不是细胞的内源性物质, 但当人体服用某些药物如异烟肼后, 会在细胞新陈代谢过程中释放出肼, 这是异烟肼产生毒副作用的重要原因.通过该探针对细胞中肼的检测, 可以个体化地限定服药剂量, 防止药物中毒的发生, 同时该探针还有可能作为异烟肼毒副作用的保护剂.

  图 3

  

  图 3.  BT-474细胞与探针和肼孵育的共聚焦图像

  Figure 3.  Confocal images of BT-474 cells incubated with the probe and further incubated with hydrazine

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  2.   结论

  基于双位点协同效应, 我们设计合成出一种新型肼荧光探针.该探针对肼具有良好的选择性, 各种可能的干扰物如阳离子、阴离子、氨基酸和胺类均未其识别作用产生影响.该探针对肼的检测限为0.05~10.0 μmol• L^-1, 低于EPA规定的0.312 μmol•L^-1.细胞成像实验表明, 该探针可用于细胞中肼的检测.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  Bruker核磁共振仪(400 MHz); Apex Ultra 7.0T Bruker质谱仪; Agilent G9800A型荧光光谱仪(美国Agilent公司); UV-3600型分光光度计(美国Agilent公司); Thermo Nicolet iS10红外光谱仪(美国Thermo公司); ZEISS LSM 880激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司).柱层析用硅胶(200~300目), 实验室所用试剂均为市售分析纯试剂.

  3.2   实验方法

  3.2.1   化合物HO-NPT-CHO的合成

  将化合物HO-NPT (1.000 g, 3.71 mmol)溶解于5 mL三氟乙酸中, 加入六次甲基四胺(1.041 g, 7.42 mmol), 加热至80 ℃回流反应12 h.冷却至室温, 将反应物倒入冰水中, 有大量黄色固体析出.抽滤, 并用冷的乙醇洗涤, 干燥.粗产物经柱层析分离[V(DCM): V(MeOH)＝100:1], 得750 mg黄色固体HO-NPT-CHO, 产率60%. m.p. 203.5~204.5 ℃; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 13.21 (s, 1H), 10.16 (s, 1H), 8.75 (dd, J＝8.0, 4.0 Hz, 3H), 7.84 (t, J＝8.0 Hz, 1H), 4.21 (t, J＝8.0 Hz, 2H), 1.80~1.72 (m, 2H), 1.55~1.45 (m, 2H), 1.02 (t, J＝8.0 Hz, 3H); ¹³C NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 196.42, 165.65, 163.64, 162.98, 134.84, 134.07, 131.74, 130.29, 127.01, 122.84, 122.81, 115.14, 114.87, 40.29, 30.18, 20.35, 13.83; HRMS (ESI) cald for C₁₇H₁₄NO₄ [M－H]^－ 296.0928, found 296.0933.

  3.2.2   探针AcO-NPT-CHO的合成

  将化合物HO-NPT-CHO (500 mg, 1.68 mmol)溶解于2 mL乙酸酐中, 加热至140 ℃回流反应12 h.冷却至室温, 将反应液倒至冰水中, 加二氯甲烷萃取.有机相加无水硫酸钠干燥, 过滤, 蒸除溶剂, 柱层析分离[V(DCM):V(MeOH)＝100:1], 得400 mg的黄色黄色固体化合物AcO-NPT-CHO, 产率70%. m.p. 193.8~194.8 ℃; ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 8.62 (s, 1H), 8.55 (d, J＝8.0 Hz, 1H), 8.40 (d, J＝8.0 Hz, 1H), 8.01 (s, 1H), 7.94 (t, J＝8.0 Hz, 1H), 4.04 (t, J＝8.0 Hz, 2H), 2.57 (s, 3H), 1.59~1.67 (m, 2H), 1.34~1.40 (m, 2H), 0.94 (t, J＝8.0 Hz, 3H); ¹³C NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ: 168.91, 168.45, 163.70, 163.15, 149.34, 132.30, 130.04, 129.46, 128.37, 127.91, 126.59, 125.66, 123.06, 121.50, 84.24, 40.35, 30.17, 20.72, 13.83; HRMS (ESI) calcd for C₁₉H₁₈- NO₅ [M+H]⁺ 340.1179, found 340.1176.

  3.2.3   光谱测试

  探针AcO-NPT-CHO用N, N-二甲基甲酰胺(DMF)配制溶液, 测试浓度为10 μmol•L^-1.测试溶液均为DMF-PBS溶液(V:V＝1:1, 10 mmol•L^-1 PBS缓冲液, pH 8.0), 选择性测试所用各种干扰离子均为钠盐或钾盐, 测试浓度均为15.0 mmol•L^-1.紫外光谱和荧光光谱均在室温下测试, 样品池为1 cm×1 cm×4 cm石英比色皿, 激发波长为365 nm, 激发和发射狭缝宽度均为5 nm.

  3.2.4   细胞实验

  Bt-474细胞接种于成像专用的细胞培养皿, 密度为2×10⁵个/孔.探针组加入探针AcO-NPT-CHO (5 μmol•L^-1)孵育24 h.外源肼(N₂H₄)成像组分别加入15, 30, 45 μmol•L^-1继续孵育1 h.共聚焦荧光成像激发波长为365 nm, 收集范围450~500 nm.

  辅助材料(Supporting Information)   所合成化合物HO-NPT-CHO, AcO-NPT-CHO及识别产物的核磁、质谱、红外谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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  图式 1  探针的合成路线

  Scheme 1  Synthetic procedure of the probe

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  图 1  探针的荧光滴定曲线

  Figure 1  Fluorescence titration curve of the probe

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  图 2  肼及各种干扰物对探针荧光强度的影响

  Figure 2  Fluorescence response of hydrazine and various interfering substances to the probe

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  图式 2  可能的识别机理

  Scheme 2  Proposed mechanisms for the detection of N₂H₄

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  图 3  BT-474细胞与探针和肼孵育的共聚焦图像

  Figure 3  Confocal images of BT-474 cells incubated with the probe and further incubated with hydrazine

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