含吲哚的吡唑并[3, 4-d]嘧啶衍生物的设计合成及其生物活性研究

孙晓阳 冯思冉 董金娇 冯佳佳 刘振明 宋亚丽 乔晓强

引用本文: 孙晓阳, 冯思冉, 董金娇, 冯佳佳, 刘振明, 宋亚丽, 乔晓强. 含吲哚的吡唑并[3, 4-d]嘧啶衍生物的设计合成及其生物活性研究[J]. 有机化学, 2020, 40(2): 391-397. doi: 10.6023/cjoc201907006 shu
Citation:  Sun Xiaoyang, Feng Siran, Dong Jinjiao, Feng Jiajia, Liu Zhenming, Song Yali, Qiao Xiaoqiang. Design, Synthesis and Biological Activity of Pyrazolo[3, 4-d]pyrimidine Derivatives Containing Indole Moiety[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2020, 40(2): 391-397. doi: 10.6023/cjoc201907006 shu

含吲哚的吡唑并[3, 4-d]嘧啶衍生物的设计合成及其生物活性研究

    通讯作者: 宋亚丽, yalisong@hbu.edu.cn; 乔晓强, xiaoqiao@hbu.edu.cn
  • 基金项目:

    河北省自然科学基金(No.B2018201269、河北省高等学校科学技术研究项目(No.ZD2019060)、国家自然科学基金(No.21675039)、河北省青年拔尖人才资助项目

摘要: 利用药物设计中的生物活性基团拼接原理,设计合成了13个含吲哚的吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物.目标化合物均经核磁共振氢谱(1H NMR)、核磁共振碳谱(13C NMR)和高分辨质谱仪(HRMS)进行了结构确证.对4株肿瘤细胞(HeLa、MGC-803、MCF-7、BEL-7404)的体外抗增殖活性实验结果表明,目标化合物均表现出一定的抗肿瘤活性,MCF-7、MGC-803肿瘤细胞株敏感度高于HeLa和BEL-7404.其中,6-[(6-甲氧羰基吲哚-3-基)硫基]-1-苯基-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-酮(5m)表现出较好的体外肿瘤抑制活性,对MCF-7、MGC-80和HeLa细胞的IC50均小于30 μmol·L-1,对MCF-7的IC50值为(4.02±0.92)μmol·L-1,优于对照药物依托泊苷(10.1±0.62 μmol·L-1)和羟喜树碱(5.93±0.56 μmol·L-1).拓扑异构酶抑制实验结果表明,此类化合物对Topo Ⅱ有选择性抑制活性,所有化合物对Topo Ⅱ表现出不同程度抑制活性,对Topo Ⅰ未表现出抑制活性.

English

  • 吡唑并[3, 4-d]嘧啶由吡唑环与嘧啶环稠合而成, 作为结构类似嘌呤的融合杂环系统具有重要的化学和药理学意义[1~3], 本身具有抗炎[4]、抗菌[5~7]、抗病毒[8, 9]、抗心血管病[10, 11]、抗肿瘤[12~15]等多种生物活性.吡唑并[3, 4-d]嘧啶类化合物作为潜在的抗肿瘤化合物具有体外肿瘤抑制活性强、靶点多等优点[16, 17].近年来, 设计合成不同基团修饰的吡唑并[3, 4-d]嘧啶衍生物, 进而筛选具有高效生物活性的化合物, 是广大科研人员研究热点之一.

    吲哚类衍生物由于其天然产物的丰富性和药理作用的广泛性, 在药物合成中引起了广泛的关注[18, 19].吲哚核可以通过色氨酸的形式构建成蛋白质, 经常用作抗肿瘤药物的母核或修饰基团, 成为国内外药物开发领域的研究热点[20, 21].

    鉴于吡唑并[3, 4-d]嘧啶类化合物和吲哚类化合物的抗肿瘤作用, 本文根据药物设计中的生物活性基团拼接原理[22], 将吲哚和吡唑并[3, 4-d]嘧啶引入同一分子中, 设计合成13个目标化合物.目标化合物的结构均通过核磁共振氢谱、碳谱和高分辨质谱进行确证, 同时利用4种人源肿瘤细胞(HeLa、MGC-803、MCF-7、BEL-7404)对目标化合物进行了抗肿瘤活性测试, 结果表明目标化合物对4株肿瘤细胞表现出中等程度的抑制活性.分子对接研究表明, 目标化合物与Topo Ⅱ有较强的结合力.

    图 1

    图 1.  含吲哚的吡唑并[3, 4-d]嘧啶衍生物设计
    Figure 1.  Design of pyrazolo[3, 4-d]pyrimidine derivatives possessing indole moiety

    本研究以2-氰基-3-乙氧基丙烯酸乙酯(1)为起始原料, 首先与苯肼(水合肼)环合生成吡唑类化合物2[23, 24], 然后在无水乙腈中与苯甲酰异硫氰酸酯反应生成化合物3[25].化合物3在2 mol/L NaOH溶液中100 ℃下回流20 min后, 乙酸酸化, 环化生成中间化合物4[26, 27].最后化合物4与含不同取代基的吲哚发生亲电取代得到目标化合物5[28].

    图式 1

    图式 1.  目标化合物的合成
    Scheme 1.  Synthetic route of target compound

    目标化合物均经核磁共振氢谱、碳谱、高分辨质谱表征确认.以化合物5m为例进行波谱分析, 解析结果如下: 1H NMR谱图中在δ 12.91 (s, 1H)为嘧啶酮环氮上的质子峰, δ 12.22 (s, 1H)为吲哚环氮上的质子峰, δ 8.19 (s, 1H)为吡唑环碳上质子峰, δ 8.27 (s, 1H), 7.75 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.66 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.41 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.10~7.13 (m, 1H), 6.93~6.95 (m, 2H)处为苯环与吲哚环上的质子峰, 3.90 (s, 3H)为甲氧基上质子峰. 13C NMR谱图中碳原子信号的化学位移分别为δ: 167.0, 161.1, 157.6, 151.4, 138.0, 137.0, 136.1, 136.0, 132.8, 128.4, 126.1, 123.3, 121.0, 120.0, 118.6, 114.0, 104.6, 95.6, 51.7.其中酯羰基与嘧啶环上酮羰基碳的信号峰分别为δ: 167.0, 161.1, 与硫原子相连的嘧啶环碳的信号峰为δ 157.6, 酯基中甲氧基碳原子的信号峰为δ 51.7, 其余分别为苯环、吲哚环、吡唑环碳原子的信号峰, 其中δ 132.8, 120.0分别为苯环上两两对称的碳的重叠碳信号峰. HRMS谱图显示C21H15N5O3S [M-H]计算值416.0817, 测量值416.0820, 可以确认为化合物5m的分子离子峰.

    含吲哚的吡唑并[3, 4-d]嘧啶类化合物的反应机理[28](图 2)推测如下:首先, 吡唑并[3, 4-d]嘧啶母环上的硫代羰基互变为烯醇巯基, 巯基与I2反应生成亲电中间产物A, A与吲哚反应得到中间体B, B重排脱去HI得到目标化合物5, 反应生成的HI被H2O2氧化成I2继续参与反应.

    图 2

    图 2.  反应机理
    Figure 2.  Proposed mechanism

    以HeLa, MGC-803, MCF-7, BEL-7404四种肿瘤细胞为受试细胞, 采用噻唑蓝(MTT)法法对13个化合物进行了肿瘤抑制活性评价.羟喜树碱(CPT)和依托泊苷(Etoposide)作为阳性对照.测试结果如表 1所示.通过分析比较其IC50值发现:目标化合物均对MGC-803和MCF-7肿瘤细胞表现出较好的抑制活性, 对HeLa和BEL-7404肿瘤细胞抑制活性较差, 且当目标化合物R1基团为Ph时肿瘤抑制活性活性强于H.其中, 化合物5i, 5l对MGC-803肿瘤细胞有较好活性, 其IC50值分别为(7.82±1.06) μmol•L-1, (14.5±0.47) μmol•L-1; 化合物5m抗肿瘤活性最好, 对HeLa, MGC-803和MCF-7三种肿瘤细胞IC50值均小于30 μmol•L-1, 对MCF-7的IC50值为(4.02±0.92) μmol•L-1, 优于对照药物依托泊苷[(10.1±0.62) μmol•L-1]和羟喜树碱[(5.93±0.56) μmol• L-1].化合物5m可以作为一个潜力抗癌分子进行进一步研究.

    表 1

    表 1  化合物5a~5m体外肿瘤抑制活性IC50
    Table 1.  Anticancer activity of compounds 5a to 5m as IC50
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    Compd. IC50/(μmol•L-1)
    HeLa MGC-803 MCF-7 BEL-7404
    5a 48.11±0.83 27.97±0.88 38.42±0.92 >60
    5b >60 >60 59.55±0.67 >60
    5c >60 >60 >60 >60
    5d 47.17±1.34 >60 >60 >60
    5e >60 42.81±1.14 31.12±0.77 >60
    5f >60 48.68±0.53 49.48±1.07 >60
    5g >60 44.01±1.13 52.90±1.65 >60
    5h >60 34.76±0.55 59.92±0.80 >60
    5i 41.86±0.58 7.82±1.06 56.66±0.75 >60
    5j >60 37.51±0.71 >60 >60
    5k >60 >60 40.89±0.92 >60
    5l 43.27±1.65 14.5±0.47 26.26±0.83 >60
    5m 14.85±1.17 28.11±3.60 4.02±0.92 >60
    CPT 3.26±0.30 4.35±0.47 5.93±0.56 13.64±0.39
    Etoposide 3.02±0.80 2.61±0.74 10.1±0.62 9.45±1.38
    1.5.1   拓扑异构酶Ⅰ活性测试

    适当实验条件下, Topo Ⅰ可以使DNA解旋, 变成松弛状态的DNA, 若化合物5a~5m能抑制Topo Ⅰ活性, 超螺旋态的pBR322质粒DNA将无法解旋成松弛型DNA.由图 3可知, 化合物5在浓度100 μmol•L-1时对Topo Ⅰ没有表现出抑制活性.

    1.5.2   拓扑异构酶Ⅱ活性测试

    适当实验条件下, Topo Ⅱ可以使DNA解旋, 变成松弛状态的DNA, 同理, 若化合物5a~5m能抑制Topo Ⅱ活性, 超螺旋态的pBR322质粒DNA将无法解旋成松弛型DNA.由图 4可知, 化合物5a~5m在浓度100 μmol• L-1时对Topo Ⅱ表现出较强抑制活性.化合物5a~5m系列为Topo Ⅱ选择性抑制剂.

    图 3

    图 3.  化合物5a~5m对Topo Ⅰ的抑制活性

    D: pBR322 DNA; T: pBR322 DNA+Topo Ⅰ; C: pBR322 DNA+Topo I+CPT; 5a~5m: pBR322 DNA+Topo Ⅰ+compounds 5a~5m

    Figure 3.  Enzymatic inhibitory activities of compounds 5a~5m against Topo Ⅰ

    图 4

    图 4.  化合物5a~5m对Topo Ⅱ的抑制活性

    D: pBR322 DNA; T: pBR322 DNA+Topo Ⅱ; E: pBR322 DNA+Topo Ⅱ+Etoposide; 5a~5m: pBR322 DNA+Topo Ⅱ+compounds 5a~5m

    Figure 4.  Enzymatic inhibitory activities of compounds 5a~5m against Topo Ⅱ

    考察了化合物5m和Etoposide与人类Topo Ⅱ (PDB ID: 3QX3)的对接研究结果, 从理论角度分析了化合物5m与Topo Ⅱ的活性位点关键残基的结合模式.

    图 5为DNA-Etoposide-Topo Ⅱ复合物的配体0.5 nm范围内的2D结构图, 从图中可以看出: Etoposide被DC7、DG11、DG13、GLN778和ASP479等残基包围, 位于Topo Ⅱ活性位点中心.其中, B环与E环上的羟基分别与DG13和ASP479残基通过氢键相互作用, B环中氧原子可以与GLN778残基形成氢键相互作用, C环与DG13残基形成π-π相互作用.

    图 5

    图 5.  Etoposide-Topo Ⅱ的结合模式图
    Figure 5.  Proposed binding mode of Etoposide with Topo Ⅱ

    图 6为DNA-化合物5m-Topo Ⅱ复合物的配体0.5 nm范围内的2D结构图, 图中可以看出:化合物5m上的吲哚环可以与AGR503、DA12、DG13、DG10等关键残基形成π-π相互作用, 吲哚环上酯基与LYS456形成氢键相互作用, 另外吡唑并[3, 4-d]嘧啶也可以与Topo Ⅱ产生疏水作用力.由此可知, 化合物5m可以进入Topo Ⅱ的活性口袋, 与Topo Ⅱ-DNA共价复合物结合稳定该复合物, 从而表现出Topo Ⅱ的抑制活性.

    图 6

    图 6.  化合物5m-Topo Ⅱ的结合模式图
    Figure 6.  Proposed binding mode of compounds 5m with Topo Ⅱ

    本文利用药物设计中的生物活性基团拼接原理, 设计合成了13个含吲哚的吡唑并[3, 4-d]嘧啶类衍生物.细胞抗增殖实验测试结果表明:目标化合物整体表现出中等程度的抗肿瘤活性, 对MCF-7、MGC-803肿瘤细胞株敏感度高于HeLa和BEL-7404.其中, 化合物5m表现出较好的体外抗肿瘤抑制活性, 对MCF-7、MGC-80和Hela细胞的IC50均小于30 μmol•L-1, 对MCF-7的IC50达到了(4.02±0.92) μmol•L-1, 优于对照药物依托泊苷[(10.1±0.62) μmol•L-1]和羟喜树碱[(5.93±0.56) μmol•L-1].化合物R1基团为Ph时肿瘤抑制活性活性强于H.拓扑异构酶抑制实验结果表明, 所有化合物在100 μmol•L-1浓度下对Topo Ⅰ未表现出抑制活性, 对Topo Ⅱ表现出不同程度抑制活性, 此类化合物对Topo Ⅱ有选择性抑制活性.

    SGW X-4显微熔点仪(上海精密仪器科技有限公司, 未校正); Bruker AVIII-600 MHz核磁共振波谱仪(Bruker); Q EXACTIVE高分辨质谱分析仪(Thermo Fisher Scientific); LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂); W-CJ-ZDF型超净台(上海贺德实验设备厂); HF90型CO2培养箱(河南力康仪器设备有限公司); Synergy HT型酶标仪(美国BioTek公司); DYY-12型电泳仪(北京市六一仪器厂); Tanon-1600凝胶成像仪(上海天能科技有限公司).其它试剂和溶剂未经特别说明均为国产或进口分析纯与生物级, 无水试剂均按常规方法处理.

    3.2.1   化合物2的合成

    5-氨基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯或5-氨基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(2)合成方法路线参考文献[23, 24], 表征数据与文献一致.

    3.2.2   化合物3的合成

    向溶有0.97 g (10 mmol) KSCN的20 mL无水乙腈溶液中, 慢慢滴加苯甲酰氯(12 mmol)的乙腈溶液, 搅拌回流45 min, 除去KCl得到黄色的苯甲酰异硫氰酸酯的乙腈溶液, 直接用于下一步反应.

    将上述苯甲酰异硫氰酸酯的乙腈溶液缓慢滴至化合物2的乙腈溶液中, 80 ℃回流反应, 薄层色谱(TLC)监测反应进程, 约6~8 h反应结束.将反应体系回收溶剂至干, 得到5-[(3-苯甲酰基)硫脲基]-1H-吡唑-4-甲酸乙酯或5-[(3-苯甲酰基)硫脲基]-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(3), 直接用于下步反应.

    3.2.3   化合物4的合成

    称取10 mmol化合物3溶于40 mL 2 mol•L-1的NaOH溶液中, 升温100 ℃回流30 min, 冷至室温后加入等体积水, 醋酸酸化得大量白色沉淀, 过滤后水洗, 晾干后乙醇重结晶, 得6-硫代-1, 5, 6, 7-四氢-4H-吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮或1-苯基-6-硫代-1, 5, 6, 7-四氢-4H-吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(4).化合物4表征数据与文献值一致[26, 27], 产率68%~79%.

    3.2.4   化合物5的合成

    将1 mmol化合物4、1.1 mmol取代吲哚、1.2 mmol H2O2放入25 mL圆底烧瓶, 加入6 mL DMSO溶解.加热至60 ℃后加入0.2 mmol的I2, TLC监测反应进程约0.5 h反应结束.将反应体系冷却至室温, 倒入饱和硫代硫酸钠水溶液中, 乙酸乙酯萃取(20 mL×3), 合并有机相, 无水硫酸钠干燥后回收溶剂, 二氯甲烷/甲醇体系(V:V=60:1)柱色谱分离得化合物5.产率53%~75%.

    6-[(5-甲氧基吲哚-3-基)硫基]-1-苯基-吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5a):白色粉末, 收率61%. m.p. 167.6~170.7 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 12.77 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 11.68 (s, 1H, Indole-NH), 8.18 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 7.74 (d, J=2.6 Hz, 1H, ArH), 7.54 (d, J=8.1 Hz, 2H, ArH), 7.50 (d, J=8.8 Hz, 1H, ArH), 7.12~7.14 (m, 1H, ArH), 7.01~7.04 (m, 3H, ArH), 6.92 (dd, J=8.8, 2.2 Hz, 1H, ArH), 3.68 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6)δ: 161.6, 157.6, 154.5, 151.5, 138.1, 135.9, 133.8, 131.6, 129.2, 128.5, 126.0, 119.9, 113.1, 112.3, 104.6, 100.3, 94.1, 55.4. HRMS (ESI) calcd for C20H14N5O2S[M-H] 388.0868, found 388.0867.

    6-[(吲哚-3-基)硫基]吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5b):白色粉末, 收率68%. m.p. 247.6~249.8 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 13.42 (s, 1H, Pyrazole-NH), 12.32 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 11.79 (s, 1H, Indole-NH), 7.90 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 7.83 (s, 1H, Indole-CH), 7.48~7.51 (m, 2H, ArH), 7.19 -7.22 (m, 1H, ArH), 7.10~7.12 (m, 1H, ArH); 13C NMR (151 MHz, DMSO- d6) δ: 160.3, 158.2, 153.8, 136.4, 135.3, 133.7, 129.1, 122.0, 120.1, 118.1, 112.2, 102.6, 94.2. HRMS (ESI) calcd for C13H8N5OS [M-H] 282.0450, found 282.0451.

    6-[(5-甲氧基吲哚-3-基)硫基]吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5c):白色粉末, 收率62%. m.p. 193.7~196.2 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 13.45 (s, 1H, Pyrazole-NH), 12.28 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 11.67 (s, 1H, Indole-NH), 7.92 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 7.78 (s, 1H, ArH), 7.40 (d, J=8.8 Hz, 1H, ArH), 6.95 (s, 1H, ArH), 6.85 (dd, J=8.8, 2.1 Hz, 1H, ArH), 3.73 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 160.2, 157.7, 154.5, 153.6, 135.1, 134.2, 131.2, 129.6, 113.4, 112.5, 102.4, 100.2, 93.7, 55.3. HRMS (ESI) calcd for C14H10N5O2S [M-H] 312.0555, found 312.0557.

    6-[(1-甲基吲哚-3-基)硫基]吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5d):白色粉末, 收率72%. m.p. 281.3~284.4 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 13.44 (s, 1H, Pyrazole-NH), 12.33 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 7.91 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 7.84 (s, 1H, ArH), 7.57 (d, J=8.2 Hz, 1H, ArH), 7.50 (d, J=7.9 Hz, 1H, ArH), 7.26~7.29 (m, 1H, ArH), 7.14~7.17 (m, 1H, ArH), 3.88 (s, 3H, CH3); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 160.0, 157.8, 153.5, 147.2, 137.2, 135.2, 129.5, 122.2, 120.7, 118.6, 110.7, 102.5, 92.9, 32.7. HRMS (ESI) calcd for C14H10N5OS [M-H] 296.0606, found 296.0605.

    6-[(6-氟吲哚-3-基)硫基]-1-苯基-吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5e):白色粉末, 收率60%. m.p. 283.1~285.7 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 12.86 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 11.87 (s, 1H, Indole-NH), 8.19 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 7.83 (d, J=2.5 Hz, 1H, ArH), 7.55 (dd, J=8.6, 5.4 Hz, 1H, ArH), 7.46 (d, J=7.9 Hz, 2H, ArH), 7.42 (dd, J=9.8, 1.8 Hz, 1H, ArH), 7.14~7.17 (m, 1H, ArH), 7.01~7.04 (m, 2H, ArH), 6.97~7.00 (m, 1H, ArH); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 161.3, 159.3 (d, J=235.7 Hz), 157.5, 151.4, 137.9, 136.6 (d, J=12.9 Hz), 136.0, 134.1, 128.4, 126.0, 125. 7, 120.0 (d, J=10.4 Hz), 119.8, 108.8 (d, J=24.4 Hz), 104.5, 98.3 (d, J=25.6 Hz) 95.2. HRMS (ESI) calcd for C19H11FN5OS [M-H] 376.0668, found 376.0667.

    6-[(5-甲基吲哚-3-基)硫基]吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5f):白色粉末, 收率67%. m.p. 232.5~235.4 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 13.46 (s, 1H, Pyrazole-NH), 12.23 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 11.67 (s, 1H, Indole-NH), 7.95 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 7.76 (d, J=2.3 Hz, 1H, ArH), 7.39 (d, J=8.3 Hz, 1H, ArH), 7.28 (s, 1H, ArH), 7.02 (d, J=8.3 Hz, 1H, ArH), 2.36 (s, 3H, CH3); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 162.8, 158.5, 153.8, 135.0, 133.6, 129.4, 129.2, 123.8, 117.8, 112.1, 99.9, 93.4, 54.9, 20.9. HRMS (ESI) calcd for C14H10N5OS [M-H] 296.0606, found 296.0605.

    6-[(6-甲氧羰基吲哚-3-基)硫基]吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5g):白色粉末, 收率53%. m.p. 270.5~272.9 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 13.41 (s, 1H, Pyrazole-NH), 12.45 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 12.17 (s, 1H, Indole-NH), 8.16 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 8.08 (s, 1H, ArH), 7.91 (s, 1H, ArH), 7.73 (d, J=8.2 Hz, 1H, ArH), 7.59 (d, J=8.2 Hz, 1H, ArH), 3.88 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 166.9, 159.6, 157.7, 153.5, 137.2, 135.9, 135.1, 132.9, 123.4, 121.0, 118.4, 114.3, 102.6, 95.3, 51.9. HRMS (ESI) calcd for C15H10N5O3S [M-H] 340.0504, found 340.0503.

    6-[(6-氟吲哚-3-基)硫基]吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5h):白色粉末, 收率66%. m.p. 231.5~235.2 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 13.45 (s, 1H, Pyrazole-NH), 12.11 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 11.84 (s, 1H, Indole-NH), 7.99 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 7.84 (s, 1H, ArH), 7.46~7.48 (m, 1H, ArH), 7.30 (dd, J=9.8, 2.1 Hz, 1H, ArH), 6.95~6.99 (m, 1H, ArH); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 159.5, 159.3 (d, J=235.8 Hz), 158.0, 154.0, 139.1, 136.4 (d, J=13.0 Hz), 134.3, 125.7, 119.6 (d, J=10.1 Hz), 108.9 (d, J=24.5 Hz), 102.8, 98.5 (d, J=26.0 Hz), 94.9. HRMS (ESI) calcd for C13H7FN5OS [M-H] 300.0355, found 300.0356.

    6-[(吲哚-3-基)硫基]-1-苯基-吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5i):白色粉末, 收率56%. m.p. 250.3~253.3 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 12.81 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 11.81 (s, 1H, Indole-NH), 8.18 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 7.81 (d, J=2.6 Hz, 1H, Indole-CH), 7.62 (d, J=8.2 Hz, 1H, ArH), 7.56 (d, J=7.9 Hz, 1H, ArH), 7.43 (d, J=7.9 Hz, 2H, ArH), 7.27~7.30 (m, 1H, ArH), 7.10~7.15 (m, 2H, ArH), 6.96~6.98 (m, 2H, ArH). 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 161.5, 157.6, 151.4, 138.0, 136.6, 135.9, 133.4, 129.0, 128.4, 126.0, 122.1, 120.3, 119.8, 118.6, 112.3, 104.6, 94.7. HRMS (ESI) calcd for C19H12N5OS [M-H] 358.0762, found 358.0762.

    6-[(5-氯吲哚-3-基)硫基]-1-苯基-吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5j):白色粉末, 收率65%. m.p. 259.4~261.3 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 12.86 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 12.00 (s, 1H, Indole-NH), 8.19 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 7.89 (d, J=2.7 Hz, 1H, Indole-CH), 7.63 (d, J=8.7 Hz, 1H, ArH), 7.60 (d, J=1.8 Hz, 1H, ArH), 7.47 (d, J=7.8 Hz, 2H, ArH), 7.29 (dd, J=8.7, 2.0 Hz, 1H, ArH), 7.12 - 7.15 (m, 1H, ArH), 7.00~7.03 (m, 2H, ArH); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 161.2, 157.6, 151.4, 138.1, 136.0, 135.0, 130.4, 129.2, 128.5, 126.1, 125.2, 122.3, 119.9, 118.0, 114.0, 104.7, 94.7. HRMS (ESI) calcd for C19H11ClN5OS [M-H] 392.0373, found 392.0372.

    6-[(1-甲基吲哚-3-基)硫基]-1-苯基-吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5k):白色粉末, 收率65%. m.p. 234.1~236.2 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 12.79 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 8.18 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 7.81 (s, 1H, ArH), 7.68 (d, J=8.3 Hz, 1H, ArH), 7.57 (d, J=7.9 Hz, 1H, ArH), 7.44 (d, J=8.1 Hz, 2H, ArH), 7.33~7.35 (m, 1H, ArH), 7.17~7.19 (m, 1H, ArH), 7.10~7.13 (m, 1H, ArH), 6.98~7.00 (m, 2H, ArH), 3.89 (s, 3H, CH3); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 161.4, 157.6, 151.4, 138.1, 137.3, 137.0, 135.9, 129.4, 128.5, 126.1, 122.2, 120.5, 119.9, 118.8, 110.6, 104.6, 93.5, 32.9. HRMS (ESI) calcd for C20H14N5OS [M-H] 372.0919, found 372.0917.

    6-[(5-甲基吲哚-3-基)硫基]-1-苯基-吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5l):白色粉末, 收率69%. m.p. 254.8~256.6 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 12.78 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 11.69 (s, 1H, Indole-NH), 8.18 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 7.74 (d, J=2.6 Hz, 1H, Indole-CH), 7.49 (d, J=7.6 Hz, 3H, ArH), 7.36 (s, 1H, ArH), 7.10~7.14 (m, 2H, ArH), 7.00~7.02 (m, 2H, ArH), 2.35 (s, 3H, CH3); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 161.4, 157.4, 151.4, 138.0, 135.9, 135.0, 133.4, 129.3, 129.1, 128.5, 126.0, 123.7, 119.9, 118.1, 112.0, 104.6, 93.6, 21.1. HRMS (ESI) calcd for C20H14N5OS [M-H] 372.0919, found 372.0925.

    6-[(6-甲氧羰基吲哚-3-基)硫基]-1-苯基-吡唑并[3, 4-d]嘧啶-4-酮(5m):白色粉末, 收率75%. m.p. 295.4~296.5 ℃; 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 12.91 (s, 1H, Pyrimidine-NH), 12.22 (s, 1H, Indole-NH), 8.27 (s, 1H, ArH), 8.19 (s, 1H, Pyrazole C=CH), 8.07 (d, J=2.7 Hz, 1H, ArH), 7.75 (d, J=8.4 Hz, 1H, ArH), 7.66 (d, J=8.4 Hz, 1H, ArH), 7.41 (d, J=8.4 Hz, 2H, ArH), 7.10~7.13 (m, 1H, ArH), 6.93~7.95 (m, 2H, ArH), 3.90 (s, 3H, OCH3); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) δ: 167.0, 161.1, 157.6, 151.4, 138.0, 137.0, 136.1, 135.9, 132.8, 128.4, 126.1, 123.3, 121.0, 119.9, 118.6, 114.0, 104.6, 95.6, 51.7. HRMS (ESI) calcd for C21H14N5O3S [M-H] 416.0817, found 416.0820.

    3.2.5   抗肿瘤活性测试

    抗肿瘤活性测试采用MTT染色法测定[29, 30].于96孔板接种细胞悬液, 90 μL/孔, 细胞密度2×104个/mL, 37 ℃, 5% CO2浓度的培养箱中过夜, 加10 μL/孔相应浓度药物(100 μmol/L), 继续培养44 h, 加噻唑蓝(MTT) 10 μL/孔培养4 h, 从培养箱中取出, 吸出培养液, 加二甲基亚砜(DMSO) 100 μL/孔溶解MTT, 酶标仪检测各孔490 nm波长处吸光值, 重复测量三次, 按照公式:抑制率(%)=1-(OD化合物-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100%计算IC50值.

    3.2.6   拓扑异构酶抑制活性测试

    拓扑异构酶Ⅰ测试方法参照文献[29].拓扑异构酶Ⅱ的提取与测试方法参照文献[29].

    3.2.7   分子对接研究

    本文选取人源DNA拓扑异构酶Ⅱ晶体(PDB ID: 3QX3)作为受体模型, 以依托泊苷所处的位置作为活性口袋.使用Schrödinger Suite中Maestro 10.2软件的Glide模块(软件由北京大学分子设计研究室提供支持)进行分子对接.首先, 利用LigPrep工具对配体优化准备; 然后利用Protein Preparation Wizard模块准备受体蛋白:能量优化, 修复氨基酸残基和Loop区, 加电荷、去水、加氢; 再用Glide模块中Receptor Grid Generation工具以原始配体为中心进行受体格点设置, 尺寸为1.5 nm×1.5 nm×1.5 nm; 最后利用Glide模块中的Ligand Docking工具以Glide-XP模式进行分子对接.

    辅助材料(Supporting Information)  化合物5a~5m的核磁共振氢谱和碳谱、高分辨质谱.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.


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  • 图 1  含吲哚的吡唑并[3, 4-d]嘧啶衍生物设计

    Figure 1  Design of pyrazolo[3, 4-d]pyrimidine derivatives possessing indole moiety

    图式 1  目标化合物的合成

    Scheme 1  Synthetic route of target compound

    图 2  反应机理

    Figure 2  Proposed mechanism

    图 3  化合物5a~5m对Topo Ⅰ的抑制活性

    Figure 3  Enzymatic inhibitory activities of compounds 5a~5m against Topo Ⅰ

    D: pBR322 DNA; T: pBR322 DNA+Topo Ⅰ; C: pBR322 DNA+Topo I+CPT; 5a~5m: pBR322 DNA+Topo Ⅰ+compounds 5a~5m

    图 4  化合物5a~5m对Topo Ⅱ的抑制活性

    Figure 4  Enzymatic inhibitory activities of compounds 5a~5m against Topo Ⅱ

    D: pBR322 DNA; T: pBR322 DNA+Topo Ⅱ; E: pBR322 DNA+Topo Ⅱ+Etoposide; 5a~5m: pBR322 DNA+Topo Ⅱ+compounds 5a~5m

    图 5  Etoposide-Topo Ⅱ的结合模式图

    Figure 5  Proposed binding mode of Etoposide with Topo Ⅱ

    图 6  化合物5m-Topo Ⅱ的结合模式图

    Figure 6  Proposed binding mode of compounds 5m with Topo Ⅱ

    表 1  化合物5a~5m体外肿瘤抑制活性IC50

    Table 1.  Anticancer activity of compounds 5a to 5m as IC50

    Compd. IC50/(μmol•L-1)
    HeLa MGC-803 MCF-7 BEL-7404
    5a 48.11±0.83 27.97±0.88 38.42±0.92 >60
    5b >60 >60 59.55±0.67 >60
    5c >60 >60 >60 >60
    5d 47.17±1.34 >60 >60 >60
    5e >60 42.81±1.14 31.12±0.77 >60
    5f >60 48.68±0.53 49.48±1.07 >60
    5g >60 44.01±1.13 52.90±1.65 >60
    5h >60 34.76±0.55 59.92±0.80 >60
    5i 41.86±0.58 7.82±1.06 56.66±0.75 >60
    5j >60 37.51±0.71 >60 >60
    5k >60 >60 40.89±0.92 >60
    5l 43.27±1.65 14.5±0.47 26.26±0.83 >60
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  • 发布日期:  2020-02-25
  • 收稿日期:  2019-07-03
  • 修回日期:  2019-09-11
  • 网络出版日期:  2019-02-01
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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