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• 几丁质(chitin)又称为甲壳质或甲壳素, 是以N-乙酰氨基葡萄糖为基本单元并通过β-(1, 4)氧苷键连接而成的一种线性聚合物^{[1, 2]}.几丁质是昆虫外表皮及真菌细胞壁的重要组成成分, 高等动植物体内基本不含几丁质, 因此, 作用于几丁质降解过程中的相关酶被认为是绿色的农药靶标^{[3, 4]}.几丁质降解对昆虫的生长发育至关重要, 降解过程由两个家族糖苷水解酶第18家族(GH18)几丁质酶(EC 3.2.1.14)和第20家族(GH20) β-N-乙酰己糖胺酶(EC 3.2.1.52)催化^{[5, 6]}. GH18几丁质酶可催化几丁质裂解成较短的几丁质寡糖, 几丁质寡糖进一步被GH20 β-N-乙酰己糖胺酶从非还原端逐步降解, 生成N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)^[5~7].目前针对几丁质酶和β-N-乙酰己糖胺酶抑制剂的相关研究已取得较多进展, 文献报道的抑制剂主要有Thiazolines、Phlegmacin B₁和Bisdionin C^[8~10].本课题组在针对昆虫来源的β-N-乙酰己糖胺酶OfHex1抑制剂的设计和合成方面也开展了大量的研究工作^[11~13].

  研究几丁质酶活性测定的方法对于几丁质的开发、循环利用、新型几丁质酶抑制剂的研究等具有积极的推动作用.几丁质酶是糖基水解酶的一种, 其活性检测方法主要包括比色法^[14]、黏度测定法^[15]、放射化学法^[16]和HPLC法^[17]等.其中比色法最为常用, 其原理之一是利用4-硝基苯基-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷(pNP-Glc-NAc)、4-硝基苯基-β-D-N, N'-二乙酰壳二糖苷(pNP-(Glc-NAc)₂)或4-甲基伞形基-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷(Mu-Glc-NAc)等作为相关酶的底物分子, 通过糖基水解释放出硝基苯酚或甲基伞形酮来检测酶的活性^{[18, 19]}.我们课题组^[20]在前期研究中, 设计报道了一种新型的糖基化萘酰亚胺基荧光探针, 具有较好的水溶性和荧光特性, 在氨基糖苷酶的活性检测中发现其比Mu-GlcNAc更有效.现有文献报道的GH18几丁质酶底物分子主要为4-硝基苯基- β-D-N, N'-二乙酰壳二糖苷(pNP-(Glc-NAc) ₂), 该底物可被几丁质酶降解为双糖(GlcNAc)₂及对硝基苯酚(pNP), 通过在波长405 nm处检测pNP紫外吸收强度来检测其酶活^[21]. pNP-(GlcNAc)₂底物能够同时被GH18几丁质酶和GH20 β-N-乙酰己糖胺酶降解, 并释放出pNP分子^[21~23].因此, pNP-(GlcNAc)₂底物不适用于生物体内几丁质酶活性的常规测定.所以, 设计能被GH18几丁质酶水解的专一性底物具有重要的研究意义.

  根据酶催化的专一性, 硫代糖苷键难以被糖苷水解酶断裂^{[24, 25]}, 鉴于此, 设计了一种新型含硫糖苷底物4-硝基苯基N, N'-二乙酰基-4-硫代-β-D-壳二糖苷(pNP- TCB), 设计思路如图式 1所示, 以期该底物只被GH18几丁质酶专一性降解, 而不能被GH20 β-N-乙酰己糖胺酶降解, 从而实现细胞水平GH18几丁质酶的性质研究不受己糖胺酶的干扰, 并为GH18几丁质酶和GH20 β-N-乙酰己糖胺酶的筛选分离提供良好的检测手段.

  图式 1

  

  图式 1.  4-硝基苯基N, N'-二乙酰基-4-硫基-β-壳二糖苷(pNP- TCB)的设计思路

  Scheme 1.  Design of p-nitrophenyl N, N'-diacetyl-4-thio-β- chitobioside (pNP-TCB)

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  1.   结果与讨论

  1.1   pNP-TCB底物分子的路线设计与合成讨论

  寡糖的合成往往需要在特定位点进行偶联反应, 由于每个单糖结构含有多个羟基, 因此对单糖其它位点的羟基进行选择性保护与脱保护是寡糖合成过程中的一个研究重点^[26].在本课题组之前的研究基础^[27~29]上, 分别对两个单糖结构进行选择性保护, 偶联反应后再脱除保护基, 最终得到pNP-TCB目标化合物, 首先合成了双糖偶联供体2-乙酰氨基-3, 4, 6-三-O-乙酰基-2-脱氧-1-硫代-β-D-吡喃葡萄糖苷(2'), 合成路线如Scheme 2所示.首先以N-乙酰氨基葡萄糖为原料在乙酰氯的作用下发生全乙酰化和氯化反应得到全乙酰化氯代糖, 然后将全乙酰化氯代糖在丙酮存在下与硫脲反应生成硫脲盐酸盐, 抽滤得中间体2a, 再在温和碱偏重亚硫酸钠作用下水解生成化合物2', 化合物2'中SH的偶合常数为J＝9.4 Hz (d, δ 2.58), 与文献值^[30] J＝9.6 Hz (δ 2.58)一致.

  图式 2

  

  图式 2.  化合物2'的合成路线

  Scheme 2.  Synthetic route of compound 2'

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  目标化合物2~6的合成路线如Scheme 3所示.以N-乙酰氨基葡萄糖为原料, 经过全乙酰化、氯化和1位对硝基苯基取代得化合物2.在化合物2的后处理过程中, 若浓缩反应体系中的溶剂后直接用二氯甲烷萃取, 则易乳化, 虽然可选择硅藻土破乳, 但会造成收率损失; 而保留少许丙酮后再经二氯甲烷萃取, 可减少体系乳化现象.化合物2在甲醇-甲胺溶液中脱除乙酰基, 反应过程中逐渐析出白色固体, 将反应体系进行减压抽滤可得化合物3.由于需要对受体单糖的4位羟基进行偶联, 因此需要把3, 6位羟基先保护起来, 为此, 优先选择在对甲苯磺酸的催化下对4, 6位羟基进行异丙叉基保护^[31], 以92%收率得到化合物4.随后对化合物4的3位羟基进行苯甲酰化反应得到化合物5.为了对化合物5的6位羟基进行保护, 需先用冰醋酸和水解除去4, 6位的异丙叉基得到化合物6, 随后进行6位羟基的选择性苯甲酰化.

  图式 3

  

  图式 3.  化合物6的合成路线

  Scheme 3.  Synthetic route of compound 6

  Reagent and conditions: (i) AcCl; (ii) K₂CO₃, acetone, 4-nitrophenol, reflux; (iii) CH₃OH, CH₃NH₂; (iv) DMF, 2, 2-dimethoxypropane, 4-TsOH; (v) pyridine, benzoyl chloride, 0 ℃; (vi) AcOH, H₂O, reflux

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  化合物7~11的合成路线如Scheme 4所示.化合物6在无水吡啶和无水二氯甲烷条件下与两种反应试剂(苯甲酰氯和苯甲酰氰)进行6位羟基的选择性苯甲酰化反应, 得到化合物7.对比反应结果发现, 用苯甲酰氰酰化的收率比用苯甲酰氯酰化的收率有所提高.对比化合物3, 6和7可知, 化合物3中H-3的化学位移(δ)为3.74, 其3位羟基苯甲酰化后得化合物6, 化合物6中H-3的化学位移向低场移动到δ 5.22, 证明苯甲酰化发生在3-OH上.当化合物6的3, 6位羟基发生选择性苯甲酰化后, 所得化合物7中H-6的化学位移相较于化合物6的H-6则明显向低场移动, 证明选择性苯甲酰化发生在6-OH上.具体的特征峰化学位移的变化如表 1所示.

  图式 4

  

  图式 4.  化合物11的合成路线

  Scheme 4.  Synthetic route of compound 11

  Reagent and conditions: (ⅶ) CH₂Cl₂, pyridine, benzoyl cyanide; (ⅷ) CH₂Cl₂, pyridine, Tf₂O, －10 ℃; (ⅸ) DMF, NaNO₂; (ⅹ) CH₂Cl₂, pyridine, Tf₂O; (ⅺ) sodium hydride, DMF or cysteamine, dithioerythritol (DTE), DMF; (ⅻ) CH₃OH, CH₃NH₂

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  表 1

  

  表 1  酰化反应区域选择性特征峰化学位移

  Table 1.  Feature chemical shift of regioselective acylation reactions

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  δ	3	6	7
  δH-3	3.74	5.22	5.33
  δH-6a, H-6b	3.37~3.15 (2H)	3.67~3.48 (2H)	4.64~4.44 (2H)

  化合物7在无水吡啶和无水二氯甲烷条件下与三氟甲磺酸酐反应, 生成4位三氟甲磺酰氧基取代的中间体, 在亚硝酸钠的作用下进一步实现构型翻转得到化合物8; 化合物8再经过4位三氟甲磺酸酐酯化得到偶联双糖受体化合物9.化合物9性质不稳定, 合成后直接用于二糖偶联反应.在无水无氧条件下, 偶联反应采取两种方案进行:双糖供体2'与双糖受体9在氢化钠作为碱的条件下能够以16%的收率得到偶联产物β-(1→S→4)连接的二糖化合物10; 双糖供体2'与双糖受体9在二硫赤藓醇(DTE)及巯基乙胺的条件下进行偶联反应, 则目标化合物10的收率为26%.化合物10经过甲胺的甲醇溶液脱除保护基得到化合物11.化合物11结构经¹H NMR, ¹³C NMR和HRMS确证.其中, 氢谱中H-1和H-1'的偶合常数分别为J＝8.5 Hz (δ 5.23)、J＝10.3 Hz (δ 4.59), 结合碳谱中, C-1, C-1'的δ值分别为98.16和82.75, 证明化合物11结构为β-(1→S→4)连接的β构型.

  1.2   pNP-TCB作为GH18几丁质酶底物的性质研究

  为了直观地评价GH18几丁质酶对pNP-TCB底物的降解作用, 采用不同用量粘质沙雷氏菌几丁质酶(EC 3.2.1.14)对pNP-TCB底物降解实验, 结果如图 1.凡是经粘质沙雷氏菌几丁质酶孵育30 min后的底物, 在405 nm波长下经酶标仪检测均有相应的pNP紫外吸收值, 并且该吸收值的大小随着几丁质酶用量的增加而逐渐增大, 且两者之间具有良好的线性关系(R²＝0.9928), 由此说明, 粘质沙雷氏菌几丁质酶能够对pNP-TCB底物进行降解, 释放出pNP紫外吸收基团.

  图 1

  

  图 1.  不同浓度粘质沙雷氏菌几丁质酶(EC 3.2.1.14)对pNP- TCB底物的降解作用

  Figure 1.  Degradation of pNP-TCB substrate by different concentrations of chitinase from Serratia marcescens

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  1.3   pNP-TCB底物的专一性研究

  为了研究pNP-TCB底物的专一性, 首先设置了粘质沙雷氏菌几丁质酶(EC3.2.1.14)(GH18几丁质酶)对同一浓度pNP-TCB、pNP-(GlcNAc)₂和pNP-GlcNAc 3种底物的降解活性实验, 空白对照为相同底物浓度的柠檬酸-磷酸缓冲溶液(pH 6.0), 每个实验重复3次.结果如图 2所示.粘质沙雷氏菌几丁质酶与pNP-TCB和pNP-(GlcNAc)₂两种底物孵育后在波长405 nm下经酶标仪检测均有明显的pNP紫外吸收, 而与pNP-GlcNAc底物孵育后几乎没有吸收.由此说明, 粘质沙雷氏菌几丁质酶能够对pNP-TCB和pNP-(GlcNAc)₂两种底物进行降解释放pNP, 而对pNP-GlcNAc底物则几乎不降解.

  图 2

  

  图 2.  粘质沙雷氏菌几丁质酶(EC 3.2.1.14)对不同底物的降解作用

  Figure 2.  Dgradation of different substrates by chitinase from Serratia marcescens

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  为了进一步验证pNP-TCB底物的专一性, 采用亚洲玉米螟OfHex1酶(EC3.2.1.52) (GH20 β-N-乙酰己糖胺酶)对同一浓度pNP-TCB、pNP-(GlcNAc)₂和pNP- GlcNAc三种底物进行降解, 每个实验重复3次.结果如图 3所示.亚洲玉米螟OfHex1酶(EC 3.2.1.52)与pNP- GlcNAc、pNP-(GlcNAc)₂两种底物孵育后在波长405 nm下经酶标仪检测均有明显的紫外吸收, 而与pNP-TCB底物作用后几乎没有吸收.由此说明, 亚洲玉米螟OfHex1酶(EC 3.2.1.52)能够较好地降解pNP-(GlcNAc)₂和pNP-GlcNAc两种底物, 但对pNP- TCB底物几乎不降解.

  2.   结论

  以N-乙酰氨基葡萄糖为原料, 经过全乙酰化、氯化、取代、异亚丙基化、苯甲酰化、酯化、二糖偶联和脱保护等步骤, 合成了一种新型的GH18几丁质酶专一性底物4-硝基苯基-N, N'-二乙酰基-4-硫基-β-壳二糖苷(pNP- TCB).通过¹H NMR, ¹³C NMR和HRMS确证了化合物的结构, 采用比色法研究了GH18几丁质酶和GH20 β-N-乙酰己糖胺酶对新型底物pNP-TCB的降解活性.结果表明, 该底物可以专一性地被GH18几丁质酶水解, 而几乎不能被GH20 β-N-乙酰己糖胺酶水解.因此可利用GH18几丁质酶对该底物的专一性, 实现在细胞水平上对GH18几丁质酶性质的研究而不受己糖胺酶的干扰, 能为新型的GH18几丁质酶抑制剂的活性研究提供专一的检测底物.

  图 3

  

  图 3.  亚洲玉米螟OfHex1酶(EC 3.2.1.52)对不同底物的降解作用

  Figure 3.  Degradation of different substrates by the OfHex1 from Ostrinia furnacali

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  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  高分辨质谱采用Bruker Daltonics Bio-TOF-Q Ⅲ型质谱仪(ESIMS)测定; ¹H NMR和¹³C NMR使用瑞典Bruker Avance 300型核磁共振仪测定, 四甲基硅烷(TMS)为内标; FlexStation 3酶标仪, Molecular Devices公司; RE-52AA型旋转蒸发仪, 上海亚荣生化仪器厂; SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵, 巩义市予华有限责任公司; ZF7-C三用紫外分析仪, 上海康华仪器制造有限责任公司; CP214型分析天平, 奥豪斯仪器(常州)有限责任公司; ZNCL-T智能恒温磁力搅拌棒, 郑州杜甫仪器有限责任公司; Bruker Avnce核磁共振波谱仪, 瑞士布鲁克旋转蒸发仪.薄层层析硅胶板, 青岛海洋化工厂; 柱层析硅胶, 青岛海洋化工厂. GH18粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)几丁质酶(5U)、柠檬酸-磷酸缓冲溶液(pH 6.0)、无菌蒸馏水购自于南京都莱生物科技有限公司, 所用的GH20的亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶OfHex1 (5 mU/mL)、pNP-(GlcNAc)₂底物是由中国农业科学院植物保护研究所杨青教授课题组提供; 其它所有试剂均为国产市售分析纯.

  3.2   化合物的合成

  3.2.1   2-乙酰氨基-3, 4, 6-三-O-乙酰基-2-脱氧-1-硫代- β-D-吡喃葡萄糖苷(2')的合成

  参考文献[32]方法制备.取30.5 g (138 mmol)化合物1溶于100 mL的乙酰氯, 室温反应18 h, 经薄层色谱(TLC) [V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝1:1]检测反应完全后, 用二氯甲烷萃取.有机相经分别经饱和碳酸钠溶液和饱和食盐水洗涤, 无水硫酸钠干燥, 浓缩溶剂得暗紫色固体42.5 g, 然后用250 mL丙酮溶解暗紫色固体, 加入16.5 g (217 mmol)硫脲, 57 ℃回流6 h, 经TLC(展开剂为乙酸乙酯)检测反应完全, 减压抽滤得中间体2a (35 g).

  将35 g (86.4 mmol)中间体2a溶于300 mL二氯甲烷和200 mL水中, 加入34.2 g (172.8 mmol)偏重亚硫酸钠, 50 ℃回流5 h.经TLC [V(二氯甲烷):V(甲醇)＝10:1]检测反应完全, 用二氯甲烷萃取, 有机相经饱和食盐水洗涤后干燥, 浓缩溶剂后用乙酸乙酯重结晶得28.6 g白色固体2', 产率为57%. m.p. 164~166 ℃, [α]_D²⁵ －25.3 (c 0.5, DMSO)[文献值:^[32] m.p. 165~167 ℃, [α]_D²⁵－24.8 (c 1.0, 氯仿)]; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 5.65 (d, J＝9.2 Hz, 1H, NHAc), 5.18~5.02 (m, 2H, H-3, H-4), 4.58 (t, J＝9.8 Hz, 1H, H-1), 4.25 (dd, J＝12.4, 4.9 Hz, 1H, H-6a), 4.15 (t, J＝10.1 Hz, 2H, H-2, H-6b), 3.70 (dd, J＝6.0, 3.7 Hz, 1H, H-5), 2.58 (d, J＝9.4 Hz, 1H, SH), 2.10 (s, 3H, CH₃CO), 2.04 (d, J＝4.2 Hz, 6H, CH₃CO), 1.99 (s, 3H, CH₃CO); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 170.15, 169.70, 169.43, 169.35 (C＝O), 78.82, 74.93, 73.48, 68.59, 62.14, 55.67, 22.77, 20.64, 20.49, 20.43 (CH₃CO). HRMS calcd for C₁₄H₂₂NO₈S [M+H]⁺ 364.1051, found 364.1061.

  3.2.2   2-乙酰氨基-3, 4, 6-三-O-乙酰基- 2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖对硝基酚苷(2)的合成

  参考文献[33]方法制备.取40.0 g(181 mmol)化合物1溶于100 mL的乙酰氯, 室温反应18 h.经TLC [V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝1:1]检测反应完全, 用二氯甲烷萃取.有机相分别经饱和碳酸钠溶液和饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥, 浓缩得暗紫色固体产物57 g.用150 mL丙酮溶解固体产物, 加入27.7 g对硝基苯酚(199 mmol)和27.4 g (199 mmol)无水K₂CO₃, 69 ℃回流4 h.经TLC [V(二氯甲烷):V(甲醇)＝20:1]检测反应完全, 浓缩丙酮.用二氯甲烷萃取、干燥、浓缩, 得白色固体2 (39.8 g), 产率47%. m.p. 238~239 ℃; [α]_D²⁵ －45.4 (c 0.5, DMSO)[文献值:^[33] m.p. 235~237 ℃, [α]₅₄₆ －49 (c 1.0, 氯仿)]; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8.26~8.20 (m, 2H, ArH), 8.12 (d, J＝9.0 Hz, 1H, NH), 7.29~7.18 (m, 2H, ArH), 5.56 (d, J＝8.4 Hz, 1H, H-1), 5.29~5.18 (m, 1H, H-3), 4.95 (t, J＝9.7 Hz, 1H, H-4), 4.37~3.94 (m, 4H, H-2, H-5, H-6a, H-6b), 2.01 (s, 6H, CH₃CO), 1.96 (s, 3H, CH₃CO), 1.78 (s, 3H, CH₃CO); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 170.08, 169.96, 169.81, 169.72 (C＝O), 161.72, 142.34, 125.84, 116.71 (ArC), 98.05, 70.79, 70.19, 66.71, 61.48, 49.30, 22.80, 20.51, 20.44 (CH₃CO).

  3.2.3   2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖对硝基酚苷(3)的合成

  将化合物2 (39.8 g, 85.0 mmol)溶于150 mL甲醇中, 加50 mL甲胺溶液, 常温反应12 h.经TLC [V(二氯甲烷):V(甲醇)＝6:1]检测反应完全, 抽滤得白色固体3 (26.8 g), 产率为92%. m.p. 205~206 ℃, [α]_D²⁵ －22.8 (c 0.5, DMSO)[文献值:^[34] m.p. 200~201 ℃, [a] ₅₄₆－16.18 [c 0.87, V(水):V(丙酮)＝1:1]. ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8.26~8.14 (m, 2H, ArH), 7.86 (d, J＝9.0 Hz, 1H, NH), 7.23~7.09 (m, 2H, ArH), 5.24~5.12 (m, 3H, H-1, 2×OH), 4.66 (s, 1H, OH), 3.74 (dd, J＝18.6, 8.7 Hz, 2H, H-2, H-3), 3.55~3.15 (m, 4H, H-4, H-5, H-6a, H-6b), 1.82 (s, 3H, CH₃CO); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.68 (C＝O), 162.38, 141.96, 125.84, 116.71 (ArC), 98.61, 77.51, 73.99, 70.23, 60.70, 55.42, 23.14 (CH₃CO). HRMS calcd for C₁₄H₁₉N₂O₈ [M+H]⁺ 343.1136, found 343.1129.

  3.2.4   2-乙酰氨基-2-脱氧-4, 6-O-异丙叉基-β-D-吡喃葡萄糖对硝基酚苷(4)的合成

  将15.8 g (46.2 mmol)化合物3溶于100 mL无水N, N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中, 加入0.6 g (3.15 mmol) p-TsOH和7.4 mL (78.4 mmol) 2-甲氧基丙烯, 氮气保护反应14 h, TLC(展开剂为乙酸乙酯)检测反应完全, 加5 mL三乙胺(TEA)终止反应.用乙酸乙酯萃取后经饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤, 无水硫酸钠干燥后浓缩溶剂得白色固体4 (16.2 g), 产率92%. m.p. 111~112 ℃, [α]_D²⁵ +29.5 (c 0.5, DMSO), ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.20~8.16 (m, 2H, ArH), 7.92 (d, J＝8.9 Hz, 1H, NH), 7.23~7.12 (m, 2H, ArH), 6.63 (d, J＝7.8 Hz, 1H, NH), 5.32 (d, J＝8.2 Hz, 1H, H-1), 5.29 (s, 1H, OH), 3.87~3.77 (m, 2H, H-2, H-3), 3.70 (t, J＝9.9 Hz, 1H, H-4), 3.62~3.45 (m, 3H, H-5, H-6a, H-6b), 1.80 (s, 3H, CH₃CO), 1.45 (s, 3H, CMe-2a), 1.33 (s, 3H, CMe-2b); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.69 (C＝O), 162.04, 142.14, 125.87, 116.74 (ArC), 99.15 (C, CMe₂), 98.64, 73.71, 70.73, 67.27, 61.40, 56.14, 29.14 (CH₃, CH₃COO), 23.09 (CH₃, CH₃COO), 19.19 (CH₃, CH₃CO). HRMS calcd for C₁₇H₂₃N₂O₈ [M+H]⁺ 383.1449, found 383.1438.

  3.2.5   2-乙酰氨基-2-脱氧-4, 6-O-异丙叉基-3-O-苯甲酰基-β-D-吡喃葡萄糖对硝基酚苷(5)的合成

  将12.1 g (31.7 mmol)化合物4溶于40 mL无水吡啶中, 0 ℃氮气保护下, 逐滴滴加5.6 mL (48.6 mmol) BzCl, 反应2 h. TLC [V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝3:1]检测反应完全.加2 mL甲醇, 反应体系变澄清, 经质量分数为5%的冰-稀盐酸洗涤后用二氯甲烷萃取, 干燥浓缩得白色固体5 (11.8 g), 产率为77%. m.p. 191~192 ℃ [α]_D²⁵ +26.3 (c 0.5, DMSO); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8.19~8.11 (m, 2H, ArH), 8.03~7.97 (m, 2H, ArH), 7.64~7.56 (m, 1H, ArH), 7.45 (t, J＝7.6 Hz, 2H, ArH), 7.11~7.05 (m, 2H, ArH), 6.36 (d, J＝9.3 Hz, 1H, NH), 5.65~5.52 (m, 1H, H-3), 5.39 (d, J＝8.3 Hz, 1H, H-1), 4.55 (dd, J＝18.8, 9.3 Hz, 1H, H-2), 4.12~3.99 (m, 2H, H-4, H-6a), 3.89 (t, J＝10.4 Hz, 1H, H-6b), 3.78~3.70 (m, 1H, H-5), 1.86 (s, 3H, CH₃CO), 1.51 (s, 3H, CMe-2a), 1.38 (s, 3H, CMe-2b); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.63, 165.47 (C＝O), 161.74, 142.37, 133.51, 129.53, 128.80, 125.88, 116.87 (ArC), 99.57 (C, CMe₂), 98.06, 72.85, 71.30, 67.15, 61.33, 53.76, 28.94 (CH₃, CH₃COO), 22.69 (CH₃, CH₃COO), 19.14 (CH₃CO). HRMS calcd for C₂₄H₂₇N₂O₉ [M+H]⁺ 487.1711, found 487.1698.

  3.2.6   2-乙酰氨基-3-O-苯甲酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖对硝基酚苷(6)的合成

  将8.5 g (17.5 mmol)化合物5溶于75 mL冰醋酸和50 mL蒸馏水中, 60 ℃回流3 h. TLC(展开剂为乙酸乙酯)检测反应完全.用甲苯与反应体系共蒸除去乙酸和水, 再用乙酸乙酯溶解后浓缩, 得9.5 g棕黄色固体6的粗产物, 粗产物经柱层析[V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝2:3]分离纯化后得棕色固体6 (6.5 g), 产率83%. m.p. 154~155 ℃, [α]_D²⁵ +32.4 (c 0.5, DMSO)[文献值:^[31] [α]_D²⁵ +29.3 (c 0.5, 丙酮)]. ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.25~8.15 (m, 2H, ArH), 8.04 (d, J＝9.2 Hz, 1H, OH), 7.97~7.89 (m, 2H, ArH), 7.64 (td, J＝7.8, 4.0 Hz, 1H, ArH), 7.51 (t, J＝7.5 Hz, 2H, ArH), 7.26~7.17 (m, 2H, ArH), 5.54 (d, J＝5.5 Hz, 1H, NH), 5.44 (d, J＝8.4 Hz, 1H, H-1), 5.22 (dd, J＝10.3, 8.5 Hz, 1H, H-3), 4.73 (t, J＝5.6 Hz, 1H, H-2), 4.23~4.03 (m, 1H, H-4), 3.75~3.69 (m, 1H, H-5), 3.67~3.48 (m, 3H, H-6a, H-6b, OH), 1.62 (s, 3H, CH₃CO); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.42, 165.66 (C＝O), 162.07, 142.18, 133.28, 130.12, 129.47, 128.69, 125.90, 116.84 (ArC), 97.78, 77.22, 76.53, 67.70, 60.24, 53.34, 22.76 (CH₃CO). HRMS calcd for C₂₁H₂₂N₂O₉ [M+H]⁺ 447.1398, found 447.1397.

  3.2.7   2-乙酰氨基-3, 6-二-O-苯甲酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖对硝基酚苷(7)的合成

  将7.0 g (15.7 mmol)化合物6溶于50 mL无水二氯甲烷和20 mL无水吡啶中, －10 ℃氮气保护下, 缓慢滴加20 mL二氯甲烷和2.2 mL (19.2 mmol)苯甲酰氰混合溶液, －10 ℃反应6 h. TLC [V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝1:1]检测反应完全, 加5 mL甲醇终止反应.反应体系经质量分数为5%的冰盐酸洗涤后, 用二氯甲烷萃取, 有机相经饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤, 无水硫酸钠干燥后浓缩溶剂得7的粗产物, 将粗产物用乙酸乙酯重结晶得白色固体7 (6.7 g), 产率78%. m.p. 235~237 ℃, [α]_D²⁵+23.8 (c 0.5, DMSO); [文献值:^{[31, 35]} m.p. 242~245 ℃, [α]_D²⁵ +13.7 (c 0.5, 丙酮)]; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8.16 (d, J＝9.2 Hz, 1H, OH), 8.13~8.05 (m, 2H, ArH), 8.04~7.94 (m, 4H, ArH), 7.75~7.62 (m, 2H, ArH), 7.58~7.51 (m, 4H, ArH), 7.24 (d, J＝9.3 Hz, 2H, ArH), 5.90 (d, J＝6.1 Hz, 1H, NH), 5.56 (d, J＝8.5 Hz, 1H, H-1), 5.38~5.23 (m, 1H, H-3), 4.64 (d, J＝10.0 Hz, 1H, H-6a), 4.44 (dd, J＝12.0, 6.8 Hz, 1H, H-6b), 4.19 (dt, J＝14.4, 7.9 Hz, 2H, H-2, H-4), 3.82~3.74 (m, 1H, H-5), 1.67 (s, 3H, CH₃CO); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.58, 165.67, 165.57 (C＝O), 161.69, 142.14, 133.54, 133.33, 130.03, 129.70, 129.53, 129.40, 128.79, 128.69, 125.65, 116.83 (ArC), 97.39, 76.20, 74.03, 68.39, 63.75, 53.29, 22.76 (CH₃CO). HRMS calcd for C₂₈H₂₇N₂O₁₀ [M+H]⁺ 551.1660, found 551.1647.

  3.2.8   2-乙酰氨基-3, 6-二-O-苯甲酰基-2-脱氧-β-D半乳糖对硝基酚苷(8)的合成

  将6.4 g (11.6 mmol)化合物7溶于25 mL无水二氯甲烷和10 mL无水吡啶混合溶剂中, －15 ℃氮气保护下, 缓慢滴加20 mL二氯甲烷和5 mL三氟甲磺酸酐冷的混合溶液, －15 ℃反应1.5 h. TLC [V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝1:1]检测反应完全后, 反应体系经质量分数为5%的冰盐酸洗涤后, 用二氯甲烷萃取, 有机相经饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗涤后, 干燥浓缩得棕色泡沫状固体7.3 g, 直接进行下一步反应.

  将7.3 g (10.7 mmol)棕色泡沫状固体溶于40 mL干燥DMF中, 加7.4 g (107 mmol)亚硝酸钠, 0~25 ℃反应16 h. TLC [V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝1:1]检测反应完全后, 用二氯甲烷萃取, 有机相用水洗涤, 干燥浓缩得棕色固体化合物8的粗产物, 将化合物8的粗产物用无水乙醇重结晶得白色粉状固体8 (4.8 g), 将粗产物8重结晶后的滤液经柱层析[V(石油醚):V(乙酸乙酯):V(二氯甲烷)＝2:2:1]分离得0.5 g化合物8, 合并化合物8共5.3 g, 两步反应的总收率为82%. m.p. 232~234 ℃, [α]_D²⁵ 42.8 (c 0.5, DMSO)[文献值:^[31][α]_D²⁵ +39.4 (c 0.5, 丙酮)]; ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.10~7.90 (m, 7H, ArH, OH), 7.77~7.45 (m, 6H, ArH), 7.24~7.17 (m, 2H, ArH), 5.62 (d, J＝5.8 Hz, 1H, NH), 5.47 (d, J＝8.5 Hz, 1H, H-1), 5.07 (dd, J＝11.1, 3.0 Hz, 1H, H-3), 4.68~4.32 (m, 4H, H-2, H-5, H-6a, H-6b), 4.22 (dd, J＝6.2, 3.2 Hz, 1H, H-4), 1.72 (s, 3H, CH₃CO); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.77, 165.67, 165.57 (C＝O), 161.80, 142.01, 133.55, 133.34, 129.70, 129.53, 129.41, 128.79, 128.69, 125.66, 116.76 (ArC), 97.83, 74.51, 72.87, 65.07, 63.85, 48.89, 22.92 (CH₃CO). HRMS calcd for C₂₈H₂₇N₂O₁₀ [M+H]⁺ 551.1660, found 551.1648.

  3.2.9   2-乙酰氨基-3, 6-二-O-苯甲酰基-2-脱氧-4-O-三氟甲磺酰基-β-D-吡喃半乳糖对硝基酚苷(9)的合成

  将0.55 g (1.0 mmol)化合物8溶于6 mL无水二氯甲烷和2 mL无水吡啶混合溶剂中, －15 ℃氮气保护下, 逐滴滴加5 mL二氯甲烷和0.25 mL三氟甲磺酸酐的混合液, －15 ℃反应1.5 h. TLC [V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝1:1]检测反应完全后, 反应体系经质量分数5%的冰盐酸洗涤后, 用二氯甲烷萃取, 有机相经饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤, 干燥浓缩得棕色泡沫状固体0.62 g, 直接用于下一步反应.

  3.2.10   2-乙酰氨基-S-(2-乙酰氨基-3, 4, 6-三-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-3, 6-二-O-苯甲酰基-2-脱氧-4-硫代-β-吡喃葡萄糖对硝基酚苷(10)的合成

  参考文献[30, 36]方法制备.将0.363 g (1.0 mmol)的化合物2'溶于10 mL无水DMF中, 0 ℃下, 加入40 mg NaH(矿物油中60%的含量)反应10 min, 加入0.62 g (0.91 mmol)化合物9和1.0 g分子筛, 氮气保护下, 反应14 h. TLC [V(氯仿):V(乙醇)＝10:1]检测反应完全后, 将反应体系倒入含有饱和碳酸氢钠的冰水中, 生成浅黄色固体, 过滤, 将滤饼溶解在二氯甲烷和冰水的混合溶液中, 萃取得有机相, 有机相经无水硫酸钠干燥、浓缩后得浅黄色固体, 随后采用柱层析[V(氯仿):V(乙醇)＝30:1]方法分离得白色固体10 (210 mg), 产率为26%. m.p. 209~211 ℃, [α]_D²⁵ +5.2 (c 0.5, DMSO); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8.15~7.00 (m, 14H, ArH), 6.07 (t, J＝10.6 Hz, 1H, H-3), 5.90 (s, 1H, NHAc), 5.74 (d, J＝8.1 Hz, 1H, H-1), 5.59 (s, 1H, NHAc), 5.16~4.90 (m, 4H, H-1', H-3', H-4', H-6a), 4.70 (dd, J＝12.4, 6.6 Hz, H-6b), 4.44~3.68 (m, 6H, H-2, H-2', H-5, H-5', H-6'a, H-6'b), 3.11 (s, 1H, H-4), 2.04 (s, 3H), 2.01 (s, 2H), 2.00 (s, 2H), 1.93 (d, J＝7.7 Hz, 2H), 1.51 (s, 2H), 2.04 (s, 3H, OAc), 2.01 (s, 3H, OAc), 2.00 (s, 3H, OAc), 1.92 (s, 3H, NAc), 1.51 (s, 3H, NAc); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ: 170.56, 170.56, 170.08, 169.64, 168.93, 166.50, 165.60 (C＝O), 160.95, 142.53, 133.79, 133.15, 129.64, 129.40, 129.27, 128.44, 128.36, 128.20, 125.28, 116.43 (ArC), 96.82 (CH, C-1), 82.14 (CH, C-1'), 75.77, 74.20, 73.58, 68.72, 67.89 (CH, C-3, C-3', C-4', C-5, C-5'), 63.67, 62.08 (CH₂, C-6, C-6'), 56.83, 52.22 (2×CH, C-2, C-2'), 46.39 (CH, C-4), 23.03, 22.34, 20.34, 20.26, 20.24 (CH₃CO). HRMS calcd for C₄₂H₄₆N₃O₁₇S [M+H]⁺ 896.2548, found 896.2556.

  3.2.11   2-乙酰氨基-S-(2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖)-(1→4)-2-脱氧-4-硫代-β-D-吡喃葡萄糖对硝基酚苷(11)的合成

  将0.201 g (0.22 mmol)的化合物10溶于10 mL浓甲胺溶液中, 室温反应24 h. TLC [V(氯仿):V(乙醇)＝6:1]检测反应进行完全后, 减压抽滤得白色固体11 (0.102 g), 产率81%. m.p. 215~217 ℃, [α]_D²⁵+2.6 (c 0.5, DMSO); ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.31~8.18 (m, 2H, ArH), 7.93 (d, J＝8.8 Hz, 1H, NHAc), 7.83 (d, J＝9.2 Hz, 1H, NHAc), 7.24~7.13 (m, 2H, ArH), 5.23 (d, J＝8.5 Hz, 1H, H-1), 5.10 (d, J＝21.0 Hz, 3H, OH), 4.72 (d, J＝40.7 Hz, 2H, OH). 4.59 (d, J＝10.3 Hz, 1H, H-1'), 3.80 (dd, J＝18.1, 8.6 Hz, H-2, H-2', H-3, H-3', H-4', 5H), 3.68~3.10 (m, 6H, H-5, H-5', H-6a, H-6b, H-6a', H-6b'), 2.85 (dd, J＝14.7, 7.4 Hz, 1H, H-4), 1.86 (s, 6H, 2 NAc); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.52, 169.49 (C＝O), 162.32, 141.95, 125.88, 116.65 (ArC), 98.16 (CH, C-1), 82.75 (CH, C-1'), 80.95 (CH, C-5'), 77.29 (CH, C-5), 75.60 (CH, C-3'), 70.76 (CH, C-3), 70.76 (CH, C-4'), 61.85, 61.24 (CH₂, C-6, C-6'), 56.42, 55.23 (2×CH, C-2, C-2'), 47.52 (CH, C-4), 23.16 (Ac). HRMS calcd for C₂₂H₃₁N₃-O₁₂S [M+H]⁺ 562.1701, found 562.1709.

  3.3   pNP-TCB作为酶底物的性质研究

  将pNP-TCB, pNP-GlcNAc和pNP-(GlcNAc)₂溶于水配成5 mmol/L的底物贮备液; 将粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)几丁质酶(EC 3.2.1.14)和亚洲玉米螟β-N-乙酰己糖胺酶OfHex1 (EC 3.2.1.52)配成浓度为5 mU/mL的酶缓冲体系(pH 6.0).将底物和pH 6.0的柠檬酸-磷酸缓冲溶液和酶依次分别添加至96孔酶标板中, 在37 ℃条件下进行孵育一段时间, 用5 mmol/L的Na₂CO₃终止反应, 通过检测405 nm下的紫外吸收值来表征酶对底物的降解活性.为了避免化合物本身可能产生的紫外吸收, 进行对照实验.此部分实验参考文献[37, 38]方法进行.

  首先分别移取20, 40, 60, 80 μL的粘质沙雷氏菌几丁质酶(EC 3.2.1.14)溶液加入到酶标板中, 依次加入75, 55, 35, 15 μL的柠檬酸-磷酸缓冲溶液(pH 6.0), 然后分别加入5 μL浓度为5 mmol/L的pNP-TCB溶液, 对照组由5 μL底物和95 μL缓冲液(pH 6.0)组成, 在37 ℃下孵育30 min后加100 μL的Na₂CO₃ (0.5 mol/L)溶液终止反应, 用酶标仪在405 nm波长下进行紫外吸收值的测定.每个活性测定实验重复三次.

  3.4   pNP-TCB底物的专一性研究

  3.4.1   粘质沙雷氏菌几丁质酶(EC 3.2.1.14)对不同底物的降解活性

  首先在酶标板中加入45 μL的柠檬酸-磷酸缓冲溶液(pH 6.0), 然后依次分别加入5 μL的pNP-TCB、pNP-(GlcNAc)₂和pNP-GlcNAc, 最后分别加入50 μL的粘质沙雷氏菌几丁质酶溶液.对照组为相同底物浓度的柠檬酸-磷酸缓冲溶液(pH 6.0).在37 ℃条件下孵育1 h后, 加100 μL的Na₂CO₃ (0.5 mol/L)溶液终止反应, 用酶标仪在405 nm波长下测定相应的紫外吸收值.每个活性测定实验重复三次.

  3.4.2   亚洲玉米螟OfHex1酶(EC 3.2.1.52)对不同底物的降解活性

  本实验所用的实验方法与3.4.1节中的实验方法一致.

  辅助材料(Supporting Information)   化合物2的¹H NMR, ¹³C NMR谱图, 化合物2', 3~11的¹H NMR, ¹³C NMR和HRMS谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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  图式 1  4-硝基苯基N, N'-二乙酰基-4-硫基-β-壳二糖苷(pNP- TCB)的设计思路

  Scheme 1  Design of p-nitrophenyl N, N'-diacetyl-4-thio-β- chitobioside (pNP-TCB)

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  图式 2  化合物2'的合成路线

  Scheme 2  Synthetic route of compound 2'

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  图式 3  化合物6的合成路线

  Scheme 3  Synthetic route of compound 6

  Reagent and conditions: (i) AcCl; (ii) K₂CO₃, acetone, 4-nitrophenol, reflux; (iii) CH₃OH, CH₃NH₂; (iv) DMF, 2, 2-dimethoxypropane, 4-TsOH; (v) pyridine, benzoyl chloride, 0 ℃; (vi) AcOH, H₂O, reflux

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  图式 4  化合物11的合成路线

  Scheme 4  Synthetic route of compound 11

  Reagent and conditions: (ⅶ) CH₂Cl₂, pyridine, benzoyl cyanide; (ⅷ) CH₂Cl₂, pyridine, Tf₂O, －10 ℃; (ⅸ) DMF, NaNO₂; (ⅹ) CH₂Cl₂, pyridine, Tf₂O; (ⅺ) sodium hydride, DMF or cysteamine, dithioerythritol (DTE), DMF; (ⅻ) CH₃OH, CH₃NH₂

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  图 1  不同浓度粘质沙雷氏菌几丁质酶(EC 3.2.1.14)对pNP- TCB底物的降解作用

  Figure 1  Degradation of pNP-TCB substrate by different concentrations of chitinase from Serratia marcescens

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  图 2  粘质沙雷氏菌几丁质酶(EC 3.2.1.14)对不同底物的降解作用

  Figure 2  Dgradation of different substrates by chitinase from Serratia marcescens

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  图 3  亚洲玉米螟OfHex1酶(EC 3.2.1.52)对不同底物的降解作用

  Figure 3  Degradation of different substrates by the OfHex1 from Ostrinia furnacali

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  表 1  酰化反应区域选择性特征峰化学位移

  Table 1.  Feature chemical shift of regioselective acylation reactions

  δ	3	6	7
  δH-3	3.74	5.22	5.33
  δH-6a, H-6b	3.37~3.15 (2H)	3.67~3.48 (2H)	4.64~4.44 (2H)

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